Introduction
헤테로 사이클 (즉, 1,2- azaborines)를 포함하는 붕소 - 질소는 최근 아렌의 isosteres로 크게 주목 받고있다. 이 isosterism 화학 공간 2, 3, 4를 확장 기존 구조 모티프의 다변화로 이어질 수있다. Azaborines 특히 화학자 라이브러리 구조적 기능적으로 중요한 분자의 합성을 수행하는 의약 화학 분야에서 생물 의학 연구 5, 6, 7, 8에서의 응용 가능성 유용성을 갖는다. 현저하게, 그러나 동시에 사용할 아렌 - 함유 분자에 다수의 잘 개발 된 합성 경로가, azaborines의 합성 방법에 한정 수가보고되었다 (9), (10) 11, 12, 13입니다. 이는 합성 순서의 초기 단계에서의 붕소 원과 공기와 분자의 습기 민감성 옵션의 수가 제한을 주로한다.
이 문서의 첫 부분에서, 우리는 (3)의 표준 공기없는 기술을 사용하여 N -TBS- B -Cl -1,2- azaborine의 멀티 그램 규모의 합성을 설명한다. 이 화합물은 더 이상의 구조적으로 복잡한 분자 (14) (15)에 작용 화 될 수있는 다목적 중간체로서 작용한다. 3부터 단백질 결합 연구에 사용하기위한 N -H- B의 에틸 -1,2- azaborine (5)의 합성 및 정제를 설명한다. (5)의 변동성으로 인해 효율적인 분리는 반응 온도, 시간, DIST의 정밀한 제어를 필요추리 조건.
두 번째 부분에서, 단백질 발현 및 T4 라이소자임 돌연변이 (L99A 및 L99A / M102Q) (17), (18, 19)의 분리를위한 프로토콜은 20 단백질 결정화 단백질 - 리간드 결정 복합체의 제조 다음으로 제시한다. T4 라이소자임 돌연변이 L99A 및 L99A / M102Q는 NH가 azaborine 분자 (17)를 함유 한 수소 결합 능력을 조사하는 생물학적 시스템 모델로 선택했다. 표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 단백질을 대장균 RR1 균주에서 발현 및 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)에 유도된다. 단백질 정제는 이온 교환 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 수행된다. 단백질 결정화 매달려 사용 (겔 전기 영동으로> 95 % 순도) 정제 된 단백질의 고농도 용액으로 수행증기 확산 방법을 놓습니다. 때문에 산소 본 연구의 리간드의 민감성, 단백질 - 리간드 복합체는 공기가없는 조건에서 제조된다.
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Protocol
주 : 모든 산소 및 습기에 민감한 조작 표준 공기없는 기술 또는 글로브 박스를 이용하여 불활성 분위기 (N 2)에 따라 수행 하였다. THF (테트라 히드로 푸란), 등이 O (디 에틸 에테르)을 CH2Cl2 (디클로로 메탄), 톨루엔, 펜탄 아르곤 하에서 중성 알루미나 칼럼을 통과시킴으로써 정제 하였다. 아세토 니트릴이 CAH (칼슘 하이드 라이드)상에서 건조시키고, 사용하기 전에 질소 대기하에 증류 제거 하였다. PD / C (탄소상의 팔라듐)을 사용하기 전에 12 시간 동안 100 ℃에서 고진공 하에서 가열 하였다. 실리카 겔 (230-400 메쉬)을 고진공하에 180 ℃에서 12 시간 동안 건조시켰다. 플래시 크로마토 그래피는 불활성 대기하에이 실리카겔을 수행 하였다. 다른 모든 화학 물질과 용매를 구입하여 받아 사용 하였다.
참고 :주의, 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하시기 바랍니다. 합성 (A)에 사용 된 화학 물질 중 일부급성 독성 및 발암 다시.
1,2- Azaborines 1. 준비
참고 : 본 연구의 모든 화합물의 특성 데이터가 이전 (16), 12 (13)이보고되었다.
그림 1 : 1,2-azaborines의 합성 방식. 각 화합물 (1-5)의 합성과 상세한 프로토콜은 프로토콜 절에서 설명된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- N의 제조 N -TBS- B 알릴 클로라이드의 부가 물을 알릴 (1)
- 글러브 박스에서, 밖으로 6.70 g (50.0 mmol)을 triallylbora을 측정오븐 건조 24/40 1 L 둥근 바닥 플라스크에 (NE) (22)는 교반 바가 장착 된 250 mL의 디클로로 메탄을 추가한다. 고무 격막과 플라스크를 밀봉합니다. 상자 밖에서, 용액의 온도를 -78 ° C 진공 가스 매니 폴드에 질소 분위기 하에서.
- 정맥 전달을 통해 -78 ℃에서 triallylborane 솔루션 헥산에 1.00 M 삼염화 붕소 용액 (100 mmol)을 100 mL에 추가합니다. 4 시간 동안이 온도에서 반응 혼합물을 교반하자.
참고 :주의, 삼염화 붕소가 물과 반응성이 매우 높은 것입니다. - (t의 -butyldimethylsilyl) - - 별도의 100 mL의 플라스크에, 25.7 g의 N을 측정 N -allylamine (150 mmol) 및 20.0 mL의 디클로로 메탄을 추가합니다. 1 L의 반응 플라스크에 -78 ℃에서 상기 반응 온도를 유지하면서 캐 뉼러를 통해 전송이 용액을 추가한다.
- 반응에 21.0 mL의 트리 에틸 아민 (150 밀리몰)를 추가합니다. 질소의 긍정적 인 흐름하에 교반 유지하고 점차 따뜻한 RO 할 수 있도록톰 온도 하룻밤.
- 교반을 18 시간 후, 액체 질소 트랩 고진공 (300~500 mTorr 이하)을 사용하여 진공 가스 매니 폴드를 통해 용매의 약 절반을 제거한다.
- 글러브 박스로 반응 플라스크에 취하여 교반 가진 24/40 진공 어댑터가 장착 된 오븐 건조 된 중간 다공성 프릿 및 24/40 500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크를 통해 반응 혼합물에 형성된 백색 염을 걸러 바. 남아있는 모든 자료를 전송하는 디클로로 메탄을 사용합니다.
- 높은 진공 진공 가스 매니 폴드를 사용하여 상자 외부 여과 액에서 남아있는 모든 휘발성 물질을 제거합니다.
- 글러브 박스에서, 증류 제조 교반 막대가있는 오븐 - 건조 된 100 mL의 14/20으로 둥근 바닥 플라스크에 농축 된 반응 혼합물을 옮긴다. 격막과 플라스크 캡.
- 질소 흐름 하에서 신속 격벽을 열고 건조제로서 200 mg의 칼슘 하이드 라이드를 추가한다.
- oven- 피팅에 의해 증류 장치를 설정온도계를 부착 14/20 증류 헤드, 수신 14/20 50 ㎖ 공기 무료 저장 플라스크 한쪽 조 생성물을 함유하는 100 ㎖의 플라스크와 다른 쪽을 건조시켰다. 냉수와 증류 헤드를 장착. (증류 장치의 모든 관절에 대한 그리스를 사용합니다.)
참고 :이 제품은 증기 온도가 300 mTorr로 60 °의 C에 도달하면 증류하기 시작합니다. - 증류 헤드 온도계 75 °의 C를 판독 할 때까지 오일 배스의 온도를 상승시켜 제품을 계속 수집.
참고 :이 제품은 투명한 무색 액체이다. - 열원을 제거하여 증류를 중지하고 저장 전에 실온으로 냉각 장치. 냉각 후, 질소 장치를 재 가압 단단히 공기의 무료 저장 용량 플라스크에 플러그 밸브를 닫습니다. 글러브 박스 냉동고에 고립 된 제품을 보관하십시오.
주 : 수율은 65 %에서 84 %로 다양 할 수있다.
- N의 제조 B -Cl 링 폐쇄 제품 (2)
- 글러브 박스에서, 교반 막대와 오븐 건조 24/40 1 L 둥근 바닥 플라스크에 밖으로 56.0 g N 알릴 N -TBS- B 알릴 염화 부가 물 (1) (217 밀리몰)을 측정하고 500을 추가 ML의 톨루엔.
- 밖으로 1.79 g 그럽 1 차 세대 촉매 (2.17 밀리몰)을 측정한다.
- 부 - 방향 글로브 박스 내에서, 실온에서의 교반 한 용액에 촉매를 추가한다. 반응으로부터 형성된 에틸렌 가스를 제거하기 위해 첨가하는 동안 박스를 제거.
주 : 반응 가스 방출의 중단의 30 분 내에서 일반적으로 완료되었습니다. 완료의 또 다른 지표로서, 반응의 색상이 완전히 갈색 초기 보라색에서 변경된다. 이 시점에서, 생성물을 진공 증류를 이용하여 분리 할 수있다; 자세한 내용은 참조 (12)를 참조하십시오. 이 프로토콜에서, (3)의 직접 합성 한 포트, 두 단계의 절차를 설명한다. - N -TBS- B -Cl -1,2- azaborine의 제조 (3)
- 톨루엔 고리 폐쇄 생성물 (2)의 반응 용액에 탄소 (10 중량 %의 Pd, 13.2 mmol)을 14.0 g의 팔라듐을 추가한다.
- 박스에서 제거하고 플라스크를 질소 치환하고 냉수 장착 된 오븐 건조 24/40 환류 응축기를 장착한다.
- 교반하면서 135 ℃에서 격렬하게 환류 오일 배스를 이용하여 반응을 가열한다.
- 16 시간 동안 환류하에 유지 한 후, 오일 욕으로부터 플라스크를 제거하여 반응을 냉각. 실온으로 냉각 한 후, 오븐 건조 루어 로크 바늘이 장착 된 주사기를 이용하여 반응 혼합물로부터 0.5 mL의 분취 량을 회수. 11 B NMR (12)를 통해 분석하는 나사 탑 NMR 튜브에 0.5 ML의 나누어지는을 전송합니다.
주 : 원하는 제품 피크가 약에 나타납니다 35.5 ppm으로 12 일 시작 이잖아요 동안IAL 피크는 캘리포니아에 나타납니다. 42.9 ppm으로 12. 보통이 시점 (11)에서 B NMR은 반응이 작은 출발 물질의 피크가 남은, 불완전 나타냅니다. - 반응이 완료되지 않으면, 글로브 박스로 반응 플라스크를 가지고 탄소 (10 중량 %의 Pd, 2.82 밀리몰)을 추가로 3.00 g의 팔라듐을 추가한다.
- 1.3.2 및 1.3.3에 기재된 것과 같은 조건을 환류 반응 Resubject.
- 환류하에 추가로 24 시간 후, 11 B NMR에 의한 반응의 또 다른 분취 액을 분석한다. 이 시점에서 반응이 완료되어야한다.
- 글러브 박스에 반응 플라스크로 이동시켜 종이 냅킨 충전 한 일회용 플래시 크로마토 그래피 칼럼을 통해 반응 혼합물을 전달한다. 톨루엔 50.0 mL로 세척하여 여과 액을 수집합니다.
- 고진공가 장착 된 진공 가스 매니 폴드에있는 상자 외부 여과 액에서 모든 휘발성 물질을 제거합니다.
참고 : 휘발성 물질의 제거는 40 분 t 걸릴 수 있습니다O 90 분의 진공 압력에 따라. 진공 게이지가 최대 압력을 판독 할 때, 용매의 제거가 완료되었음을 나타낸다. 용매를 제거하는 동안, 플라스크 아래에있는 수조는 열 방출을 실온에서 남아 있는지 확인하십시오. - 글러브 박스에서, 교반 막대가있는 오븐 - 건조 된 250 mL의 24/40으로 둥근 바닥 플라스크에 농축 된 반응 혼합물을 옮긴다. 격막과 플라스크 캡.
- 신속 격벽을 제거하고 건조제로서 200 mg의 칼슘 하이드 라이드를 추가한다.
- 온도계 부착 된 오븐 건조 24/40 증류 머리, 수신 24/40 100 mL의 공기 무료 저장 용량 플라스크 조 생성물을 포함하는 100 mL의 플라스크와 다른면 한면을 맞춤으로써 증류 장치를 설정합니다. 냉수와 증류 헤드를 장착. 증류 장치의 모든 관절에 대한 그리스를 사용합니다.
참고 :이 제품은 증기 온도가 오일과 1000 mTorr의 65 ~ 70 ° C에 도달하면 증류하기 시작90-100 °에 C 사이의 목욕 온도. 생성물은 투명한 무색 액체이다. - 열원을 제거하여 증류를 중지하고 저장 전에 실온으로 냉각 장치. 냉각 후, 질소 장치를 재 가압 단단히 공기의 무료 저장 용량 플라스크에 플러그 밸브를 닫습니다. -30 ° C에서 글로브 박스 냉동기에서 단리 된 생성물을 저장한다.
참고 : 하나의 냄비, 두 단계의 절차의 수율은 52 %이다.
그림 2 : N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine의 모니터링 형성을위한 11 B의 NMR 스펙트럼 (3). A) N 알릴 N -TBS-B-알릴 클로라이드 부가 물 (1), 고리 폐쇄 복분해를위한 출발 물질. 16 시간 후 B) 산화. (미 반응 N -TBS- B -Cl 링 폐쇄 제품 (추가 24 시간 후, 2) 및 (3)이 도시되어 N-TBS-B-CL -1,2- azaborine 함께 이성체 B의 비닐 고리 폐쇄 생성물 (2 ')). C) 산화. 진공 증류에 의해 정제 한 후 D) 단리 된 생성물 (3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.- N -H- B -OBu -1,2- azaborine의 제조 (4)
- 글러브 박스에서, 4.00 g N- 아웃 TBS -B- CL -1,2- azaborine 측정 (3) 교반 막대와 오븐 건조 된 100 mL의 둥근 바닥 플라스크 (17.6 mmol)을 35 mL의 아세토 니트릴을 추가합니다. 밖으로 1.14 g 아세트 아미드 (19.3 밀리몰)을 측정하고 반응 플라스크에 전송할 수 있습니다. 고무 격막과 플라스크를 밀봉합니다.
- 상자에서 반응 플라스크를 제거하고 오와 맞질소 치환 및 냉수를 구비 한 24/40 환류 응축기 VEN 건조.
- 교반하면서 오일 배스에서 85 ℃에서 환류 반응을 가열한다.
- 환류하에 3 시간 후, 오일 욕으로부터 플라스크를 제거하여 반응을 냉각. 실온으로 냉각 한 후, 고 진공 장착 된 진공 가스 매니 폴드에서 용매를 제거한다.
- 진공하에 휘발 물을 제거한 후, 15.0 mL의 THF에 반응 잔사를 재용. 이 용액에 n 개의 부탄올 (35.1 밀리몰)의 3.21 mL를 넣고.
- 실온에서 1 시간 동안 반응물을 교반한다.
- 조 생성물을 얻었다 고 진공 장착 된 진공 가스 매니 폴드에서 용매를 제거한다.
- (1 5)을 용리액으로서 글로브 박스 내에서, 펜탄 및 디 에틸 에테르의 혼합물을 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토 그래피를 통해 생성물을 분리. 로서 순수한 생성물을 얻었다 고 진공 장착 된 진공 가스 매니 폴드를 사용하여 생성물 - 함유 분획으로부터 휘발성 물질을 제거백색 고체.
주 : 수율은 82 %에서 87 %로 다양 할 수있다.
- N -H- B의 에틸 -1,2- azaborine의 제조 (5)
- 글러브 박스에서, 교반 막대가있는 오븐 - 건조 된 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 1.00 g N- H -B- OBU -1,2- azaborine (4) (6.62 밀리몰) 밖으로 측정하고 추가 25 ㎖이 잇 O. 인감 진공 가스 매니 폴드에 N이 아래에 고무 격막 및 장소 플라스크.
- 별도의 오븐 - 건조 된 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에서, 질소 분위기 하에서 에틸 리튬 용액 (벤젠 / 사이클로 헥산 0.5 M, 13.2 mmol)을 26.5 mL를 첨가. 원하는 azaborine 제품을 분리 문제를 방지하기 위해 에틸 리튬 시약에서 용제 (벤젠 / 시클로 헥산)의 혼합물을 제거합니다. 13.0 mL의 잇 2 O.에서 고체 에틸 리튬을 재용
참고 :주의 : 유기 리튬 시약은 자연 발화성 (공기 또는 물과의 접촉에 발화성)입니다. 원하는 생성물 (5 - 냉각 욕 4 -30 °의 C를 함유하는 반응 플라스크를 냉각.
- -30 ℃에서 캐 뉼러를 통하여 전달 반응 플라스크에 에틸 리튬 용액을 추가한다. 이 온도에서 1 시간 동안 교반하면서 유지하고, 실온으로 그것에는 서서히 가온 허용한다.
- 11 B NMR로 반응을 모니터링합니다. (원하는 중간 피크는 약 39.8 ppm으로 나타납니다.)
- 반응이 완료되면, -30 ° C에 대한 반응을 냉각하고 6.62 mL의 HCl 용액 (ET 2 O 2.0 M, 13.2 밀리몰)를 추가합니다. 실온으로 그것에는 서서히 가온시키면서 1 시간 동안 반응물을 교반한다.
- 조 생성물 혼합물을 얻기 위해 저 진공 (20-25 토르)가 장착 된 진공 가스 매니 폴드에서 용매를 제거한다.
- 글로브 박스 내에서,용리액으로서 2- 메틸 부탄을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피를 통하여 생성물을 분리. 무색 액체로서 순수한 생성물을 수득 약독 진공 장착 된 진공 가스 매니 폴드의 휘발성을 제거한다.
주 : 수율은 56 %이다.
2. 단백질 준비 및 T4 리소자임 돌연변이의 결정화
- 단백질 발현 및 정제
- 서브 클로닝 된 플라스미드 (L99A 또는 L99A / M102Q) 200 ㎖ LB 17, 20 (원성 국물) 12 시간 동안 37 ℃에서 40.0 mg을 암피실린로 보충 미디어로 형질 전환 된 대장균 RR1 세포를 성장.
주 : LB 배지의 조성은 12g의 트립 톤, 5g의 효모 추출물, 10g 염화나트륨 1 LH 2 O. 당 1g의 글루코스 - 밤새 문화의 160 mL로 (800 mg을 암피실린로 보충) 4.00 L LB 배지에 접종하고 filtere 240 rpm에서 37 ° C에서 부화D 공기 공급.
- 광학 밀도는 600 nm에서 0.7에 도달 할 때, 인큐베이터에서 제거하여 실온까지 냉각 세균 배양.
- 원뿔형 원심 분리 튜브에 이소 프로필 β-D-1-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG) (0.7 mm의 최종 농도)의 695 밀리그램을 측정하고 용해 4 mL의 LB 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 단백질 발현을 유도하기 위하여 배양하여 IPTG 용액을 추가한다. 25 ° C에서 21 시간 동안 110 rpm에서 문화를 품어.
- 4 ℃에서 30 분 동안 4,412 XG에 문화를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 0.1 M 인산 나트륨 (PH 6.6), 0.2 M NaCl을 300 mL에 펠렛을 재현 탁 0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (PH 8.0)의 30.0 mL를 넣어. 4 ℃에서 17 시간 동안 정지를 저어.
- 데 옥시 리보 뉴 클레아 현탁액에 1.0 M의 MgCl 2 및 0.500 mL의 I (DNase를 I) 30.0 mL를 넣고 8 시간 동안 실온에서 교반 하였다.
- 4에서 30 분 동안 30,913 XG에서 분해 된 세포 현탁액을 원심 76; C. 발현 된 단백질을 포함하는 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다.
- 4 ° C에서 하룻밤 (L99A / M102Q에 대한 L99A에 대한 산도 6.5의 pH 6.3) 20 mM의 인산 나트륨에 대한 해물을 투석.
- 세척과 열의 평형 완충액 (50 mM 트리스, 1 mM의 EDTA (PH 7.3))와 카르복시 메틸 이온 교환 비즈의 20.0 mL로 평형. 구슬에 솔루션을 포함하는 단백질을로드하고 평형 완충액 100 mL로 열을 씻는다. 평형 버퍼에서 300 mM의 염화나트륨 600 mL의 선형 구배와 열을 용출.
- 컬럼 정제 저압 크로마토 그래피 시스템을 사용한다. 1 mL / 분의 속도로 펌프를 사용하여 10 ㎖의 분획을 수집한다. 순수한 단백질을 함유하는 분획을 수집한다.
주 : 용출 중에 단백질의 존재를 확인하기 위해 280 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 모니터링한다. SDS-PAGE에 의해 각 부분의 순도를 결정하고 오직 순수한 분획을 수집합니다.
- 서브 클로닝 된 플라스미드 (L99A 또는 L99A / M102Q) 200 ㎖ LB 17, 20 (원성 국물) 12 시간 동안 37 ℃에서 40.0 mg을 암피실린로 보충 미디어로 형질 전환 된 대장균 RR1 세포를 성장.
그림 3 : T4의 라이소자임 돌연변이 L99A / M102Q의 단백질 정제를위한 대표 결과. A) 크로마토 그램)는 MS / cm (레드 라인에서 280 나노 미터 (파란 선)과 전도성에 AU에서 측정 된 UV 흡광도를 나타내는. 분획 20-23을 합하고 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정 하였다. B) 18.6 kDa의 20-23에서 분획의 정제 된 단백질의 존재를 나타내는 15 % SDS-PAGE 겔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.- 단백질의 결정화
- 투석막 튜브 (12,000 MWCO 14,000)에 정제 된 단백질 용액을 전송. 100mM의 인산 나트륨, 550 mM의 염화나트륨, 0.02 % NaN3가 (L 용 L99A위한 pH가 6.5 및 6.3의 pH 4.00 L를 넣은 비커에 넣고, 투석 튜브 배치99A / M102). 4 ℃에서 하룻밤 4 L 솔루션을 저어.
- 투석 샘플을 2- 머 캅토 에탄올 (최종 농도 5 mM)를 첨가하고 ~ 40.0 mg의 / ml의 원심 농축기 (10,000 MWCO)를 사용하여 농축시킨다. 280 nm에서 흡수를 측정함으로써 단백질 농도를 결정한다. 결정하기 전에 회전시켜 어떤 침전물을 제거합니다.
- 단백질 결정화에 대한 증기 확산 매달려 드롭 방법을 사용합니다. 실리콘 처리 된 유리 커버 슬라이드에 저장 용액 (2.0 내지 2.2 M 나트륨 / 인산 칼륨, pH가 6.7-7.1, 50 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 50 mM의 2- 히드 록시 에틸 디술 피드)의 5.00 μL로 농축 된 단백질 용액을 5.00 μL를 혼합한다.
- 각 웰 함유 용액 저장조의 상부에 거꾸로 상기 커버 슬라이드를 배치하여 저장 용액 1.00 mL의 혼합물에 대해 드롭 평형. 단단히 슬라이드 잘 각각 밀봉 그리스를 사용합니다. 2.2.3에 언급 된 저장 솔루션을 24 웰 플레이트를 사용하여 다양한 조건을 설정합니다.결정 성장을위한 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
참고 : 크리스탈 일반적으로 커버 슬라이드의 평형 버퍼 1-2 주 내에 성장한다. 단계 2.2.3의 저장 용액으로 단백질 용액을 혼합시 즉시 강수량은 결정화의 실패를 나타냅니다.
그림 4 : 리간드 복합체하기 전에 T4의 라이소자임 돌연변이 L99A의 결정의 대표 사진. 결정을 모액에 (2.1 M 나트륨 / 인산 칼륨, pH가 6.9, 50 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 50 mM의 2- 히드 록시 에틸 디술 피드). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.- 복잡한 준비
- 루프에 모양의 극저온 튜브를 사용하여 결정을 선택 (재료 목록 참조)0.6 ML의 microcentrifuge 관에 배치합니다. 건조를 방지하고 결정을 유지하기 위해 튜브에 모액의 50.0 μL를 추가합니다.
주 : 단결정 선택은 현미경을 사용하여 도움을 받는다. - 글러브 박스로 결정을 함유하는 튜브를 옮긴다. 튜브의 스냅 캡 내부의 azaborine 리간드 (5)과 장소의 5.00 μL를 가져 가라. 모자 및 증기 확산에 의해 평형 2-7 일간 글로브 박스 내부 냉장고 (4 ℃)에서 튜브를 저장합니다.
주 : azaborine 리간드 (5)의 물성 (수용액에서 높은 변동성 용해도) 증기 확산 방법을 통하여 예비 성형 단백질 결정과 복합화 할 수있다. - 종래의 액체 질소 동결 플래시에 N-paratone의 방울을 함유하는 유리 슬라이드에 루프 형상의 저온 관을 사용하여 결정을 옮긴다. 결정에 급락하여 N-paratone 빠르게 플래시 동결로 보호 결정을 선택액체 질소를 함유하는 듀어에 루프. 극저온 통을 사용하여 루프에 대한 결정을 탑재합니다.
- 싱크로트론 방사선을 이용한 단결정의 데이터 세트를 수집한다. 게시 된 구조 (20), (24)는 사용하여 분자 교체를 수행; 전자 밀도의 취소 모델링 방울에 의해 단백질 결합 부위 내부 리간드의 존재를 확인합니다.
- 루프에 모양의 극저온 튜브를 사용하여 결정을 선택 (재료 목록 참조)0.6 ML의 microcentrifuge 관에 배치합니다. 건조를 방지하고 결정을 유지하기 위해 튜브에 모액의 50.0 μL를 추가합니다.
그림 5 : 전자 밀도와 포켓을 결합 T4의 라이소자임 돌연변이 L99A의 원자 모델. 결합 부위에서 않은 모델로 전자 밀도 덩어리와 함께 A) L99A 공동. B)이 대안 이형태의 모델 azaborine 리간드 5 L99A 공동. 카스티하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK.
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Representative Results
1,2-azaborines에 대한 개략적 인 합성 경로는 그림 1과 같다. 이 프로토콜은 다섯 가지 붕소 - 질소 함유 분자의 합성에 적용됩니다. 도 2는 목적하는 생성물 (3)의 형성을 모니터링하는 단계 130의 과정 동안 측정 된 11 B NMR 스펙트럼을 나타낸다. 단백질 정제는 저압 크로마토 그래피 시스템 및 대표적인 크로마토 그램은도 3에 도시를 사용하여 수행 하였다. 수집 된 분획의 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정 하였다. T4 라이소자임 돌연변이 L99A의 결정도 4에 도시된다. 그림 5는 않은 모델로 전자 밀도와 결합 리간드 5 정제 후 바인딩 공동으로 L99A 바인딩 주머니를 보여줍니다.
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Discussion
이 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 이전에보고 된 방법 (12, 13)에 기초하여 1,2- azaborines의 변형 합성을 설명했다. Triallylborane 22 제조 allyltriphenyl 주석 칼륨 allyltrifluoroborate를 사용 경로에 대한 대체물로서 사용 하였다 N 알릴 N -TBS- B 알릴 클로라이드의 부가 물 (1). 이 방법은 더 많은 원자를 경제적이고 환경 친화적 인 접근을 허용한다. N -TBS- B -Cl -1,2- azaborine (3)의 합성에 대해, 한 포트, 두 단계의 순서 (산화이어서 복분해 폐쇄 링)은 이전보다 더 높은 절연 수율로 이어지는 채용했다 중간체 (2) (52 % 대 2 단계에 걸쳐 29 %)의 분리를 포함하는 방법. (단, 부가 물 (1)의 순도에 따라 폐환 생성물 분리 전에 산화 공정진공 증류를 이용해야 할 수도 있습니다. 이 때, 톨루엔 대신에, 용매로서 디클로로 메탄을 사용하여 이것에서 사용의 Pd / C의 총 양의 감소를 산화 공정에서 휘발 제거 전에 증류.) 11 B NMR 모니터링 (도 2)에 대해서도 효과를 시간을 단축 반응 (15 몰 % 대 7 몰 %).
N -H- B의 에틸 -1,2- azaborine (5)의 합성 크롬 착체의 사용을 필요로하는 이전에보고 된 다단계 시퀀스 (16)의 대신에 에틸 리튬을 사용하는 4의 두 단계로 수행 하였다. 아이솔레이션 의한 생성물의 휘발성 정확한 온도 제어 및 감쇠 진공 조작이 필요했다. 이 프로토콜에서 제시된 방법 또는 다른 휘발성 화합물의 정제에 적용될 수있다.
두 번째 부분에서 우리는 단백질 정제 및 크리스탈 착물을 보여 주었다T4의 라이소자임 돌연변이 L99A 및 L99A / M102Q의. 목적 단백질의 화학적 세포 용해 분리 수득 하였다 E. 콜라이 균주 RR1 및 IPTG를 사용하여 유도 표준 단백질 발현. 이는 각 단계의 성공 여부를 확인하거나 실패 프로세스를 식별하는 단백질 발현 및 세포 용해 후 SDS-PAGE를 실행하도록 의뢰한다. L99A의 T4 라이소자임 들어, 발현 된 단백질은 박테리아 세포를 용균 인해 그 액티비티 상등액과 펠렛 모두에서 발견 될 수있다. 이 경우, 상청액 단백질은 20 mM 인산 나트륨 완충액에 대해 투석 될 수 있고, 칼럼 정제 용 세포 용해 용 해물로부터 결합. 유도 조건 (37 ℃에서 2 ~ 3 시간으로 21 시간 내지 25 ℃) 높은 온도 및 더 짧은 시간으로 조정할 수있다. 세포 용해는 과열을 방지 빙욕에 초음파를 사용하여 수행 될 수있다. 300 mM의 염화나트륨의 선형 구배 카르복시 이온 교환 컬럼을 단백질 정제에 사용 하였다. 만> 95 % 순수한 (S를 기반으로DS-PAGE) 단백질 분획을 수집하고, 단백질 결정화에 사용 하였다.
단백질 용액을 농축하기 전에, 투석 단백질 2- 메르 캅토 에탄올 (최종 농도 5 mM) (단계 2.2.2)의 첨가는 특히 높은에서 쉽게 침전되는 경향 L99A / M102Q 단백질에 대해, 그 자연 침전을 방지 할 필요가 있었다 집중. 5 단백질 복합체는 공기가없는 분위기를 필요에 따라, 단백질 - 리간드 복합체를 글로브 박스에서 제조 하였다. 캐비티 bearingT4 라이소자임 돌연변이 :이 프로토콜에서 제조 된 물질은 생물학적 모델 시스템에서 1,2- azaborines의 결합 연구에 사용 하였다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
References
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