Summary
Il protocollo seguente descrive la metodologia per: microplastiche campionamento sulla superficie del mare, la separazione di identificazione microplastic e chimica delle particelle. Questo protocollo è in linea con le raccomandazioni per il monitoraggio microplastiche pubblicati dal sottogruppo tecnico MSFD su rifiuti marini.
Protocol
1. Il campionamento delle microplastiche sulla superficie del mare
- Distribuire la rete manta dal lato della nave che utilizza un boom spinnaker o «» A-frame utilizzando linee e moschettoni.
- Distribuire la rete manta fuori della zona di scia (circa 3 -. 4 m di distanza dalla barca) per impedire la raccolta dell'acqua influenzata dalla turbolenza all'interno della zona scia.
- Annotare le coordinate GPS iniziali e tempo iniziale nella scheda tecnica.
- Inizia a muoversi in una direzione rettilinea con una velocità di circa. 2 - 3 nodi per 30 min e iniziare la misura del tempo.
- Dopo 30 min fermare la barca e scrivere coordinate finali GPS, la lunghezza del percorso (il modo più corretto è quello di calcolare la lunghezza dal coordinate GPS) e la velocità media dell'imbarcazione nel foglio fornito e sollevare la rete manta su l'acqua.
- Risciacquare rete manta accuratamente dall'esterno della rete con acqua di mare con una pompa sommersa o acqua dai wa barcaserbatoio ter. Risciacquare nella direzione dalla bocca manta al fine di merluzzo per concentrare tutte le particelle aderito alla rete nel sacco.
Nota: Non risciacquare il campione attraverso l'apertura della rete al fine di prevenire la contaminazione. - Rimozione sicura fine merluzzo e selezionare il campione nel sacco finale attraverso un 300 micron dimensioni delle maglie del setaccio o meno.
- Risciacquare del sacco accuratamente dall'esterno e versare il resto del campione attraverso il setaccio. Ripetere questo passaggio fino a quando non ci sono più le particelle all'interno del sacco.
- Concentrare tutto il materiale sul setaccio in una parte del setaccio.
- Con l'uso di un imbuto, risciacquare il setaccio in un barattolo di vetro o bottiglia di plastica usando il 70% di etanolo.
- Chiudere la bottiglia, pulirlo con carta assorbente e etichettare il coperchio e al di fuori del vaso con il nome del campione e data con pennarello indelebile (si dovrebbe anche mettere una seconda etichetta scritta con una matita su carta velo in un barattolo per evitare la perdita possibile diil nome del campione a causa all'etichetta cancellato sul vaso). Trasferire bottiglia di plastica con l'etichetta nella casella di fresco.
Nota alle condizioni generali di campionamento: La velocità del vento non dovrebbe essere più di 2 Beaufort, poiché le onde sono troppo elevati e la rete non è stabile sulla superficie del mare. È importante mantenere un andamento lineare costante a velocità costante durante le reti da traino. La metà della luce netta manta deve essere sommersa durante il campionamento. Durata del campione dovrebbe essere di 30 min (nei casi in cui vi è una grande quantità di materiale naturale, ad esempio plancton, la durata del campionamento può essere più breve). Evitare l'uso di strumenti di plastica e contenitori. Evitare indumenti sintetici (ad esempio pile), corde e il contatto di rete manta a vaso per prevenire la contaminazione del campione. Fare molta attenzione a non danneggiare la rete manta o lo scafo della barca durante la distribuzione e l'acquisizione in rete.
2. Separazione dei microplastiche dai campioni superficiali del mare
- Se il campione non contienetutti gli elementi più grandi di 25 mm e sembra essere pulito, continuare direttamente con il punto 3.
- Versare campione attraverso la (maglia micron ≤300) setaccio e rimuovere tutti gli oggetti per i rifiuti naturali o artificiali di dimensioni> 5 mm (macro e mezzo lettiera) dal campione, con identificazione visiva e pinzette. Fare attenzione a lavare accuratamente ogni oggetto rimosso con acqua distillata al fine di rimuovere ogni cucciolata microplastic aderito ad esso. Conservare tutti gli oggetti naturali e artificiali lettiera in contenitori separati. Essiccare tutti gli oggetti naturali e artificiali lettiera in essiccatore (o all'aria aperta, ma in un piatto chiuso) e pesare. Identificare tutti gli oggetti per i rifiuti> 25 mm (macro lettiera) secondo il Maestro lista delle categorie di rifiuti Articoli 16.
- Dopo aver rimosso tutti gli oggetti più grandi, concentrare tutte le parti rimanenti in una parte del setaccio con bottiglie squirt o acqua di rubinetto. Versare il campione in un contenitore di vetro usando una quantità minima di etanolo al 70% con l'aiuto di un funnEL.
Nota: In questa fase l'uso di etanolo al 70% è cruciale per preservare il campione. Anche nella fase di ispezione visiva del campione, etanolo aiuta a scolorire organismi e plastiche colorate quindi diventare più facile trovare. - Prendete una piccola quantità del campione (sottocampione) e versarlo in un piatto di vetro Petri. Analizzare il campione con l'utilizzo di uno stereomicroscopio (20 - 80x zoom) e la ricerca di particelle microplastic.
- Ogni particella microplastic dovrebbe essere classificati in una delle categorie elencate nella tabella 1 e messo in una capsula di Petri o di altre fiale di vetro, segnato con un nome di categoria. Il piatto Petri deve essere chiuso in ogni momento.
Nota: Quando si separano microplastiche dal vostro campione essere conservatore e selezionare più piuttosto che meno particelle per l'analisi. Il vero struttura chimica delle particelle restano fissati in seguito. Assicurati di analizzare i grandi oggetti da tutte le parti come microplastiche possono essere bloccati e quindi nascosti sotto i più grandi articoli.Può anche essere utile per spostare oggetti già analizzati su un lato della piastra di Petri. - Mettere la piastra di Petri al microscopio con apparecchiature di misura (righello oculare calibrata dal software slitta micrometrica o analisi dell'immagine) e misurare la dimensione di ogni particella (misurare la diagonale maggiore), tranne filamenti, e notare il suo colore. Ogni sottocampione dovrebbe essere rivisto da un'altra persona. Fare attenzione a sciacquare il contenitore di vetro contenente il campione in modo che tutte le particelle che aderiscono alle pareti di vetro sono lavati nella capsula di Petri.
- Pesare le particelle microplastic di ciascuna categoria separatamente l'uso di bilancia analitica. particelle Microplastic devono essere essiccati prima della pesata. Il piatto chiuso Petri può essere messo in un essiccatore o dei campioni può essere lasciato ad asciugare in un piatto chiuso fino particelle è diventato secco (il peso della capsula di Petri chiusa con particelle è costante).
- Identificare micro lettiera. Quando si analizza un campione in cerca di microplastiche, perche non chealcune particelle saranno facilmente visibili (colore, forma, dimensione) mentre altri possono essere più difficile da trovare. Qui di seguito sono alcune caratteristiche che identificano le particelle microplastic nel campione: Per esempio, nessuna struttura delle cellule, irregolare, taglienti, bordi storti, spessore uniforme, colori distintivi (blu, verde, giallo, ecc).
3. Identificazione chimica di microplastiche
- Spettroscopia ATR-FTIR
- Prima dell'analisi pulire il sistema di rilevamento con l'alcol e un panno privo di lanugine.
- Registrare un spettro di fondo. Mettere il campione sul supporto del campione e raccogliere gli spettri. Identificare la ottenuto spettri FTIR Atr- utilizzando un raffronto automatizzato dello spettro ottenuto con spettri in un database.
- Spettroscopia micro-FTIR ATR
- Prima dell'analisi pulire il sistema di rilevamento con l'alcol e un panno privo di lanugine.
- Posizionare il campione su un filtro di vetro. Nota: Altri filtri possono essere noied ma la loro natura polimerica possono interferire con la caratterizzazione.
- Posizionare il filtro con il campione sul tavolo di scansione automatica e utilizzare il joystick per individuare il campione.
- Registrare un'immagine ottica e contrassegnare un'area (ad esempio 20 20 micron) dove sarà caratterizzata campione.
- Registrare un spettro di fondo.
- Posizionare il campione sul supporto del campione e raccogliere gli spettri nella posizione predefinita.
- Identificare la micro spettri ATR-FTIR ottenuti mediante un raffronto automatizzato dello spettro ottenuto con spettri in un database.
Representative Results
Il primo risultato del protocollo descritto sono particelle microplastic classificati in sei categorie in base alle loro caratteristiche visive (Tabella 1). La prima categoria, e di solito il più abbondante, sono frammenti (Figura 1). Essi sono rigide, di spessore, con bordi taglienti e storti una forma irregolare. Essi possono essere in una varietà di colori diversi. La seconda categoria sono film (Figura 2). Essi appaiono anche in forme irregolari, ma in confronto con frammenti, sono sottili e flessibili e solitamente trasparente. La terza categoria sono pellets (Figura 3), di solito proveniente dal settore delle materie plastiche. Sono irregolari, forme rotonde, e normalmente di dimensioni maggiori, circa 5 mm di diametro. Essi sono di solito piatto su un lato e possono essere di vari colori. La quarta categoria sono granulato (Figura 4). In confronto con pellet, hanno una forma rotonda regolare e di solito una dimensione inferiore, circa 1 mm di diametro. Essi appaiono in colori naturali(Bianco, beige, marrone). La quinta categoria sono filamenti (Figura 5). Sono, accanto a frammenti, il tipo più abbondante di particelle microplastic. Possono essere breve o lungo, con diversi spessori e colori. L'ultima categoria sono schiume (Figura 6). Sono più spesso provengono da particelle più grandi di polistirolo. Sono una, forma irregolare morbido e bianco al giallo.
Il risultato principale di microplastiche campionamento e analisi del campione è il numero di particelle microplastic per campione. Questi dati possono essere ulteriormente normalizzati per km 2. La formula utilizzata per la normalizzazione è:
particelle microplastic per area campione / campionamento,
in cui la superficie di campionamento viene calcolata moltiplicando la distanza di campionamento per la larghezza dell'apertura della rete manta (Tabelle 2, 3, la figura 7). Inoltre, le particelle possono essere analizzati con imsoftware di analisi di età. I risultati includono massima lunghezza e l'area di ogni particella (Tabella 4). Figura 8a mostrano particelle prima analisi di immagine e figura 8b è dopo l'analisi delle immagini, in cui ogni particella viene misurata e numerata. Infine, si consiglia un'analisi chimica del numero totale o più alto possibile di particelle per campione. Utilizzando Spettroscopia in trasformata di Fourier uno spettro della particella selezionata viene acquisita, come mostrato in Figura 9. Questo spettro viene quindi confrontato con gli spettri della libreria software (Figura 10). Il risultato finale mostrerà se una data particella è di plastica o meno e indica il tipo di plastica dalla struttura chimica.
| 1 | frammenti |
| 2 | cinema |
| 3 | Pellet |
| 4 | granuli |
| 5 | filamenti |
| 6 | Schiuma S |
Tabella 1: Categorie di particelle microplastic.
Figura 1: Esempio di particelle categoria: Frammenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di particelle di categoria: Films. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Esempio di particelle della categoria: Pellet. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio di particelle di categoria: Granuli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempio di particelle di categoria: filamenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempio di particelle della categoria: schiume. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| distanza di campionamento [km] | 2 |
| larghezza Manta [km] | 0,0006 |
| Area di campionamento [km 2] | 0,0012 |
Tabella 2: Esempio di dati provenienti da un'indagine, utilizzati per il calcolo di particelle microplastic per km 2.
| No | No / km 2 | |
| frammenti | 301 | 250833 |
| cinema | 45 | 37500 |
| pellet | 15 | 12500 |
| granuli | 8 | 6667 |
| schiume | 33 | 27500 |
| filamenti | 223 | 185833 |
Tabella 3: Esempio di risultati di un'indagine, in cui i dati suddivisi in 6 gruppi sono contati e normalizzati per km 2 (No - numero di particelle).
Figura 7: Esempio di risultati rappresentativi dopo la categorizzazione visiva di particoli (No - numero di particelle). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Regione Index | Area [mm²] | Lunghezza massima [mm] |
| 1 | 8.010 | 5,506 |
| 2 | 10,517 | 5.628 |
| 3 | 12,185 | 5,429 |
| 4 | 3.367 | 3.367 |
| 5 | 2.475 | 2.155 |
| 6 | 1.809 | 2.943 |
| 7 | 6,604 | 5,238 |
| 8 | 5,779 | 4.037 |
| 9 | 4,472 | 3.791 |
| 10 | 16,907 | 5.355 |
| 11 | 7,246 | 3.733 |
| 12 | 7,867 | 4.622 |
| 13 | 6,411 | 5,056 |
| 14 | 3.281 | 3.070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3.716 |
Tabella 4: Esempio di risultati di analisi di immagini in cui vengono misurate zona [mm 2] e la lunghezza massima [mm] di ciascuna particella.
Figura 8: Esempio di immagine acquisita a) prima e b) dopo analisi delle immagini di particelle con software di analisi dell'immagine.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Esempio di spettri misurati su una particella selezionata con picchi marcati e le loro lunghezze d'onda [cm -1]. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Esempio di confronto tra spettri acquisiti da particelle selezionato al meglio partita dalla libreria spettri ATR-FTIR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questo fIGURA.
Discussion
Microplastiche campionamento sulla superficie del mare da rete manta è un metodo ampiamente utilizzato per il campionamento delle microplastiche sulla superficie del mare, ma ad oggi non c'è stata alcuna metodologia unificata. Un grande volume di acqua può essere filtrata attraverso la rete manta, così la possibilità di intrappolare un numero rilevante di microplastiche è elevato ed i risultati sono percepiti affidabili. La comparabilità dei risultati tra diversi campioni è assicurata dalla normalizzazione. Nel nostro caso, le concentrazioni sono state riportate l'area campionata moltiplicando distanza rete tramite la larghezza orizzontale della luce netta. Un'altra opzione è quella di utilizzare un misuratore di flusso, fissato alla luce netta. L'uso di un misuratore di flusso è possibile poiché la rete manta con le sue ali laterali è molto stabile sulla superficie del mare e quindi saltellando sulle onde è minimo. Un flussometro registra il volume di acqua filtrata e quindi consente la normalizzazione dei risultati per volume di acqua campionata 16.
17, 18, ma in questo caso si deve essere sicuri che la rete è fuori dalla zona di scia. La distanza, sul quale è impostato il traino per il campionamento, deve essere stabilito caso, poiché la zona di turbolenze causate dalla nave varia dalla dimensione della nave e dalla velocità della barca 19, 20.
Separazione delle particelle microplastic dai campioni della superficie del mare è più spesso eseguita solo da identificazione visiva 21. Particelle più grandi di 1 mm possono essere identificate facilmente ad occhio nudo, mentre le particelle di dimensioni inferiori a 1 mm richiedono l'uso di uno stereomicroscopio. Si raccomanda di ridurre la possibilità di confondere le particelle non-plastica con quelle di plastica, utilizzando la luce di polarizzazione su stereomicroscopi. La possibilità di errata identificazione di particelle di plastica diventa più alto con particelle più piccole. Così particelle> 0,5 mm può essere identificato solo visivamente 21, mediante l'uso di stereomicroscopio. Per particelle inferiori a 0,5 mmun ulteriore metodo più accurato è necessario ad esempio micro ATR-FTIR spettroscopia 21.
Durante il processo di separazione microplastiche dal campione la possibilità di contaminazione del campione con filamenti dispersi nell'aria è molto alta. Per questo motivo, controllare Petri lasciate aperte sul piano di lavoro sono fortemente raccomandato per l'identificazione di potenziali contaminanti particelle sospese nell'aria. Vale a dire, la qualità dei dati dipende fortemente: 1) la precisione della persona che lavora con il campione, 2) la qualità e l'ingrandimento dello stereomicroscopio, e 3) la quantità di materia organica nel campione 16. Dopo l'identificazione visiva si raccomanda di analizzare le particelle ordinati con una delle tecniche disponibili per l'identificazione chimica del materiale 8.
Esistono diversi metodi per l'identificazione polimeri, tra cui la spettroscopia FTIR e spettroscopia Raman sono i più frequently utilizzato 22. spettroscopia FTIR e Raman sono tecniche complementari e la loro accuratezza è simile. Nel nostro protocollo, il FTIR e spettroscopia micro FTIR con "riflessione totale attenuata" (ATR) sono presentati. Sono semplici da usare e permettono risultati rapidi e precisi. Polimeri plastici possiedono spettri (IR) altamente specifico infrarossi con bande che distinti, rendendo così spettroscopia IR una tecnica ottimale per l'identificazione di microplastiche 21. L'energia della radiazione IR eccita una vibrazione molecolare specifico quando interagisce con un campione, che consente la misurazione della caratteristica di spettri IR 22. Spettroscopia FTIR può anche fornire ulteriori informazioni sulle particelle, come l'intensità di ossidazione 23 e il livello di degradazione 24. Mentre ATR-FTIR è adatto per l'identificazione chimica delle particelle più grandi (> 0,5 mm), micro spettroscopia ATR-FTIR può fornire informazioni sulla struttura chimica delle particelle e #60; 0,5 mm in quanto combina la funzione di un microscopio e uno spettrometro infrarosso.
Prima di utilizzare FTIR e spettroscopia micro FTIR, particelle microplastic devono essere preventivamente essiccato, in quanto l'acqua assorbe fortemente IR radiazione 22, e purificato, nel caso siano coperti di biofilm e / o altri aderenti organici ed inorganici che possono influenzare gli spettri IR. Il modo più non invasivo per purificare campioni è agitando e risciacquo con acqua fresca 25. Se questo non è sufficiente, allora è consigliabile l'uso di perossido di idrogeno al 30%. Tutti gli altri metodi possono avere effetti negativi sulle particelle microplastic (ad esempio, la pulizia ad ultrasuoni in grado di rompere ulteriormente particelle, forti soluzioni acide o alcaline possono danneggiare diversi polimeri di plastica, ecc) e quindi il loro uso non è raccomandato. Più promettente è l'utilizzo di una digestione enzimatica sequenziale come un passaggio di purificazione di plastica amichevole. Purificazione mediante diversi enzimi tecniche (ad esempio lipasi, unmylase, proteinasi, chitinasi, cellulasi, proteinasi-K) è stata applicata con successo per la riduzione di una matrice biologica di plancton e quindi dimostrato di essere una tecnica preziosa per ridurre al minimo gli artefatti matrice durante FTIR misure di spettroscopia 22.
Separazione di microplastiche di identificazione visiva e identificazione chimica delle particelle selezionate sono entrambi processi estremamente richiede tempo. Questo lavoro deve essere fatto da una persona precisa e paziente che ha esperienza con stereomicroscopi, non solo nel riconoscere le particelle di plastica, ma anche a riconoscere la materia biologica. Anche una persona con esperienza non può discriminare tutti i potenziali particelle microplastic senza ambiguità dalla chitina o diatomee frammenti 22. Pertanto, il tasso di errore di smistamento visivo varia dal 20% 26 al 70% 21 e aumenta al diminuire delle dimensioni delle particelle.
Acknowledgments
Lo sviluppo di questo protocollo è stata fondata da Programma di Cooperazione IPA Transfrontaliero Adriatico 2007-2013, nell'ambito del progetto DeFishGear (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
References
- Law, K. L., et al. Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical gyre. Science. 329 (5996), 1185-1188 (2010).
- Thompson, R. C. Microplastics in the marine environment: Sources, consequences and solutions. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 185-200 (2015).
- Lusher, A. Microplastics in the marine environment: distribution, interactions and effects. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 245-307 (2015).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects, and Fate of Microplastic Marine Debris, September 9-11. , NOAA. NOAA Technical Memorandum NOS-OR&R30 (2008).
- Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine pollution bulletin. 62 (8), 1596-1605 (2011).
- Browne, M. A. Sources and pathways of microplastics to habitats. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 229-244 (2015).
- Marine litter: an analytical overview. UNEP's REGIONAL SEAS PROGRAMME. , UNEP. (2005).
- van der Wal, M., et al. SFRA0025: Identification and Assessment of Riverine Input of (Marine) Litter, Final Report for the European Commission DG Environment under Framework Contract No ENV.D.2/FRA/2012/0025. , European Commission DG Environment. (2015).
- Setälä, O., Fleming-Lehtinen, V., Lehtiniemi, M. Ingestion and transfer of microplastics in the planktonic food web. Environmental pollution. 185, 77-83 (2014).
- Farrell, P., Nelson, K. Trophic level transfer of microplastic: Mytilus edulis. (L.) to Carcinus maenas (L). Environmental Pollution. 177, 1-3 (2013).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: a review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Bakir, A., Rowland, S. J., Thompson, R. C. Transport of persistent organic pollutants by microplastics in estuarine conditions. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 140, 14-21 (2014).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine pollution bulletin. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Zarfl, C., et al. Microplastics in oceans. Marine Pollution Bulletin. 62, 1589-1591 (2011).
- Hanke, G., et al. MSFD GES technical subgroup on marine litter. Guidance on monitoring of marine litter in European Seas. , Joint Research Centre-Institute for Environmente and Sustainability. Publications Office of the European Union. Luxembourg. (2013).
- Löder, M. G. J., Gerdts, G. Methodology used for the detection and indentification of microplastics - A critical appraisal. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 201-227 (2015).
- Kang, J. H., Kwon, O. Y., Lee, K. W., Song, Y. K., Shim, W. J. Marine neustonic microplastics around the southeastern coast of Korea. Marine pollution bulletin. 96 (1), 304-312 (2015).
- Lusher, A. L., Tirelli, V., O'Connor, I., Officer, R. Microplastics in Arctic polar waters: the first reported values of particles in surface and sub-surface samples. Scientific reports. 5, (2015).
- Shu, J. -J. Transient Marangoni waves due to impulsive motion of a submerged body. International Applied Mechanics. 40 (6), 709-714 (2004).
- Rabaud, M., Moisy, F. Ship wakes: Kelvin or Mach angle. Physical Review Letters. 110 (21), 214503 (2013).
- Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: a review of the methods used for identification and quantification. Environmental science & technology. 46 (6), 3060-3075 (2012).
- Löder, M. G. J., Kuczera, M., Mintenig, S., Lorenz, C., Gerdts, G. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environmental Chemistry. 12 (5), 563-581 (2009).
- Ioakeimidis, C., et al. The degradation potential of PET bottles in the marine environment: An ATR-FTIR based approach. Scientific reports. 6, 23501 (2016).
- McDermid, K. J., McMullen, T. L. Quantitative analysis of small-plastic debris on beaches in the Hawaiian archipelago. Marine pollution bulletin. 48 (7), 790-794 (2004).
- Eriksen, M., et al. Microplastic pollution in the surface waters of the Laurentian Great Lakes. Marine pollution bulletin. 77 (1-2), 177-182 (2013).
