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Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

Published: February 14, 2017 doi: 10.3791/55192
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4, 1, 5,6, 1
1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

Summary

des cellules progénitrices endothéliales (EPCs) sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. Cette méthode décrit l'isolement de EPCs humains provenant du sang périphérique, ainsi que l'identification de leur potentiel migratoire avec des échantillons de sérum de patients de chirurgie cardiaque.

Abstract

les cellules progénitrices endothéliales (EPC) sont recrutés dans la moelle osseuse dans des conditions pathologiques comme l'hypoxie et sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. L'origine, la classification et la caractérisation des EPCs sont complexes; nonobstant, deux sous-types importants de EPCs ont été établis: soi-disant «précoce» EPCs (par la suite appelés premiers-EPCs) EPCs et tardive excroissance (fin-EPCs). Ils peuvent être classés par propriétés biologiques, ainsi que par leur apparition au cours de la culture in vitro. Alors que EPCs «précoces» apparaissent en moins d'une semaine après la culture de cellules mononucléaires dérivés du sang périphérique dans les médias communautaires spécifiques, EPCs tardive excroissance se trouvent au bout de 2-3 semaines. EPCs tardive excroissance ont été reconnus pour être directement impliqués dans la néovascularisation, principalement par le biais de leur capacité à se différencier en cellules endothéliales matures, alors que «précoce» EPCs expriment divers facteurs angiogéniques comme endogencargaison ous pour promouvoir l'angiogenèse d'une manière paracrine. Au cours de l'infarctus ischémie / reperfusion (I / R), divers facteurs contrôlent le homing des PEC à des régions de formation des vaisseaux sanguins.

Macrophage facteur inhibiteur de la migration (MIF) est une cytokine pro-inflammatoire et ubiquitaire chimiokine-like et a récemment été décrit pour fonctionner comme régulateur clé de la migration EPCs à des concentrations physiologiques 1. Fait intéressant, le MIF est stocké dans les piscines intracellulaires et peut rapidement être libéré dans la circulation sanguine après plusieurs stimuli (par exemple , infarctus du myocarde).
Ce protocole décrit un procédé pour l'isolement fiable et la culture précoce EPCs à partir de sang périphérique humain adulte basé sur la sélection de cellules CD34-positives à la culture subséquente dans un milieu contenant des facteurs de croissance endothéliaux sur des plaques revêtues de fibronectine pour une utilisation dans des essais in vitro de migration dans contre des échantillons de sérum des patients de chirurgie cardiaque. En outre, lainfluence migratoire de MIF sur la chimiotaxie de EPCs par rapport à d'autres cytokines de l'angiogenèse stimulant bien connu est démontrée.

Introduction

Les cellules progénitrices endothéliales (EPC) circulent dans le sang humain et ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales 2. Ils participent à la vasculogenèse et sont capables de minimiser les dommages causés par l' inflammation et l' ischémie / reperfusion (I / R) , les blessures de diverses manières 3, 4. Par exemple, EPCs montrent des niveaux élevés d'enzymes antioxydantes intracellulaires comme la catalase, la glutathion peroxydase ou superoxyde dismutase manganèse (MnSOD) 5. La résistance élevée contre le stress oxydatif permet EPCs de fonctionner dans des micro - environnements avec des espèces élevées réactives de l' oxygène (ROS) après une lésion ischémique 6. Des études antérieures ont également indiqué que le nombre de CPE peut être corrélée à la réparation vasculaire et qu'un nombre réduit de faire circuler EPCs prédit la survenue d'événements cardiovasculaires 7,class = "xref"> 8. Cependant, une définition claire d'un EPC n'a pas encore été trouvé. Jusqu'à présent, il n'y a pas de marqueur de surface cellulaire spécifique ou phénotype cohérent pour EPCs et ces cellules sont très rares dans le sang périphérique 9. Un EPC humain doit être considérée comme une cellule de circulation avec la possibilité de contribuer à la reconstruction de l'endothélium blessé et de nouvelles structures vasculaires.

Une façon d'isoler et de caractériser EPCs est par adhérence à la fibronectine. De ce fait, la capacité de ces cellules est utilisé pour montrer une adhérence supérieure à la fibronectine boîtes revêtues par rapport au collagène de type 1, par exemple 3, 10, 11. Cependant, d' autres ont constaté que le placage des cellules mononucléées sur des boîtes revêtues de fibronectine , sans aucune étape de purification précédente ou encore conduit à des colonies comprenant des cellules progénitrices myéloïdes, les monocytes et les lymphocytes T 12, 13, 14. En outre, dans ce cas, les plaquettes peuvent contaminer les cellules mononucléaires (MNC) et transférer ainsi la fraction des protéines de membrane de plasma de toutes les cellules adhérentes 15.

En plus de la caractérisation par des essais in vitro d'adhérence, une combinaison de différents marqueurs de la surface cellulaire est utilisée pour décrire un type cellulaire considéré comme une CPE. Dans ce cas, après l'adhésion de la fibronectine à médiation, les cellules sont analysées concernant leurs attributs endothéliales-like. Dans ce procédé, les deux marqueurs associés aux cellules endothéliales, acétylée lipoprotéine de basse densité (acLDL) et vasculaire, récepteur du facteur de croissance endothelial 2 (VEGFR-2, KDR), jouent un rôle. On a montré que les cellules et les macrophages endothéliales de prendre spécifiquement en acLDL dans un processus appelé «voie cellulaire au trésor" 16. Une autre protéine marqueur est KDR comme le principal récepteur du VEGF sur endothéliale17 cellules. Cependant, comme EPCs en général sont cultivées dans un milieu supplémenté en facteurs de croissance endothéliaux et sérum de veau foetal, il est possible que les macrophages, qui aurait également pu être à tort, isolé, présentent un profil de marqueur endothélial-like. Comme on le voit plus haut, si cultivées dans un milieu conditionné endothéliale, les macrophages expriment des protéines «spécifiques» 18 endotheliales.

En général, il existe deux catégories de EPCs au sein de plusieurs sous - types, qui peuvent être trouvés dans le sang ou être cultivées in vitro. EPCs Late-excroissance (fin-EPCs) apparaissent après 2-3 semaines de culture. Ces cellules sont intégrées plus rapidement dans une monocouche de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine et peuvent former des tubes capillaires 19. D'ailleurs, soi-disant «début-EPCs" circuler dans le sang pendant environ une semaine et d'agir d'une manière plus passive grâce à la prestation des molécules angiogéniques, comme la croissance de l'endothélium vasculairefactor (VEGF), ou 19 CXCL8. Les patients atteints de maladie coronarienne (CAD) ont montré des quantités significativement plus faibles des premiers-EPCs par rapport à un groupe témoin sans 20 CAD. Fait intéressant, le même groupe a montré des quantités élevées de fin des EPCs par rapport à un groupe témoin. Une autre étude a montré que les premiers-EPCs protéger EPCs différenciées de l' apoptose dans des conditions oxydantes de manière paracrine 6. Par conséquent, les premiers EPCs peuvent fournir des effets protecteurs appropriés par le biais de la migration des autres cellules d'une façon automatique ou paracrine au sein du sang périphérique.

Ce protocole décrit un procédé pour purifier du début des EPCs en isolant d' abord la fraction de PBMC à partir de sang périphérique humain et on isole ensuite les cellules CD34 + à partir de la fraction de PBMC pour effacer cette suspension cellulaire à partir de cellules non désirées. CD34 est un marqueur qui est utilisé pour l'isolement de cellules souches hématopoïétiques humaines 9 + sont cultivées sur des surfaces de culture de tissu revêtu de fibronectine. Au bout de trois jours, le milieu est changé, perdant ainsi toutes les cellules non-adhérentes. Enfin, EPCs isolées sont colorées pour vérifier l'absorption de acLDL et la présence de KDR comme marqueur des cellules endotheliales en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). En tant que marqueur supplémentaire, nous avons analysé la molécule endothéliale plaquettaire d'adhésion cellulaire (PECAM-1, CD31), qui se produit également sur les cellules endothéliales.

Restauration du tissu myocardique endommagé ou infarci par un renforcement de recrutement de EPCs fait partie des stratégies de traitement intensivement étudiés dans les maladies cardiovasculaires. Cependant, la traduction des résultats expérimentaux dans la pratique clinique est toujours difficile, compte tenu de l'interaction cellulaire complexe dans le corps humain au cours de diverses conditions physiopathologiques. En outre, le I myocardique / R blessures déclenchent une sécrétion excessive de diverses cytokines, des hormones de croissance et fac teurs, qui contrôlent la tête chercheuse de EPCs à des régions de formation de vaisseaux sanguins 13. Comme cela a déjà montré, CXCL8, 1α facteur dérivé des cellules stromales (SDF-1α, CXCL12), le VEGF et la migration des macrophages facteur d'inhibition (CMI) est significativement augmenté dans les échantillons de sérum après un infarctus du I / R 1 blessure. Parmi ces facteurs, le MIF est une cytokine de chimiokines comme pléiotropique ayant des caractéristiques principalement pro-inflammatoires. Contrairement à son nom historique, MIF a des fonctions pro-migratoires, agissant comme un véritable chimiokine sur les différents types de cellules 1, 21, 22. Les processus de recrutement cellulaire à médiation par du MIF ont été liés aux récepteurs de chimiokine CXCR4 et CXCR2, qui se lie au MIF et active d'une manière non 21 apparenté. Il faut noter que EPCs expriment à la fois de ces récepteurs sur leur surface, qui deviennent de plus régulée à la hausse dans des conditions hypoxiquesass = "xref"> 23, 24. En outre, accumulation de preuves suggère que MIF a un effet global de cardio-protecteur pendant I R blessures / du cœur 22, 25, 26. Dans ce contexte, il a été en outre montré que MIF peut soutenir la néovascularisation au cours du stress hypoxique qui est particulièrement pertinent, lors de l' examen des mécanismes de récupération limités du myocarde blessé 27. Des études antérieures in vitro et des expériences dans des modèles de souris pré-cliniques fournis première preuve sur le rôle de MIF dans EPCs recrutement 4. À noter, le MIF est également une protéine de cargaison importante de EPCs qui peut être libéré lors du recrutement EPCs dans les sites ischémiques 28. Cependant, les études en milieu clinique, en particulier par rapport aux autres (angiogéniques) cytokines sériques demeurent insaisissables.

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Protocol

Du sang pour l'isolement des EPCs a été obtenu à partir de volontaires sains après consentement éclairé en conformité avec le comité d'éthique local. Des échantillons de sérum utilisés dans les tests de migration ont été obtenus chez des patients ayant subi une chirurgie cardiaque classique avec l'utilisation d'un pontage cardio-pulmonaire (CPB). Les critères d'exclusion étaient les opérations d'urgence, la grossesse connue ou soupçonnée, patient`s âge de moins de 18 ans, et l'impossibilité d'obtenir un consentement éclairé. Des échantillons de sérum ont été tirées en plus des mesures de routine clinique (immédiatement avant l'intervention chirurgicale et immédiatement après la reperfusion myocardique / ouverture de l'aorte clampage) et ensuite stockés à -80 ° C jusqu'à l'analyse finale. Le comité d'examen institutionnel (Comité d'éthique, Université RWTH Aachen) a approuvé cette étude. Les patients ont un âge moyen de 68,6 ans et un poids moyen de 81,7 kg. Maladies préexistantes incluses: hypertension (65%), la maladie pulmonaire chronique (19%), artériopathie cardiaque supplémentaire (16%), d'un dysfonctionnement cérébral (6%), de l'angine de poitrine instable (3%), de l'infarctus du myocarde récent (28% dans les 90 d), une maladie rénale chronique (14%), les maladies du foie (2%) et le diabète (34%).

1. Revêtement de T75 Flask:

  1. Préparer la solution de fibronectine 5 ml (1 mg de fibronectine humaine dilué dans 15 mL d'eau ultrapure) par flacon T75.
  2. Ajouter la solution à un flacon T75 et attendre jusqu'à ce que l'eau soit évaporée. Pour éviter les interruptions inutiles au cours du processus d'isolement en raison de l'évaporation, effectuer ce processus à l' avance (par exemple la nuit) et à la température ambiante. Cette solution donne 4,44 pg fibronectine / cm 2.
  3. Préparer la croissance de cellules endotheliales milieu MV2 en complétant le milieu de base MV2 avec les suppléments de facteurs de croissance fournies par le fabricant.

2. Isolement des cellules progénitrices endothéliales (EPC) à partir de 60 ml de sang:

NOTE: Comme le CD34-positif sélection cocktail unnd les billes magnétiques sont disponibles dans le commerce dans un kit de sélection combinée, il n'y a pas de concentration fournies par le fabricant. Cependant, environ 100 ul de l'anticorps sont suffisants pour traiter jusqu'à 5 x 10 8 cellules. Les billes magnétiques sont dilués dans de l'eau, le dextran-enduit et environ 5000 x plus petit par rapport aux autres perles disponibles dans le commerce. Pour plus d'informations, voir les instructions Référence rechange.

  1. Mélanger le sang (avec ou sans anticoagulants) 1: 1 avec Ca 2+ Mg 2+ -free PBS.
  2. Ajouter 15 ml de solution à gradient de densité par 50 ml tube. Pour plus d'informations, voir les instructions Référence rechange.
  3. couche lentement le sang dilué au-dessus de la solution de gradient de densité.
  4. Centrifuger les échantillons à 2500 xg pendant 30 min avec une accélération lente et sans freinage.
  5. Recueillir soigneusement la couche leucocytaire de chaque tube (Figure 1) à l' aide d' une pipette en plastique stérile et le mettre dans un autre tube.Éviter la collecte de la solution de gradient de densité. Le rendement PBMC attendu est d' environ 3-4 x 10 6 cellules / mL de sang.

Figure 1
Figure 1: gradient de densité Centrifugation de Coat Bbuffy sur Ficoll Solution. On a représenté le résultat de la centrifugation en gradient de densité à 2 500 g pendant 30 minutes sur de la solution de gradient de densité. Sont représentés les erythrocytes et les granulocytes (rouge), la fraction de cellules mononucléaires (couche blanche), le plasma (jaune) et la solution de gradient de densité (blanchâtre). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Diluer la fraction de cellules mononucléaires du sang périphérique avec au moins 3 volumes de PBS et mélanger. Centrifuger à température ambiante pendant 15 min à 200 x g.
  2. Répétez l'étape 2.6 à deux reprises. </ Li>
  3. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 5 milieu MV2 mL.
  4. Ajouter 100 ul d'anticorps anti-CD34 humain (suffisant pour traiter jusqu'à 5 x 10 8 cellules) par la couche leucocytaire et utilisé en rotation pendant 15 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  5. Ajouter 50 ul de billes magnétiques revêtues de dextrane par la couche leucocytaire et utilisé en rotation pendant 10 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  6. Après incubation, transférer la suspension dans des tubes FACS avec un maximum de 3 ml dans chaque tube. Des quantités plus élevées ne seront pas admissibles à l'aimant.
  7. Insérer le tube (s) FACS dans l'aimant (s) et attendre 5 min.
  8. Rejeter le surnageant sans tirer les tubes FACS sur l'aimant.
  9. Resuspendre les cellules dans chaque tube FACS avec 3 milieu MV2 mL à l'extérieur de l'aimant.
  10. Répétez les étapes deux fois de 2,12 à 2,14.
  11. Tirer les tubes FACS sur des aimants et remettre les cellules en 3 milieu MV2 mL.
  12. Transférer la suspension cellulaire dans pré-enduit T75 flasks et ajouter 17 mL MV2 moyen par flacon.
    NOTE: Le milieu doit être changé au bout de 3 jours. Après une semaine, les cellules montrent des structures de broche-like (figure 2) et sont prêts à utiliser. Pour un belvédère de l'isolement voir la figure 3.

Figure 2
Figure 2: Image microscopique des EPCs isolés. Montré est une image représentative de isolé précoce EPCs dans un flacon T75 avant détachement. Apparent est la structure de broche-like de l'EPC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: Organigramme Afficher la procédure EPC d'isolement. Représenté est un schéma, spectaclement les étapes individuelles du protocole d'isolement de l'EPC. Pour un protocole plus détaillée, voir la section 2 de la section de protocole.

3. Migration Assay

  1. Éliminer le milieu de EPCs dans le flacon T75.
  2. Laver avec 5 ml de PBS en agitant soigneusement.
  3. Retirer PBS et ajouter ml solution à 5 détachement cellulaire commercial. Attendez jusqu'à ce que les cellules sont détachées (vérifier sous un microscope). Accélérer le détachement en tapant soigneusement le fond du flacon.
  4. Lorsque les cellules sont décollées, ajouter rapidement 5 ml de milieu complet et MV2 transférer la suspension de cellules dans un autre tube.
  5. Centrifuger à 2000 xg pendant 5 min.
  6. Remettre en suspension les cellules dans du PBS et 5 à 10 ml centrifuge à nouveau à 2000 g pendant 5 min.
  7. Répétez l'étape 3.6.
  8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans MV2 milieu affamé (50.000 cellules dans 75 ul par transmigration bien sont nécessaires).
    REMARQUE: Quel système de migration est nécessaire dépend du type de cellule et le dosage. Il existe diff diamètres érents des pores et des tailles de plaques (nombre de puits). Pour EPCs une taille de pores de 5 um de 96 puits système est optimal.
  9. Préparer la plaque de migration en ajoutant 235 pi de l'échantillon de sérum (sérum dilué 1: 5 dans MV2 de milieu affamé) dans la chambre inférieure (figure 4).

Figure 4
Figure 4: Migration Assay dans une chambre de Boyden modifiée. Montré est la conception générale d'une chambre de Boyden modifiée. Les inserts de culture cellulaire (= chambre haute) sont indiqués en bleu foncé et sont insérés dans la chambre inférieure. Le fond (mais pas les murs) de ces inserts représente le système de filtre comprenant des pores. (A) Affiche la configuration au point zéro de temps. (B) Après un point de temps choisi, les cellules sont migrés à travers le filtre vers un stimulus.fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Ajouter l'insert, peu avant l'ajout de la solution de la cellule.
  2. Ajouter 75 ul de la solution de cellules (= 50.000 cellules) dans la chambre supérieure.
  3. Laissez le EPCs migrer pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 (temps de migration dépend du type et du système cellulaire).
    1. Pour éviter sérum artefacts auto-fluorescence, de quantifier les cellules migrées en prenant des photos du puits sous un microscope et compter les cellules en utilisant le logiciel semi-automatisé "ImageJ".
  4. Retirer la chambre supérieure (contenant toutes les cellules non-migrés).
  5. Ajouter 70 uL solution de paraformaldéhyde de 3,6%, y compris le colorant Hoechst (dilué 1: 1000). La plaque peut être conservée à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant une nuit.
  6. Centrifuger la plaque peu pour obtenir toutes les cellules dans le même plan focal à 2000 xg pendant 1-2 min.
  7. Prendre 5 photos par wEll (figures 5 et 6) avec un grossissement de 100x.

Figure 5
Figure 5: Schéma montrant la position des images prises. Le schéma représente la position des cinq images prises, qui sont nécessaires pour la détermination de cellules ayant migré par rapport au puits. Les photos sont prises pour compter les cellules et calculer une valeur moyenne pour chaque bien. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Image microscopique pour la cellule Quantification. Montré est une image représentative, qui a été prise pour la quantification des cellules. Les cellules ont été colorées et fixées using Hoechst colorant dans 3,6% de paraformaldehyde. Les points représentent fixées et colorées des cellules progénitrices endothéliales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Compter les cellules migrées en utilisant le logiciel semi-automatisé "ImageJ" par l'Institut national de la santé.

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Representative Results

Caractérisation des cellules progénitrices endothéliales isolées

Tout d'abord, l'absorption de acLDL a été vérifiée, ainsi que l'expression de KDR, et CD31 sur la surface de la population cellulaire isolée. Comme la figure 7a montre, 85,1% des EPCs isolés a montré une absorption de acLDL et exprimé CD31. Les figures 7b et 7c montrent en outre une répartition homogène des deux marqueurs, bien qu'il semble y avoir une population plus petite, négative pour les deux marqueurs. Dans une deuxième étape, l'analyse FACS de acLDL en combinaison avec KDR a été réalisée. La figure 8a montre que plus de 80% des cellules isolées a montré une absorption de acLDL et l'expression de KDR sur leur surface. Figures 8b et 8c montrent l'homogénéité de ces marqueurs.

Pour vérifier le importance de plats revêtues de fibronectine pendant le temps de la culture, une comparaison des trois marqueurs entre les cellules isolées après deux jours de culture sur une surface de fibronectine avec EPCs isolés après sept jours de culture sur des boîtes revêtues de fibronectine (comme indiqué dans notre protocole) a été réalisée, à la fois avec CD34 précédente + -selection. Comme on le voit sur la figure 9a, seuls 46,4% des cellules de deux jours de culture a montré une absorption de acLDL ainsi que l'expression de CD31 sur leur surface, comparativement à 85% des cellules après sept jours de culture sur la fibronectine. En outre, les histogrammes (figures 9b et 9c) montrent moins d' intensité des deux marqueurs après deux jours de culture par rapport à sept jours (figures 7b et 7c). La même chose est vraie pour une combinaison de marqueurs et acLDL KDR. Après deux jours de culture sur la fibronectine, seuls 68,0% des cellules ont présenté une absorption de acLDL ainsi que l'expression de KDR sur leur surface (figs 10a-10c). Après sept jours de culture sur la fibronectine, 83,6% des cellules ont montré une absorption de acLDL et l' expression de KDR sur leur surface (figures 8a à 8c).

Dans une étape suivante, l'importance du CD34 -selection pendant l'isolement du CPE a été évaluée. Par conséquent, les cellules sélectionnées conformément au présent protocole, y compris la centrifugation en gradient de densité et de sept jours de culture sur la fibronectine, mais qui ont manqué le CD34 + -selection ont été isolés. Comme le montre la figure 10a, plus de 18% de toutes les cellules isolées ne font ni CD31 expresse ni montrer une absorption de acLDL, contre moins de 8% après CD34 + -selection, qui montrent une expression de CD31 et une absorption de acLDL (figure 7a) . En outre, les figures 11b et 11c montrent que les cellules isolées sont très inhomogène en ce qui concerne les deux marqueurs par rapport à la relative 7c montrant les mêmes marqueurs dans une population de cellules avec des cellules CD34 + -selection précédente.

Taux sériques de cytokine pendant la chirurgie cardiaque

Afin d' identifier l'influence de la chirurgie cardiaque après un infarctus du E / R sur les concentrations des taux circulants de MIF, CXCL12, CXCL8 et VEGF sérum, des échantillons de sérum ont été établis avant et intra-opératoire pour l'analyse ultérieure par disponible dans le commerce ELISA (figure 12) . Taux de MIF sériques ont montré une augmentation significative peropératoire par rapport aux valeurs de référence (100,3 ng / mL par rapport à 127,4 ng / ml, p = 0,027). De même, les niveaux CXCL12 ont montré une augmentation significative dans le sérum au cours de l' intervention chirurgicale (0,101 ng / mL par rapport à 0,198 ng / ml, p = 0,011). Semblable à MIF et CXCL12, CXCL8 augmenté de façon significative au cours de l' intervention chirurgicale (0,15 ng / mL contre 0,3 ng / ml, p = 0,022). En suiterast, les concentrations de VEGF n'a pas montré de changements importants au cours de la période d'observation (0,154 ng / mL par rapport à 0,134 ng / ml, p = 0,583) 1.

Capacité de migration des cellules endothéliales progénitrices

Pour étudier l'effet direct des échantillons de sérum de patients' et qui y sont contenues cytokines / chimiokines / facteurs angiogéniques sur la migration de l' EPC, un essai ex vivo de migration en utilisant des échantillons de sérum, qui ont été établis avant et pendant la chirurgie, a été réalisée. EPCs ont été isolés chez des volontaires sains. Comme le montre la figure 13, le taux de migration des EPC a augmenté de manière significative vers les échantillons peropératoire prises par rapport aux échantillons prélevés-opératoire pré (+ 35% par rapport à la ligne de base, p = 0,047).

Comme les études précédentes déjà démontré que I / R déclenche une sécrétion de sevcytokines rales qui modulent la chimiotaxie de leucocytes et de la migration, des tests de migration utilisant ces chemoattractants potentiels, y compris MIF, CXCL12, CXCL8, et le VEGF ont été réalisées. Pour obtenir une meilleure compréhension de l'influence de ces cytokines sur le recrutement de l' EPC in vivo, dans des expériences supplémentaires de migration in vitro, en appliquant les concentrations mesurées physiologiquement des cytokines ci - dessus à la chambre basse de la migration des dispositifs ont été réalisés, aussi.

Que les concentrations sériques de MIF entre 100 et 130 ng / ml ont été mesurées (Figure 12), une concentration de 100 ng / ml de MIF recombinant a été utilisé, ce qui conduit à une augmentation> 6 fois de la migration de la CBE par rapport au milieu témoin ( la figure 14). Par contraste, les concentrations sériques de CXCL12, CXCL8, et le VEGF sont dans la gamme de 150-300 pg / ml. À noter que ces concentrations ne médiatisent aucun effet sur la migration des EPC in vitro(Figure 14). Il est donc concevable que , parmi ces quatre cytokines, MIF présente l'influence relative la plus forte sur la migration des EPC in vivo 1.

Figure 7
Figure 7: Analyse FACS de EPCs isolés le jour 7. (a) Montré est l'absorption de acLDL et CD31 expression de surface cellulaire de EPCs isolés après CD34 + sélection et la période de culture de 7 jours sur la vaisselle revêtues de fibronectine. En haut à gauche: Les cellules montrent l'absorption de acLDL, mais n'expriment CD31. En haut à droite: Les cellules montrent l'absorption de acLDL et expriment CD31. En bas à gauche: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL et ne reflètent pas CD31. En bas à droite: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL, mais expriment CD31. (B) Montré est l'histogramme de PE conjugué acLDL après absorption par EPCs isolées. (C) Montré est l'histogramme de FITC-conjugated anticorps après liaison à CD31 CD31 de surface cellulaire de EPCs isolées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Analyse FACS de EPCs isolés le jour 7. (a) Montré est l'absorption de acLDL et KDR expression de surface cellulaire de EPCs isolés après CD34 + sélection et la période de culture de 7 jours sur la vaisselle revêtues de fibronectine. En haut à gauche: cellules montrent l'absorption de acLDL, mais ne reflètent pas KDR. En haut à droite: Les cellules montrent l'absorption de acLDL et expriment KDR. En bas à gauche: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL et ne reflètent pas KDR. En bas à droite: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL, mais expriment KDR. (B) Montré est l'histogramme de PE conjugué acLDL après absorption par EPCs isolées. (C) Montré est lehistogramme des anticorps conjugués au FITC KDR après liaison à KDR de surface cellulaire de EPCs isolées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Analyse FACS de EPCs isolés le jour 2. (a) Montré est l'absorption de acLDL et CD31 expression de surface cellulaire de EPCs isolés après CD34 + sélection et la période de culture de 2 jours sur les plats revêtues de fibronectine. En haut à gauche: cellules montrent l'absorption de acLDL, mais n'expriment CD31. En haut à droite: Les cellules montrent l'absorption de acLDL et expriment CD31. En bas à gauche: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL et ne reflètent pas CD31. En bas à droite: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL, mais expriment CD31. (B) Montré est l'histogramme de PE conjugué acLDL après absorption par EPCs isolées. ( S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10: Analyse FACS de EPCs isolés le jour 2. (a) Montré est l'absorption de acLDL et KDR expression de surface cellulaire de EPCs isolés après CD34 + sélection et la période de culture de 2 jours sur les plats revêtues de fibronectine. En haut à gauche: cellules montrent l'absorption de acLDL, mais ne reflètent pas KDR. En haut à droite: Les cellules montrent l'absorption de acLDL et expriment KDR. En bas à gauche: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL et ne reflètent pas KDR. En bas à droite: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL, mais expriment KDR. (B) Montré est l'histogramme de PE-conjugué acLDL après absorptionpar EPCs isolés. (C) indiqué est un histogramme des anticorps conjugués au FITC après liaison à KDR KDR surface cellulaire de EPCs isolées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11
Figure 11: Analyse FACS de EPCs isolés le jour 7. (a) Montré est l'absorption de acLDL et CD31 expression de EPCs isolées de la surface cellulaire sans CD34 précédente + sélection, mais y compris la période de plats revêtues de fibronectine de culture de 7 jours. En haut à gauche: Les cellules montrent l'absorption de acLDL, mais n'expriment CD31. En haut à droite: Les cellules montrent l'absorption de acLDL et expriment CD31. En bas à gauche: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL et ne reflètent pas CD31. En bas à droite: Les cellules ne montrent aucune absorption de acLDL, mais expriment CD31. (B) Montréest l'histogramme de PE conjugué acLDL après absorption par EPCs isolées. (C) indiqué est un histogramme des anticorps CD31 conjugué à FITC après liaison à CD31 de surface cellulaire de EPCs isolées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 12
Figure 12: taux sériques de cytokine pendant la chirurgie cardiaque. La mesure des concentrations sériques de la CXCL8, le VEGF, CXCL12, et le MIF des patients qui ont subi une chirurgie cardiaque en utilisant la méthode ELISA. Montré sont des valeurs moyennes de pré-opératoire par rapport à des concentrations intra-opératoires ± SEM (*: p <0,05; vs pré-OP)

Figure 13
Figure 13: In Vitro Migration de EPCs Vers le sérum du patient. Montré est l'augmentation intra-opératoire dans la migration des EPC des volontaires en bonne santé à l'égard des échantillons de sérum de patients, qui ont subi une chirurgie cardiaque. 50.000 cellules par puits dans le milieu MV2 sérum affamés ont été ajoutés à la chambre supérieure d'un système Transwell. Les échantillons de sérum dans la chambre inférieure ont été diluées 1: 5 avec le même milieu. Les cellules ont migré pendant 3 h à 37 ° C et 5% de CO 2 à travers une membrane 5 um. Les barres représentent les valeurs moyennes ± écart-type (*: p <0,05)

Figure 14
Figure 14: In Vitro Migration de EPCs Vers recombinant Cytokines. Montré est la migration des EPCs vers des concentrations représentatives de CXCL8 recombinant, CXCL12, VEGF et MIF par rapport à milieu sérique de faim (= Baseline). Seulement MIF a puà la médiation d'une migration accrue EPC à des concentrations physiologiquement mesurées. Les cytokines recombinantes ont été dilués dans du sérum MV2 moyen affamé. Les cellules ont migré pendant 3 h à travers une membrane de 5 um. Les barres représentent les valeurs moyennes ± écart - type (**: p <0,01 par rapport au sérum du milieu de faim)

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Discussion

La première partie de cette étude a porté sur l'isolement des EPCs humains du sang périphérique de volontaires sains afin de permettre une évaluation complète du sang de patients de chirurgie cardiaque. Par conséquent, une centrifugation à gradient de densité a été effectuée pour séparer la fraction de PBMC à partir du plasma, des granulocytes et des globules rouges. Pour supprimer la plupart des plaquettes contaminantes, cette fraction cellulaire a été soumis à court et à laver lente étapes 29, 30. Ensuite, les cellules CD34 + ont été isolées à partir de la fraction restante pour séparer les cellules progénitrices de lymphocytes restants, et les monocytes. Enfin, la suspension cellulaire a été mis en culture sur des boîtes revêtues de fibronectine dans un milieu de croissance de cellules endotheliales disponibles dans le commerce pour séparer les cellules progénitrices endothéliales d'autres (précurseurs) , les cellules de la lignée myéloïde 3. Fait à noter, il est discuté que les plaquettes peuvent présenter une surface cellulaire CD34 expression aussi. Bien que des études antérieures ont démontré la liaison de certains anticorps anti-CD34 à plaquettes, cela pourrait être un artefact dû à l'agrégation des plaquettes avec d' autres cellules (CD34-positif) 31, 32. Cependant, la plupart des plaquettes peuvent être séparées par des étapes de lavage répétées lentes. A côté de plaquettes, de leurs précurseurs - mégacaryocytes - n'expriment cet antigène des cellules progénitrices hématopoïétiques et pourraient être présents dans le sang périphérique, même si elles se trouvent principalement dans la moelle osseuse 33, 34. Par ailleurs, il est également décrit que le marqueur CD34 de surface cellulaire, utilisé dans ce protocole est exprimé à de très faibles niveaux sur des cellules endothéliales matures 35. Par conséquent, il est important de considérer avec prudence une éventuelle contamination par des plaquettes / mégacaryocytes ou des cellules endothéliales matures, lors de l'isolation EPCs. Par conséquent, l'étape 2.6 est particulièrement important au cours de la isolation de EPCs pour éliminer les plaquettes.

Afin de clarifier l'importance de la mise en culture des cellules isolées sur des boîtes revêtues de fibronectine, des populations de cellules au bout de deux jours et sept jours de culture sur la fibronectine ont été comparés à la fois avec une sélection CD34-positives précédent. Le deuxième jour, moins de la moitié des cellules isolées a montré une absorption de acLDL et l'expression simultanée de CD31 sur leur surface. En outre, une expression moins intense des deux marqueurs sur les histogrammes concernant pourrait être vu. Ces données montrent que sept jours de culture sur la fibronectine dans le milieu spécifique des cellules endotheliales sont nécessaires pour obtenir EPCs présentant des motifs caractéristiques d'expression endothéliales. Dans cette étape, il est d'une importance d'utiliser la concentration / bonne quantité de fibronectine. Wijelath et ses collaborateurs ont précédemment montré que la fibronectine favorise l'expression de motifs analogues à des cellules endothéliales, probablement en association avec le VEGF 36.

Dans la prochaine èreep du protocole, on a étudié l'importance de CD34 + -selection de la suspension cellulaire, en comparant des cellules isolées après 7 jours de culture sur des boîtes revêtues de fibronectine, avec et sans CD34 précédente + -selection. La quantité de cellules manquantes des deux marqueurs (acLDL absorption et l' expression de CD31) était beaucoup plus élevée après l' isolement des cellules CD34 sans précédent + -selection par rapport à l' isolement , y compris cette étape. Il est intéressant de CD34, après sept jours de culture sur la fibronectine, les cellules manquantes + -selection a montré une population de cellules moins homogène, comme indiqué par l'expression de CD31 inhomogène par rapport à des cellules isolées, des cellules CD34 + -selection. Ces données montrent que les cellules CD34 + -selection est nécessaire de trier EPCs d'autres monocytes / macrophages. Au cours de la mise en place de ce protocole, nous avons constaté que CD34 + -selection en milieu MV2 à 37 ° C conduit à une augmentation du nombre de cellules survivantes, par rapport à te beaucoup plus faiblemperatures, qui doit être prudemment étudié dans les études futures. Nous devons reconnaître que lors de l'application de ce protocole, l'incubation d'anticorps dans un milieu contenant du calcium à 37 ° C peut conduire à des interactions non-spécifiques et contraignantes. À l'avenir, les systèmes tampons qui manquent de calcium à des températures plus basses doivent être testés et mis en place pour éviter ce facteur de confusion potentiel.

Notamment, au cours de notre analyse préliminaire des expériences de migration de cellules avec des échantillons de sérum, les mesures ont été effectuées à l' aide d' un lecteur de microplaques à fluorescence et la calcéine-coloration des cellules, comme décrit précédemment pour les différents types de cellules (par exemple des cellules ombilicales humaines de veine endothéliales HUVEC) 37. Les différentes valeurs d'extinction entre les chambres est indiqué que non seulement les échantillons de sérum seul, mais également le milieu ont déjà une influence remarquable sur la fluorescence mesurée, ce qui doit être considéré avec précaution. Par conséquent, we adapté notre protocole et est passé à un système de mesure dans lequel les cellules peuvent être observées par microscopie optique et comptées par un logiciel semi-automatisé.

Bien que EPCs représentent environ 0,1% des cellules dans le sang périphérique et il est difficile d'isoler ces cellules spécifiques 38, un nombre impressionnant d'études a indiqué que EPCs peut fournir des effets bénéfiques et améliorer la vascularisation des tissus après des événements ischémiques dans les membres et dans le myocarde 39 , 40. Pourtant, il est encore un défi permanent pour traduire ces résultats dans la pratique clinique et d'évaluer sa pertinence clinique. Les raisons peuvent être dues à l'influence notable de nombreux facteurs périopératoires sur la sécrétion de différentes substances chimiotactiques, qui a été précédemment montré 22, 41. Par conséquent, dans la deuxième partie de cette étude, le rôle des différents cytokines sur la migration des EPCs dans le cadre de l'infarctus du I / R ont été évalués. Par conséquent, les concentrations sériques de cytokines chez des patients de chirurgie cardiaque ont été mesurés. MIF, ainsi que CXCL12 et CXCL8 ont montré une augmentation significative peropératoire. Lors de la traduction de ces résultats dans les expériences in vitro, les résultats actuels ont démontré qu'il n'y a ni un CXCL12- ni effet CXCL8 médiée sur la migration de l' EPC aux concentrations physiologiques mesurées in vitro. En utilisant le modèle d'isolement de l' EPC décrit et l'essai de migration ultérieure, le MIF a été identifiée comme un médiateur de la migration prédominante EPC 42. Dans ce contexte, Kanzler et al. démontrée dans un modèle expérimental chez la souris que MIF et VEGF fournissent l'effet le plus important sur la migration de l' EPC en hypoxie 23. Fait intéressant, les mesures de VEGF montrent qu'il n'y a pas de changement intra-opératoire significative des concentrations sanguines du VEGF, ce qui peut résulter de la liaison of VEGF à l'application peropératoire standardisée de l'héparine. Par conséquent, le MIF peut jouer un rôle prédominant parmi les chimiokines angiogéniques dans le recrutement de EPCs chez les patients de chirurgie cardiaque et peut initier et contribuer au processus de guérison après un infarctus du I / R par le trafic de EPCs au site de la lésion 43, 44 Pourtant, comme niveaux MIF ont augmenté immédiatement après l' infarctus du I / R, il reste spéculative si l'effet MIF médiée sur le recrutement de EPCs peut influencer le remodelage et l' angiogenèse cardiaque, qui ont des implications importantes dans la prévention de l' insuffisance cardiaque après un infarctus du I / R 23. Cependant, avant de passer à une telle analyse, il est important de caractériser les différents sous-types de CPE et d'évaluer le rôle fonctionnel dans la biologie humaine. A cet égard, le présent protocole fournit une méthode fiable sur la manière d'isoler EPCs à partir du sang périphérique humain pour permettre à its caractérisation plus complète et les études futures.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs ont pas accusés de réception.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

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Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

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