Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

Résumé

des cellules progénitrices endothéliales (EPCs) sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. Cette méthode décrit l'isolement de EPCs humains provenant du sang périphérique, ainsi que l'identification de leur potentiel migratoire avec des échantillons de sérum de patients de chirurgie cardiaque.

Résumé

les cellules progénitrices endothéliales (EPC) sont recrutés dans la moelle osseuse dans des conditions pathologiques comme l'hypoxie et sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. L'origine, la classification et la caractérisation des EPCs sont complexes; nonobstant, deux sous-types importants de EPCs ont été établis: soi-disant «précoce» EPCs (par la suite appelés premiers-EPCs) EPCs et tardive excroissance (fin-EPCs). Ils peuvent être classés par propriétés biologiques, ainsi que par leur apparition au cours de la culture in vitro. Alors que EPCs «précoces» apparaissent en moins d'une semaine après la culture de cellules mononucléaires dérivés du sang périphérique dans les médias communautaires spécifiques, EPCs tardive excroissance se trouvent au bout de 2-3 semaines. EPCs tardive excroissance ont été reconnus pour être directement impliqués dans la néovascularisation, principalement par le biais de leur capacité à se différencier en cellules endothéliales matures, alors que «précoce» EPCs expriment divers facteurs angiogéniques comme endogencargaison ous pour promouvoir l'angiogenèse d'une manière paracrine. Au cours de l'infarctus ischémie / reperfusion (I / R), divers facteurs contrôlent le homing des PEC à des régions de formation des vaisseaux sanguins.

Macrophage facteur inhibiteur de la migration (MIF) est une cytokine pro-inflammatoire et ubiquitaire chimiokine-like et a récemment été décrit pour fonctionner comme régulateur clé de la migration EPCs à des concentrations physiologiques ^1. Fait intéressant, le MIF est stocké dans les piscines intracellulaires et peut rapidement être libéré dans la circulation sanguine après plusieurs stimuli (par exemple , infarctus du myocarde).
Ce protocole décrit un procédé pour l'isolement fiable et la culture précoce EPCs à partir de sang périphérique humain adulte basé sur la sélection de cellules CD34-positives à la culture subséquente dans un milieu contenant des facteurs de croissance endothéliaux sur des plaques revêtues de fibronectine pour une utilisation dans des essais in vitro de migration dans contre des échantillons de sérum des patients de chirurgie cardiaque. En outre, lainfluence migratoire de MIF sur la chimiotaxie de EPCs par rapport à d'autres cytokines de l'angiogenèse stimulant bien connu est démontrée.

Introduction

Les cellules progénitrices endothéliales (EPC) circulent dans le sang humain et ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales ^2. Ils participent à la vasculogenèse et sont capables de minimiser les dommages causés par l' inflammation et l' ischémie / reperfusion (I / R) , les blessures de diverses manières ^{3, 4.} Par exemple, EPCs montrent des niveaux élevés d'enzymes antioxydantes intracellulaires comme la catalase, la glutathion peroxydase ou superoxyde dismutase manganèse (MnSOD) ^5. La résistance élevée contre le stress oxydati....

Protocole

Du sang pour l'isolement des EPCs a été obtenu à partir de volontaires sains après consentement éclairé en conformité avec le comité d'éthique local. Des échantillons de sérum utilisés dans les tests de migration ont été obtenus chez des patients ayant subi une chirurgie cardiaque classique avec l'utilisation d'un pontage cardio-pulmonaire (CPB). Les critères d'exclusion étaient les opérations d'urgence, la grossesse connue ou soupçonnée, patient`s âge de moins de 18 ans, et l'impossibilité d'obtenir un consentement éclairé. Des échantillons de sérum ont été tirées en plus des mesures de routine clinique (immédiatement avant l'inte....

Résultats

Caractérisation des cellules progénitrices endothéliales isolées

Tout d'abord, l'absorption de acLDL a été vérifiée, ainsi que l'expression de KDR, et CD31 sur la surface de la population cellulaire isolée. Comme la figure 7a montre, 85,1% des EPCs isolés a montré une absorption de acLDL et exprimé CD31. Les figures 7b et 7c montrent en outre une répartition homogène .......

Discussion

La première partie de cette étude a porté sur l'isolement des EPCs humains du sang périphérique de volontaires sains afin de permettre une évaluation complète du sang de patients de chirurgie cardiaque. Par conséquent, une centrifugation à gradient de densité a été effectuée pour séparer la fraction de PBMC à partir du plasma, des granulocytes et des globules rouges. Pour supprimer la plupart des plaquettes contaminantes, cette fraction cellulaire a été soumis à court et à laver lente étapes ^2.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Revêtement des flacons T-75
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Milieu de croissance des cellules endothéliales MV2	Promo Cell	C-22221
Milieu de croissance des cellules endothéliales MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Densité de centrifugation
EasySep humain CD34 positif Kit de sélection	Stemcell Technologies	18056	Isolement de cellules CD34+
Aimant EasySep	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Détachement de cellules
Corning HTS transwell 96 supports perméables	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Système de migration
Solution Hoechst	ThermoFisher	33342	Coloration des cellules migrées
ImageJ	National institutes of health	xxx	Comptage des cellules migrées