Summary
Protokollet nedan beskriver metoden för: microplastics provtagning på havsytan, separation av mikroplast och kemisk identifiering av partiklar. Detta protokoll är i linje med rekommendationerna för microplastics övervakning offentliggjorts av MSFD tekniska gruppen på marint skräp.
Protocol
1. Provtagning av microplastics på havsytan
- Distribuera manta netto från sidan av fartyget med hjälp av en spinnakerbom eller »A-frame« med linjer och karbiner.
- Distribuera manta netto ur vakna zon (ca 3 -. 4 m avstånd från båten) för att förhindra att samla vatten som påverkas av turbulens inuti vakna zon.
- Skriv ner de första GPS-koordinaterna och första gången i databladet.
- Börjar röra sig i en rak riktning med en hastighet av ca. 2 - 3 knop för 30 min och börjar tidmätningen.
- Efter 30 min stoppa båten och skriva ner slut GPS-koordinater, (den mest korrekta sättet är att beräkna längden från GPS-koordinater) längden på sträckan och den genomsnittliga båtfart i databladet tillhandahålls och lyft manta netto ur vattnet.
- Skölj manta nätet noga från utsidan av nätet med havsvatten med hjälp av en dränkbar pump eller vatten från båt water reservoar. Skölj i riktning från manta munnen till lyftet för att koncentrera alla partiklar fastnat på nätet i lyftet.
Obs: Skölj aldrig provet genom öppningen av nätet i syfte att förhindra kontaminering. - Säkert ta bort lyftet och provet siktas i lyftet genom en 300 pm maskstorlek sikt eller mindre.
- Skölj lyftet noga från utsidan och häll resten av provet genom sikten. Upprepa detta steg tills det inte längre finns några partiklar inuti lyftet.
- Koncentrera allt material på sikten i en del av sikten.
- Med användningen av en tratt, skölj sil i en glasburk eller plastflaska med användning av 70% etanol.
- Stäng flaskan, torka av den med hushållspapper och märka locket och utanför burken med den kända ta prov och datum med vattentät markör (om du också sätta en andra etikett skriven med en penna på velum papper i en burk för att undvika eventuell förlust avprovet namn på grund av den raderade etiketten på burk). Överför märkt plastflaska i kylbox.
Observera att de allmänna villkoren för provtagning: Vindhastigheten bör inte vara mer än två Beaufort, eftersom vågorna är för höga och nätet är inte stabil på havsytan. Det är viktigt att hålla en jämn linjär kurs vid en konstant hastighet under trålar. Hälften av manta netto öppningen bör nedsänkt under provtagningen. Varaktigheten på provtagningen ska vara 30 minuter (i de fall där det finns en stor mängd naturmaterial, t ex plankton blommar, kan varaktigheten för provtagning vara kortare). Undvik att använda verktyg och plastbehållare. Undvik syntetiska kläder (t.ex. fleece), att linor och kontakt manta nät med fartyg förhindra kontaminering av provet. Var mycket noga med att inte skada manta nätet eller båtskrovet medan driftsätta och fånga nätet.
2. Separation av microplastics från havsytan prover
- Om provet inte innehållernågra objekt större än 25 mm och verkar vara ren, fortsätta direkt med steg 3.
- Häll provet genom sikten (≤300 um maskstorlek) och ta bort alla naturliga eller artificiella kull objekt av en storlek> 5 mm (makro och mezzo strö) från provet, med hjälp av visuell identifiering och pincett. Var noga med att skölja varje bort objekt försiktigt med destillerat vatten för att avlägsna eventuella mikroplast kull anslutit sig. Förvara alla naturliga och konstgjorda kullen objekt i separata behållare. Torka alla naturliga och konstgjorda kullen objekt i en torkapparat (eller i det fria, men i en sluten skål) och väga dem. Identifiera alla strö föremål> 25 mm (makro kull) enligt Master Förteckning över Kategorier av strö artiklar 16.
- Efter att alla större föremål, koncentrera alla återstående bitar i en del av sikten med användning squirt flaskor eller kranvatten. För över provet till en glasbehållare med användning av en minimimängd av 70% etanol med hjälp av en funnel.
Obs: I detta steg är avgörande användning av 70% etanol för att bevara provet. Också i steget av visuell inspektion av provet hjälper etanol för att missfärga de organismer och färgstarka plaster därför blivit lättare att hitta. - Ta en liten mängd av provet (delprov) och häll den i ett glas petriskål. Analysera provet med användning av ett stereomikroskop (20 - 80x zoom) och sök efter mikroplastpartiklar.
- Varje mikroplast partikel bör kategoriseras i en av de kategorier som anges i tabell 1 och placerades i en petriskål eller andra glasflaskor, märkt med ett kategorinamn. Petriskålen måste stängas vid alla tidpunkter.
Obs: När separerar microplastics från ditt prov vara konservativ och markera fler snarare än färre partiklar för analys. Den verkliga kemiska strukturen för partiklar kommer fortfarande att bestämmas senare. Var noga med att analysera större föremål från alla sidor som microplastics kan fastna och därmed gömd under större föremål.Det kan också vara till hjälp för att flytta redan analyserade föremål till ena sidan av petriskålen. - Placera petriskål under mikroskop med mätutrustning (okulär linjal kalibreras med mikrometer bild eller bildanalysprogram) och mäta storleken på varje partikel (mäta längsta diagonalen), utom filament, och notera dess färg. Varje delprov bör ses över av en annan person. Var noga med att skölja glasbehållare som innehåller provet så att alla partiklar som fastnat på glasväggarna tvättas i petriskål.
- Väg mikroplastpartiklar i varje kategori för sig med hjälp av analytisk skala. Mikroplastpartiklar måste torkas före vägning. Den slutna petriskål kan sättas i en torkapparat eller proverna kan lämnas att torka i en sluten skål tills partiklar blev torr (vikt stängd petriskål med partiklar är konstant).
- Identifiera mikro kull. Vid analys av ett prov på jakt efter microplastics, kan du överväga attvissa partiklar kommer att vara väl synlig (färg, form, storlek) medan andra kan vara svårare att hitta. Nedan är några funktioner som identifierar mikroplastpartiklar i provet: Till exempel, ingen cellstruktur, ojämn, skarpa, krokiga kanter, enhetlig tjocklek, distinkta färger (blå, grön, gul, etc.).
3. Kemisk identifiering av microplastics
- ATR-FTIR-spektroskopi
- Före analysen rengöra detektionssystem med alkohol och en luddfri trasa.
- Spela in ett bakgrundsspektrum. Placera provet på provhållaren och samla spektra. Identifiera den erhållna Atr- FTIR-spektra med användning av en automatisk jämförelse av det erhållna spektrum med spektra i en databas.
- Mikro ATR-FTIR-spektroskopi
- Före analysen rengöra detektionssystem med alkohol och en luddfri trasa.
- Placera provet på ett glasfilter. Obs: Andra filter kan vara ossEd men deras polymer natur kan störa karakterisering.
- Placera filtret med provet på automatisk scanning bordet och använda styrspaken för att lokalisera provet.
- Spela in en optisk bild och markera ett område (t.ex. 20 av 20 pm) där provet kommer att karakteriseras.
- Spela in ett bakgrundsspektrum.
- Placera provet på provhållaren och samla spektra på förhand fastställd plats.
- Identifiera den erhållna mikro ATR-FTIR-spektra med användning av en automatisk jämförelse av det erhållna spektrum med spektra i en databas.
Representative Results
Det första resultatet av den beskrivna protokollet är mikroplastpartiklar kategoriseras i sex kategorier enligt deras visuella egenskaper (Tabell 1). Den första kategorin, och vanligtvis den mest förekommande en, är fragment (Figur 1). De är stela, tjocka, med skarpa sneda kanter och en oregelbunden form. De kan vara i en mängd olika färger. Den andra kategorin är filmer (Figur 2). De visas också i oregelbundna former, men i jämförelse med fragment, de är tunna och flexibla och vanligtvis öppet. Den tredje kategorin är pellets (Figur 3), vanligtvis härrör från plastindustrin. De är oregelbundna, runda former, och normalt större i storlek, cirka 5 mm i diameter. De är vanligtvis platt på en sida och kan vara av olika färger. Den fjärde kategorin är granuler (Figur 4). I jämförelse med pellets, de har en regelbunden rund form och vanligtvis en mindre storlek, omkring 1 mm i diameter. De visas i naturliga färger(Vitt, beige, brun). Den femte kategorin är trådar (Figur 5). De är bredvid fragment, den vanligast förekommande typen av mikroplastpartiklar. De kan vara kort eller lång, med olika tjocklekar och färger. Den sista kategorin är skum (Figur 6). De kommer oftast från stora partiklar av frigolit. De är en mjuk, oregelbunden form och vit till gul till färgen.
Det viktigaste resultatet av microplastics provtagning och provanalys är antalet mikroplastpartiklar per prov. Dessa data kan vara ytterligare normaliseras per km 2. Den formel som används för normalisering är:
mikroplastpartiklar per prov / provtagningsområdet,
där provytan beräknas genom att multiplicera provtagning avstånd med bredden på öppningen av manta netto (tabell 2, 3, Figur 7). Dessutom kan partiklar analyseras med imålder analysprogram. Resultaten inkluderar maximal längd och arean av varje partikel (tabell 4). Figur 8a visar partiklar före bildanalys och Figur 8b är efter bildanalys, där varje partikel mäts och numrerade. Slutligen är en kemisk analys av den totala eller högsta möjliga antalet partiklar per prov rekommenderas. Med användning av FTIR ett spektrum av den valda partikeln förvärvas, såsom visas på figur 9. Detta spektrum jämförs sedan med spektra från mjukvarubibliotek (Figur 10). Slutresultatet kommer att visa om en viss partikel är plast eller inte och ange vilken typ av plast från den kemiska strukturen.
| 1 | fragment |
| 2 | filmer |
| 3 | pellets |
| 4 | granuler |
| 5 | filament |
| 6 | Skum s |
Tabell 1: Kategorier av mikroplastpartiklar.
Figur 1: Exempel på partiklar från kategori: fragment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på partiklar från kategori: Films. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/55161fig3.jpg "/>
Figur 3: Exempel på partiklar i kategorin: Pellets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på partiklar från kategori: Granulat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på partiklar i kategorin: trådar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Exempel på partiklar i kategorin: Skum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Provtagning avstånd [km] | 2 |
| Manta bredd [km] | 0,0006 |
| Provtagningsområdet [km 2] | 0,0012 |
Tabell 2: Exempel på data från undersökningen, som används för beräkning av mikroplastpartiklar per km 2.
| Nej | Nej / km 2 | |
| fragment | 301 | 250833 |
| filmer | 45 | 37500 |
| pellets | 15 | 12500 |
| granuler | 8 | 6667 |
| skum | 33 | 27500 |
| filament | 223 | 185833 |
Tabell 3: Exempel på resultat från undersökningen, där kategoriserade data till 6 grupper räknas och normaliseras per km 2 (Nej - antal partiklar).
Figur 7: Exempel på representativa resultat efter visuell kategorisering av partiklar (nr - antal partiklar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| index Region | Area [mm²] | Maximal längd [mm] |
| 1 | 8,010 | 5,506 |
| 2 | 10,517 | 5,628 |
| 3 | 12,185 | 5,429 |
| 4 | 3,367 | 3,367 |
| 5 | 2,475 | 2,155 |
| 6 | 1,809 | 2,943 |
| 7 | 6,604 | 5,238 |
| 8 | 5,779 | 4,037 |
| 9 | 4,472 | 3,791 |
| 10 | 16,907 | 5,355 |
| 11 | 7,246 | 3,733 |
| 12 | 7,867 | 4,622 |
| 13 | 6,411 | 5,056 |
| 14 | 3,281 | 3,070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3,716 |
Tabell 4: Exempel på bildanalysresultat där område [mm 2] och maximal längd [mm] av varje partikel mäts.
Figur 8: Exempel på bild förvärvat a) före och b) efter bildanalys av partiklar med bildanalysprogram.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Exempel på spektra mäts på en vald partikel med markerade toppar och deras våglängder [cm -1]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Exempel på jämförelse av förvärvad spektra från vald partikel till bästa matchningen från ATR-FTIR spektra bibliotek. Klicka här för att se en större version av denna figure.
Discussion
Microplastics provtagning på havsytan av manta nätet är en allmänt använd metod för provtagning av microplastics på havsytan, men hittills har det inte funnits någon enhetlig metod. En stor volym vatten kan filtreras genom manta nätet, således möjlighet att fånga ett relevant antal microplastics är hög och resultaten uppfattas vara tillförlitliga. Jämförbara resultat mellan olika prover säkerställs genom normalisering. I vårt fall var halterna i samband med provområdet genom att multiplicera trål avstånd från den horisontella bredden av netto öppningen. Ett annat alternativ är att använda en flödesmätare, fixerad vid netto öppningen. Användningen av en flödesmätare är möjligt eftersom det manta nätet med sina sidovingar är mycket stabilt på havsytan och därför hoppande på vågorna är minimal. En flödesmätare registrerar volymen av filtrerat vatten och därmed gör det möjligt att normaliseringen av resultaten per volym samplade vatten 16.
17, 18, men i så fall måste vara säker på att nätet är ur kölvattnet zonen. Avståndet, som trålen sätts för provtagning, bör bestämmas individuellt, eftersom det fria turbulens som orsakas av fartyg varierar från fartygets storlek och från hastigheten på båten 19, 20.
Separation av mikroplastpartiklar från havsytan prover är oftast sker bara genom visuell identifiering 21. Partiklar större än 1 mm kan identifieras lätt med blotta ögat, medan partiklar som är mindre än 1 mm erfordrar användning av ett stereomikroskop. För att minska risken att blanda ihop de icke-plastpartiklar med plast sådana, med hjälp av polariserings ljus på stereomikroskop rekommenderas. Möjligheten till felaktig identifiering av plastpartiklar blir högre med mindre partiklar. Sålunda partiklar> 0,5 mm kan endast identifieras visuellt 21, genom användning av stereomikroskop. För partiklar som är mindre än 0,5 mmen ytterligare, mer exakt metod krävs t.ex. mikro ATR-FTIR spektroskopi 21.
Under processen för microplastics separation från provet möjligheten till provkontaminering med de luftburna filamenten är mycket hög. Av denna anledning, kontrollera petriskålar lämnats öppna på arbetsbordet rekommenderas starkt för identifiering av potentiella föroreningsluftburna partiklar. Nämligen, beror kvaliteten på de uppgifter starkt på: 1) precisionen hos den person som arbetar med provet, 2) kvalitet och förstoring av stereo, och 3) mängden organiskt material i provet 16. Efter visuell identifiering det rekommenderas att analysera de sorterade partiklar med en av de tillgängliga teknikerna för kemisk identifiering av materialet 8.
Det finns flera metoder för identifiering polymer, bland vilka FTIR-spektroskopi och Raman-spektroskopi är de mest frequently används 22. FTIR och Raman-spektroskopi är komplementära metoder och deras noggrannhet är liknande. I våra protokoll är FTIR och mikro FTIR spektroskopi med "dämpad totalreflektion" (ATR) presenteras. De är enkla att använda och de möjliggör snabba och korrekta resultat. Plastpolymer besitter mycket specifik infraröd (IR) spektra med distinkta bandmönster, vilket gör IR-spektroskopi en optimal teknik för identifiering av microplastics 21. Energin i IR-strålning exciterar en specifik molekylär vibration vid interaktion med ett prov, som möjliggör mätning av karaktäristiska IR-spektra 22. FTIR spektroskopi kan också ge ytterligare information om partiklar, såsom intensitet oxidation 23 och nivån på nedbrytning 24. Medan ATR-FTIR är lämplig för kemisk identifiering av större partiklar (> 0,5 mm), kan mikro ATR-FTIR spektroskopi ger information om den kemiska strukturen hos partiklar & #60; 0,5 mm, eftersom den kombinerar funktionen av ett mikroskop och en infraröd spektrometer.
Innan du använder FTIR och mikro FTIR spektroskopi, mikroplastpartiklar måste tidigare torkas, eftersom vatten absorberar starkt IR-strålning 22, och renas, om de är täckta med biofilmer och / eller andra organiska och oorganiska anhängare, som kan påverka IR-spektra. Det mest icke-invasiv metod för att rena prover är genom omröring och sköljning med färskvatten 25. Om detta inte är tillräckligt, då användningen av 30% väteperoxid rekommenderas. Alla andra metoder kan ha negativa effekter på mikroplastpartiklar (t.ex. ultraljudsrengöring kan ytterligare bryta partiklar, kan starkt sura eller alkaliska lösningar skada flera plastpolymerer, etc.) och därför rekommenderas inte användning. Mer lovande är användning av en sekventiell enzymatisk spjälkning som en plast vänlig reningssteg. Rening med användning av olika tekniska enzymer (t.ex. lipas, ettmylase, proteinas, kitinas, cellulas, proteinas-K) har framgångsrikt tillämpats att minska en biologisk matris av plankton och därmed visat sig vara en värdefull teknik för att minimera matris artefakter under FTIR spektroskopi mätningar 22.
Separation av microplastics genom visuell identifiering och kemisk identifiering av valda partiklar är både extremt tidskrävande processer. Detta arbete måste utföras av en noggrann och tålmodig person som har erfarenhet av stereo, inte bara att erkänna plastpartiklarna, men också i att känna igen biologiskt material. Även en erfaren person kan inte diskriminera alla potentiella mikroplastpartiklar entydigt från kitin eller kisel fragment 22. Därför varierar felgraden för visuell sortering från 20% 26 till 70% och 21 och ökar med minskande partikelstorlek.
Acknowledgments
Utvecklingen av detta protokoll grundades av IPA Adriatiska Gränsöverskridande samarbetsprogram 2007-2013, inom DeFishGear projektet (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
References
- Law, K. L., et al. Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical gyre. Science. 329 (5996), 1185-1188 (2010).
- Thompson, R. C. Microplastics in the marine environment: Sources, consequences and solutions. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 185-200 (2015).
- Lusher, A. Microplastics in the marine environment: distribution, interactions and effects. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 245-307 (2015).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects, and Fate of Microplastic Marine Debris, September 9-11. , NOAA. NOAA Technical Memorandum NOS-OR&R30 (2008).
- Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine pollution bulletin. 62 (8), 1596-1605 (2011).
- Browne, M. A. Sources and pathways of microplastics to habitats. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 229-244 (2015).
- Marine litter: an analytical overview. UNEP's REGIONAL SEAS PROGRAMME. , UNEP. (2005).
- van der Wal, M., et al. SFRA0025: Identification and Assessment of Riverine Input of (Marine) Litter, Final Report for the European Commission DG Environment under Framework Contract No ENV.D.2/FRA/2012/0025. , European Commission DG Environment. (2015).
- Setälä, O., Fleming-Lehtinen, V., Lehtiniemi, M. Ingestion and transfer of microplastics in the planktonic food web. Environmental pollution. 185, 77-83 (2014).
- Farrell, P., Nelson, K. Trophic level transfer of microplastic: Mytilus edulis. (L.) to Carcinus maenas (L). Environmental Pollution. 177, 1-3 (2013).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: a review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Bakir, A., Rowland, S. J., Thompson, R. C. Transport of persistent organic pollutants by microplastics in estuarine conditions. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 140, 14-21 (2014).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine pollution bulletin. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Zarfl, C., et al. Microplastics in oceans. Marine Pollution Bulletin. 62, 1589-1591 (2011).
- Hanke, G., et al. MSFD GES technical subgroup on marine litter. Guidance on monitoring of marine litter in European Seas. , Joint Research Centre-Institute for Environmente and Sustainability. Publications Office of the European Union. Luxembourg. (2013).
- Löder, M. G. J., Gerdts, G. Methodology used for the detection and indentification of microplastics - A critical appraisal. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 201-227 (2015).
- Kang, J. H., Kwon, O. Y., Lee, K. W., Song, Y. K., Shim, W. J. Marine neustonic microplastics around the southeastern coast of Korea. Marine pollution bulletin. 96 (1), 304-312 (2015).
- Lusher, A. L., Tirelli, V., O'Connor, I., Officer, R. Microplastics in Arctic polar waters: the first reported values of particles in surface and sub-surface samples. Scientific reports. 5, (2015).
- Shu, J. -J. Transient Marangoni waves due to impulsive motion of a submerged body. International Applied Mechanics. 40 (6), 709-714 (2004).
- Rabaud, M., Moisy, F. Ship wakes: Kelvin or Mach angle. Physical Review Letters. 110 (21), 214503 (2013).
- Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: a review of the methods used for identification and quantification. Environmental science & technology. 46 (6), 3060-3075 (2012).
- Löder, M. G. J., Kuczera, M., Mintenig, S., Lorenz, C., Gerdts, G. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environmental Chemistry. 12 (5), 563-581 (2009).
- Ioakeimidis, C., et al. The degradation potential of PET bottles in the marine environment: An ATR-FTIR based approach. Scientific reports. 6, 23501 (2016).
- McDermid, K. J., McMullen, T. L. Quantitative analysis of small-plastic debris on beaches in the Hawaiian archipelago. Marine pollution bulletin. 48 (7), 790-794 (2004).
- Eriksen, M., et al. Microplastic pollution in the surface waters of the Laurentian Great Lakes. Marine pollution bulletin. 77 (1-2), 177-182 (2013).
