Summary
Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.
Abstract
Degeneratieve retinale ziekten zoals leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD) zijn de belangrijkste oorzaak van onomkeerbaar gezichtsverlies wereldwijd. AMD wordt gekenmerkt door de degeneratie van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen, die een monolayer van cellen functioneel ondersteunen en anatomisch verpakken rond het neurale netvlies. Huidige farmacologische behandelingen voor de niet-neovascular AMD (droge AMD) alleen vertragen de progressie van de ziekte maar niet herstellen visie, vergend studies gericht op het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën. De degeneratieve RPE cellen vervangen door gezonde cellen houdt belofte voor de behandeling van droge AMD in de toekomst. Uitgebreide Preklinische studies van stamcel vervangende therapieën voor AMD betrekken de transplantatie van stamcellen cel afkomstige RPE cellen in de subretinal ruimte van diermodellen, waarin de subretinal injectietechniek wordt toegepast. De meest gebruikte in deze preklinische dierstudies aanpak is door middel van de trans-scleral route, die wordt bemoeilijkt door het ontbreken van directe visualisatie van het einde van de naald en kan vaak leiden tot retinale schade. Een alternatieve benadering via het glasvocht zorgt voor directe waarneming van de naald oorspronkelijke eindpositie ligt, maar het draagt een hoog risico van chirurgische trauma's zoals meer oog weefsels worden verstoord. We hebben een minder riskant en reproduceerbare methode van gemodificeerde trans-scleral injectie die gebruikmaakt van gedefinieerde naald hoeken en diepten succesvol en consequent leveren RPE cellen in de rat subretinal ruimte en Vermijd sterke netvlies beschadiging ontwikkeld. Cellen die zijn geleverd op deze manier hebben eerder aangetoond doeltreffend in de Royal College of Surgeons (RCS) rat gedurende ten minste 2 maanden. Deze techniek kan worden gebruikt, niet alleen voor cel transplantatie, maar ook voor de levering van kleine moleculen of gentherapieën.
Introduction
Het menselijke netvlies gelegen aan de achterzijde van het oog-functies als een lichte zintuiglijke weefsel en speelt een cruciale rol in de perceptie van de visie. Netvlies cel dysfunctie of celdood daarom veroorzaakt visie problemen of permanente blindheid. Aandoeningen waarbij degeneratie of disfunctie van cellen in verschillende lagen van het netvlies staan bekend als retinale degeneratieve ziekten, waaronder AMD de meest voorkomende en de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid bij ouderen in ontwikkelde landen is 1,2. Het pathologisch proces van LMD wordt geassocieerd met "drusen" accumulatie tussen de RPE-laag en de onderliggende Bruch membraan, dat op zijn beurt RPE steun van fotoreceptor fysiologie schaadt, wat leidt tot neurale atrofie van het retinale en visie verlies3, 4,5. Tot dusver is er geen remedie voor geavanceerde droge AMD (niet-neovascular). De opkomst van stamcel therapie als een nieuw paradigma in regeneratieve geneeskunde brengt de hoop de disfunctionele of dode RPE cellen te vervangen door gezonde cellen afgeleid van stamcellen. Sterker nog, uitgebreide Preklinische studies van verplanten stamcellen (b.v., menselijke embryonale stamcellen)-afgeleide cellen RPE RPE-degeneratieve diermodellen geweest uitgevoerd6,7, waarvan sommige hebben stapte over naar de klinische proeven8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Onlangs, een alternatieve bron van stamcellen die inwoner in de menselijke RPE laag, de menselijke RPE stamcellen (hRPESCs), door onze lab werd geïdentificeerd en wordt momenteel gebruikt in preklinische studies van hRPESC afgeleid-RPE cel (hRPESC-RPE) transplantatie therapie voor AMD 10 , 11 , 12 , 13.
De subretinal injectietechniek wordt toegepast in de preklinische studies die hierboven vermeld door meerdere groepen, met inbegrip van onze fractie. Er zijn twee algemene benaderingen voor subretinal injectie in dieren: trans-vitreal en trans-scleral. De trans-vitreal-aanpak heeft het voordeel van de chirurg zijnde kundig voor het einde van de naald direct observeren doordringt het anterior oog staat, kruist de hele vitreal holte grenzend aan de lens, en dringt het netvlies aan de achterkant met het oog op het bereiken van de subretinal ruimte14,15,16. Nochtans, vereist het verstoren van het netvlies op twee locaties (anterior en posterior), draagt het risico van beschadiging van de lens, en kan resulteren in terugvoer van cellen in het glasvocht wanneer de naald wordt teruggetrokken. In tegenstelling, de trans-sclera-benadering, in principe, vermijdt betrokkenheid van de retina en glasvocht en terugvoer verlaat het oog. In gepigmenteerde knaagdieren, de chirurg kan aanvankelijk penetratie van de sclera observeren, maar na de passage in de gepigmenteerde vaatvlies, het einde van de naald is niet meer zichtbaar. Zonder directe observatie, overtredingen van het netvlies is gebruikelijk en kan leiden tot retinale dissectie en levering van cellen en/of bloed in het glasvocht. Bovendien, omdat het oog oppervlak is gebogen, het is zeer moeilijk om te weten welke naald hoeken en diepten zijn het meest effectief voor trans-scleral injecties.
In dit gevisualiseerde artikel introduceren we een methode van de trans-scleral subretinal injectie op de hoogte gebracht door het gebruik van post chirurgische evaluaties met optische coherentie tomografie (OCT), waarmee een gedetailleerd onderzoek van de injectieplaats. Onze trans-scleral injectietechniek maakt gebruik van gedefinieerde locaties, hoeken en diepten voor injectie naalden tot zeer lage chirurgisch trauma en hoge betrouwbaarheid. Hier tonen we specifiek de injectie van hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte van de RCS rat, een pre-klinische model van menselijke AMD. Met deze methode injectie verlost we succesvol en consequent hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte van RCS rat ogen met een zeer hoog slagingspercentage. Injectie van cellen bleek eerder leiden tot behoud van de RCS-researchdieren ten minste 2 maanden na injectie13. Deze procedure wordt uitgevoerd onder de Microscoop ontleden en is eenvoudig te leren. Het vereist twee mensen (een chirurg en een assistent) voor het uitvoeren van de injectie en de gemiddelde tijd van injectie voor elk dier is minder dan 5 minuten. De gedefinieerde hoeken en diepten voor injectie naalden maken het mogelijk voor laboratoria, waar OCT niet beschikbaar is, om succesvolle subretinal injectie. Het zorgt voor zeer reproduceerbaar subretinal toegang en kan worden gebruikt, niet alleen voor cel transplantatie, maar ook voor drug delivery en gen-therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de State University of New York in Albany.
1. vóór injectie voorbereiding
-
Voorbereiding van een hRPESC-RPE celsuspensie
Opmerking: Al de volgende stappen worden uitgevoerd in steriele weefselkweek kap en vertrouwdheid met steriele basistechniek is vereist.- Primaire hRPE cellen isoleren van menselijke donor ogen leeftijd 50-90 jaren en cultuur cellen in 24-Wells-platen12. Cryopreserve van de cellen bij passage 1, dooi desgewenst en cultuur passage 2 (P2) cellen voor 4-5 weken (figuur 1A) voor injectie.
- Verwijder het kweekmedium12 en voorzichtig spoelen wells tweemaal met 500 µL vooraf opgewarmd 1 X Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Calcium & Magnesium (1 x DPBS-CMF) door toevoeging van 1 X DPBS-CMF in putjes met behulp van een precisiepipet 1.000 µL en verwijderen met behulp van een vacuüm.
- 300 µL trypsine/DNAse toevoegen aan elk putje. Incubeer de cellen van de hRPESC-RPE in trypsine/DNAse (4 kU DNase per 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA) gedurende 4 minuten bij 37 ° C te distantiëren van de cellen.
- Controleer de cellen onder de Microscoop om te zien of ze hebben afgerond. Incubeer de cellen in trypsine/DNase voor een extra 2 min als ze niet nog hebben afgerond blijven.
- Zodra de cellen worden naar boven afgerond, gebruik een pipet 1.000 µL triturate de vrijstaande cellen uit de put en de overdracht van de trypsine/DNase met vrijstaande cellen in een buis 15 mL kegelvormig met gelijke hoeveelheid voorverwarmde kweekmedium, naar de inactivering van de trypsine/DNase.
- Spoel putjes met voorverwarmde 1 X DPBS-CMF zachtjes op en neer, waarbij met name rond de randen van de put; deze cellen vervolgens toevoegen aan de vorige conische buis.
- Centrifugeer de conische buis bij 286 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 1 mL gestolde voedingsbodem.
- Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
- Centrifugeer bij 286 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in steriele evenwichtig zout oplossing (BSS) op 50.000 cellen/µL (te leveren 50.000 cellen in 1 µL volume tijdens subretinal injectie).
- Breng de definitieve celsuspensie (CS) in een microcentrifuge van 1,7 mL tube en blijven in een mengsel van ijs-water tot gebruik van de injectie.
-
Voorbereiding voor cel injector
- Plaats een steriele 33-gauge schuine naald in de injectiespuit en schroef strak te monteren de injector.
- Spoel de injector met 100% ethanol 5 - 6 keer.
- Spoel de injector met 70% ethanol 5 - 6 keer.
- Spoel de injector met BSS 5 - 6 keer.
- Markeer de injector naald met een steriele zwarte viltstift op een positie van 600 µm afstand van het puntje van de naald onder de ontleden Microscoop (figuur 1B).
- Plaats de injector op een micromanipulator voor injectie.
2. subretinal injectie
-
Chirurgische gebied en dierlijke voorbereiding
- Weeg een 4-5 week oud RCS rat (60-100 g) en anesthetize met behulp van het uitvoeringssysteem van Isofluraan damp.
Opmerking: Voor het opwekken van anesthesie houden het Isofluraan debiet op 5%. Bevestig de diepte van de verdoving door te drukken op de poten, en dan het debiet te verminderen tot 2-3% voor onderhoud van de verdoving tijdens de operatie. - Plaats een steriele chirurgie-gordijn, met een verwarming pad onder, op het podium van het ontleden Microscoop om te een steriele chirurgische instelgebied.
- De rat overbrengen in het chirurgische gebied en plaats van de rat in een neus kegel aangesloten op de Isofluraan systeem te handhaven van de verdoving.
- Dekking van de rat lichaam met gaas. Knijp de rat's teen om te bevestigen de volledige verdoving.
- Weeg een 4-5 week oud RCS rat (60-100 g) en anesthetize met behulp van het uitvoeringssysteem van Isofluraan damp.
-
Trans-scleral subretinal injectie onder de Microscoop
- Breng een druppel oog smeermiddel op de rat unoperated oog.
- Plaats de rat op zijn rechterkant met haar linkeroog geconfronteerd met het plafond voor injectie, haar hoofd naar de surgeon's rechterhand en haar terug naar de chirurg.
- Elke snorharen die betrekking hebben op het oog met een kleine schaar te trimmen.
- Een kleine hoeveelheid ogen wassen van de temporele kant van het linker oog te druppelen en het verzamelen van de overmaat aan de neus zijkant met een applicator katoen te spoelen van het oog.
- De pupil verwijden met 1% tropicamide en 2,5% phenylephrine (vers gemaakt van 10% phenylephrine door het in steriele zoutoplossing 0,9% verdunnen op de dag van de operatie) voor een na injectie OCT examen door toepassing van een druppel van elk.
- Trek voorzichtig de huid rondom het oog 4 - 6 maal te openen van het ooglid, zodat het oog iets proptosed voor gemakkelijkere toegang tot de regio's aan de limbus posterior is.
- Toepassing van een daling van eye wash en houd het oogje vochtig.
- Zachtjes triturate de CS (bereid in stap 1.1.12) en laadt u de injector met 1.2 µL CS. De extra 0.2 µL wordt gebruikt voor het compenseren van injectie terugvoer.
Opmerking: Op basis van onze metingen, over 5,000-8,000 cellen zijn verloren in de terugvoer met een injectie van 50.000 cellen/µL die gelijk is aan ongeveer 10-16% van cel verlies en een extra van 0.2 µL CS werd geïnjecteerd ter compensatie van het verlies van deze cel. - Plaats de injector gevuld met CS op een micromanipulator (of hebt een assistent die houden) verticaal als RPE cellen neiging om gemakkelijk te zinken in suspensie.
- Een daling van 0,5% proparacaine (lokale topische verdoving) van toepassing op het oog en verwijder de overmaat met een applicator katoen.
Opmerking: Deze stap moet onderdrukken het hoornvlies reflex en dat het oog knippert tijdens opeenvolgende stappen. - Gebruik pincet greep het bindvlies posterieure aan de limbus, nasally draaien van het oog en til het bindvlies zodat een "tent".
- Gebruik schaar te snijden de bovenkant van de "tent" uit te maken van een kleine opening in het bindvlies en bloot de onderliggende sclera.
- Pincet kunt op de rand van de resterende marge van het bindvlies naast de limbus grip en het oog nasally draaien zodat de bestaat as onder een hoek van ongeveer 30 graden ten opzichte van de bovenkant van de tabel (Figuur 1 c is). Voortdurende aangrijpend van het bindvlies marge is nodig om een contra kracht tijdens naald invoegingen en om het oog op een optimale hoek.
- Als u wilt een pilot gat voor cel injectie, plaatst u het einde van een naald steriel schuine 31-gauge insuline op 1200-1500 µm posterieure aan de limbus met de opening van het puntje naar boven.
- De hoek van de insuline naald zodanig aanpassen dat het is 10-15 graden boven de sclera (tangentiële aan een denkbeeldige vlak op de beoogde injectieplaats). Penetreren langzaam de sclera-vaatvlies complex tot een diepte van de naald van ongeveer 500 µm. In de gepigmenteerde rat verdwijnt het einde van de naald' ' onder de gepigmenteerde vaatvlies. Voor het merk van insuline naald gebruikt hier, is de afstand van het puntje van de naald tot de schuine kant 500 µm.
- Zorgvuldig trekken de naald van de insuline (een zeer kleine effusie van bloed kan worden gezien).
- Als overmatig bloeden is genoteerd, kan een speer oog worden toegepast om te wissen van het gat, indien nodig. Aanhoudende bloedingen achter de speer toepassing geeft aan een schip beschadigd zijn.
- Begeleiden de RPE cel-geladen injector naald in de pilot gat, met de opening naar beneden, en onder een hoek van ongeveer 10-15 graden ten opzichte van de lokale oppervlak van de sclera.
- Steek voorzichtig de injector naald in het pilot gat tot een diepte van ongeveer 500 µm voor toegang tot de subretinal ruimte. Er moet over een 100 µm marge tussen de rand van het zwarte pen merk en het punt waar de naald is bedekt door de gepigmenteerde vaatvlies (Figuur 1 c en 1 D).
- Vraag de assistent van zachtjes druk de plunjer van de injectiespuit te injecteren van het juiste volume van cellen (ongeveer 1.2 µL). Wees bereid om enige contra kracht als assistent persen op de plunjer.
Opmerking: Voorafgaande mock praktijk met de Office-assistent kan bieden zowel de chirurg als assistent met de nodige ervaring met deze stap. - Terwijl visueel gericht op de pen mark rand, de injector op zijn plaats voor 25-30 s houden en vervolgens langzaam het intrekken van de injector. Een kleine hoeveelheid van de Terugvloeiing wordt meestal waargenomen.
Opmerking: Indien geen terugvoer wordt waargenomen, kan zijn er een intravitreal injectie. Als u terugvoer via de zegel of cellen vullen onder de sclera ziet, was de injectie te ondiep. - Spoel de efflux van de cel van de injectieplaats met de steriele eye wash 3 keer en verzamelen de overmaat met een applicator katoen.
- Breng een druppel oog glijmiddel op het bediende oog en de rat overbrengen in de OCT station de locatie van de getransplanteerde cellen en de grootte van de subretinal bleb te onderzoeken.
3. na injectie behandeling
-
Anti-inflammatoire en pijn reliever behandeling
- Injecteren van buprenorfine op 0,1 mg/kg lichaamsgewicht in een zoutoplossing subcutaan te verminderen van de pijn.
- Injecteren dexamethason op 1,6 mg/kg lichaamsgewicht in een zoutoplossing door intraperitoneale injectie (I.P.) voor controle van de ontsteking.
-
Dierlijke herstel
- De rat terugkomen in de kooi herstel onder een warmte lamp te handhaven van de lichaamstemperatuur.
- Observeer de bediende oog voor tekenen van bloeding.
- Observeer de rat om ervoor te zorgen dat het komt uit de narcose.
- Het herstelde dier terug naar een verse kooi en markeren van de kooi met een kaartje van de chirurgie en controleren dagelijks op tekenen van nood, oogbeschadigingen en/of bloeding of hoornvlies opaciteit. De dierenarts hiervan onverwijld in kennis als er zorgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de techniek die in dit artikel beschreven we consequent geleverd hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte voor RCS rats door het juist beheersen van de locatie, de hoek en de diepte van de injector naald invoegen in het weefsel (figuur 1B-D ). Onmiddellijk volgende transplantatie, een OCT onderzoek werd uitgevoerd om de injectieplaats en de subretinal bleb gemaakt door de getransplanteerde cellen te nemen. Post chirurgische OCT evaluatie dient als een instrument van de screening voor de evaluatie van de kwaliteit van injecties en begeleiding in netvlies beschadiging of bloeding. Zowel de subretinal bleb (figuur 2A, C en D) en de injectieplaats (figuur 2A en B) kan duidelijk worden gezien onder de LGO scannen. De subretinal bleb verdwijnt gewoonlijk binnen 24 uur na de injectie. Hoewel de meting van de grootte van de blebs is moeilijk met behulp van OCT, kunnen we het gebied van de bleb ervan uitgaande dat het gelijk is aan het gebied fotoreceptor behoud door cel transplantatie schatten. Wij eerder aangetoond dat een 1 µL injectie van 50.000 cellen resulteren kan in besparing ongeveer 6-7% gebied van het netvlies van de RCS rond de injectie site13. Zoals blijkt uit figuur 2A, C en D, de retina lagen intact waren op de injectieplaats, geen bloed werd ontdekt in de bleb, en geen cellen in het glasvocht, demonstreren minimale trauma veroorzaakt door de injectie werden waargenomen. Representatieve OCT beelden van mislukte injecties hebben bovendien ook opgenomen als referentie (figuur 2E en F).
Met het gebruik van LGO als feedback instrument geoptimaliseerd we de hoek en de diepte van de injector inbrengen van de naald in het weefsel. Zodra geoptimaliseerd, mislukt deze methode konden we een slagingspercentage van 90,8% subretinal toegang met slechts 5,7% chirurgische bereiken, op basis van de resultaten van meer dan 300 vorige subretinal injecties uitgevoerd in onze andere studies,13 (tabel 1). In de resterende 3,5%, werden de LGO niet uitgevoerd om verschillende redenen, met inbegrip van ogen niet in een adequaat standpunt als gevolg van Isofluraan anesthesie-geassocieerde eye17rollen.
7 dagen na transplantatie, waren de bediende rat ogen enucleated, vaste en verdeelde voor immunohistological analyse. Een menselijke cel nucleaire marker (Hunu)18 en een RPE cel marker (OTX2)19 werden gebruikt voor het detecteren van de getransplanteerde cellen. Figuur 3 toonde een dikke laag van getransplanteerde RPE cellen in de subretinal ruimte die, één week na de injectie, was positief gekleurd met beide markeerders, bevestiging van de identiteit en de succesvolle levering van transplantaties. Een week na de injectie, kan het grote aantal cellen, zoals aangegeven in Figuur 3 c, snel dalen tot een klein aantal later als gevolg van de immuunrespons van de gastheer zelfs bij immunosuppressie RCS ratten20. Niettemin, zoals hierboven vermeld, de ontaarde fotoreceptor laag van RCS rat ogen vindt u ten minste 2 maanden na de transplantatie met hRPESC-RPE13worden gered.
Figuur 1 : Een afbeelding van 4 - weken oude P2 hRPESC-RPE cellen en een demonstratie van de hoek en de diepte die de injector naald tijdens de injectie gebruikt. (A) een beeld van de fase contrast van 4 - weken oude P2 hRPESC-RPE cellen gebruikt voor injectie. Schaal bar = 100 µm. (B) een schema toont de 600 µm-afstand tussen de rand van de markering en het puntje van de injector naald gemeten door een microscale. De minimale graduatie van de microscale is 100 µm. (C) A cartoon tonen de doorsnede van de anatomische structuur van een oog van de rat en een zijaanzicht van de hoek en diepte dat de naald van de injector wordt ingevoegd in de muur van het oog. De bestaat as van het oog van de rat is 30 graden ten opzichte van het tafelblad en de injector naald is 15 graden ten opzichte van de lokale oppervlak van de oogbol. (D) een cartoon tonen van het beginpunt van de markering op de injector naald en het bovenaanzicht van de injectieplaats waar 500 µm van de injector naald wordt ingevoegd in het weefsel en een ruimte van 100 µm wordt overgelaten tussen de opening van de injectie-gat en de rand van de marke r. de locatie van het gat is 1200-1500 µm posterieure aan de limbus. De naald-tip wordt weergegeven op zijn kant, maar moet face down tijdens de injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : OCT beelden van het oog van de bediende rat onmiddellijk na injectie. (A) een beeld van de OCT B-scan van een bediende oog tonen van een subretinal bleb en injectie site, zonder intravitreal bloeding. (B) een OCT volume intensiteit projectie (VIP) afbeelding van een reeks van de B-scan die het imago van de fundus enface van het geïnjecteerde gebied vertegenwoordigt. De kleine injectieplaats is zichtbaar in de VIP-afbeelding toont van het minimale trauma. (C) een uitgebreide OCT beeld van (A) de getransplanteerde cellen in de subretinal ruimte met alle retinale lagen tonen gemarkeerd. Dit beeld wordt aangetoond dat de getransplanteerde cellen waren gevestigd in de subretinal ruimte. (D) een OCT B-scan afbeelding toont een subretinal bleb van gemiddelde grootte. (E) een OCT B-scan afbeelding toont een mislukte subretinal injectie met CS gelegen in de intravitreal ruimte. (F) een OCT B-scan afbeelding toont een mislukte subretinal injectie met het gehele netvlies porren via op de injectieplaats. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunohistological kleuring van retinale bevroren secties na de transplantatie van cellen van de hRPESC-RPE. (A) menselijke cel nucleaire marker (Hunu) kleuring met vermelding van de opsporing van getransplanteerde menselijke RPE cellen. (B, E) Cel nucleaire teller kleuring (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) tonen de retinale lagen, transplantatie en RPE laag. (C) een samengevoegde afbeelding van Hunu en DAPI wordt aangegeven dat de hRPE van de getransplanteerde cellen in de subretinal ruimte bevinden zich. De scheiding tussen de transplantatie en RPE laag is een artefact van de verwerking cryo-bescherming RCS ogen voor bevroren secties zijn gekoppeld. (D) RPE cel marker (OTX2) kleuring van de getransplanteerde cellen voor menselijke RPE. (F) een samengevoegde beeld van OTX2 en DAPI. Schaal bar = 20µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Totaal ingespoten RCS rat ogen | Goede subretinal blebs onder OCT | Kleine subretinal blebs onder OCT | Totaal niet-gecompliceerde subretinal blebs onder OCT | Complicatd subretinal blebs onder OCT (d.w.z. luchtbel in it of retinale bloedingen) | Geen OCT uitgevoerd | Chirurgische mislukt (geen subretinal bleb onder OCT) | |
| Graaf | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % van totale ingespoten ogen | ------ | 82.80% | 7,96% | 90.76% | 1,59% | 1,91% | 5.73% |
| (Deze gegevens zijn samengevat uit tien cohorten van subretinal injecties in RCS ratten) | |||||||
Tabel 1: Een samenvatting van de subretinal injecties van tien experimentele cohorten bij RCS ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De subretinal injectietechniek afgebeeld in dit artikel is via de trans-scleral weg, waar de injector naald de buitenlagen van de muur van het oog (sclera-vaatvlies-RPE complex doordringt) zonder nadelige gevolgen voor de neurale retina of het glasvocht holte verstoren. Een alternatieve trans-vitreal-aanpak heeft een potentieel risico van lens schade leidt tot cataract, aangezien knaagdieren lens het grootste deel van het glasvocht holte beslaat. Vergeleken met deze methode, onze techniek is minder riskant en minimale trauma veroorzaakt, zoals de injector naald niet hoeft te gaan over de gehele glasvocht spouw aan het bereiken van de subretinal ruimte. Inderdaad, OCT examens in onze studies bleek zeer zeldzaam retinale penetratie evenementen en in follow-up examens in dieren, er zijn geen persistente retinale detachementen. Bovendien, de injectieplaats is zeer klein (< 200 µm in diameter) wanneer met behulp van een 33-gauge-injector naald zodat de structurele verstoring van de sclera-vaatvlies-RPE complex is zeer beperkt. Na intrekking van de naald, het gat van de injectie zelf zeehonden automatisch dus geen steek of weefsel lijm nodig is.
Complicaties met de operatie zijn overmatig bloeden rond het gebied injectie of vanuit de pilot gat. Als u met pincet greep het bindvlies marge op de limbus, is alleen zachte kracht nodig om Vermijd knijpen de bloedvaten en afname mogelijk bloeden. Onderzoeken alvorens het pilot gat te creëren, de beoogde injectieplaats Voorkom penetratie van de oppervlakkige bloedvaten. Met behulp van een speer, kan de pilot gat van bloed voor de insertdatum van de cel injectie naald worden uitgeschakeld. Als bloeden uit de voorlopig gat na enkele toepassingen van de speer aanhoudt, weliswaar een schip gebroken. Een andere complicatie die we waargenomen is een klein percentage van de RCS ratten hoornvlies opaciteit post-operatively ontwikkelen. In sommige gevallen de opaciteit zijn chronische en anderen waren van voorbijgaande aard. Dieren met persistente opaciteit werden verwijderd uit de studiegroep. Opaciteit hoornvlies kunnen ontwikkelen als gevolg van droogheid van de ogen, fysieke schade, ontsteking, medicijnen of chemische irritatie21. Verklein hun vorming en het oog vochtig moet worden bewaard door behoud van voldoende oog smering, en raak het hoornvlies met een applicator van katoen of andere hulpprogramma's tijdens de operatie.
Het protocol injectie geschetste hier toepassingen gedefinieerde aanpak hoeken en diepten van de naald ten opzichte van oogbeschadigingen en/of monumenten, en oog hoeken ten opzichte van de chirurgische tabel in onze opzet. Het gebruik van na injectie OCT scans was belangrijk in het verfijnen van de parameters van deze injectie om reproduceerbare bepalen van RPE cel transplantatie in de rats' subretinal ruimte met een hoge nauwkeurigheid. Zodra de knie door herhaalde praktijk, is de methode eenvoudig uit te voeren. Het wordt aanbevolen, vooral in opleiding, dat na chirurgische oogbeschadigingen en/of examens zijn uitgevoerd om te bepalen van de resultaten. De hoek en de diepte van de injectie naald zal waarschijnlijk nodig aanpassing dienovereenkomstig aan deze feedback afhankelijk van de chirurgische set-up, leeftijd van het dier, en/of als er andere diersoorten worden gebruikt (bijvoorbeeld, muis).
Te evalueren van de kwaliteit van de injectie en opgenomen in of uitgesloten van een studie bepalen, is de aanwezigheid van subretinal bled van OCT observatie van cruciaal belang. In laboratoria, waar de OCT niet beschikbaar is, de hieronder beschreven criteria kunnen worden gebruikt voor een snelle screening door chirurgen uit te sluiten van vermoedelijke injectie mislukt: (1) vóór injectie: (a) Pilot gat te diep is gemaakt (dat wil zeggen, aanzienlijke diepte > 500 µm; voor de merk van insuline naald gebruikt hier de afstand van het puntje van de naald tot het midden van de schuine kant is 500 µm). (b) voorlopig gat aflooptekens overdreven (d.w.z., bloeden kan niet worden gestopt door geweld toe te passen op het gat met oog spears). (c) de naald van de injectie te diep gaat (dat wil zeggen, aanzienlijke diepte > 500 µm of de markering op de nld van de injectie gaat in de sclera/vaatvlies/RPE complex weefsel). (2) tijdens de injectie: (a) niet in staat om de naald van de injectie in de pilot gat tijdens de injectie. (b) lekkage onmiddellijk rond de injectie naald tijdens de injectie. (c) de injectie naald te diep wordt geduwd (dat wil zeggen, de markering op de injectie naald gaat in de sclera/vaatvlies/RPE complex weefsel) zoals opgemerkt door de chirurg tijdens de injectie. (d) kan niet de injectie naald in positie te handhaven voor meer dan 5 seconden na de injectie. (e) een overmatige bloed bij het intrekken van de injectie naald. (f) geen terugvoer/efflux gezien na intrekking van de naald van de injectie in combinatie met stap 2.
Tezamen met zorgvuldig beheer van de locatie van de naald, hoeken en diepten, de trans-scleral subretinal injectietechniek is zeer betrouwbaar, accuraat en minimale chirurgisch trauma kan dragen. Deze techniek kan met al deze voordelen, niet alleen voor de levering van RPE cellen, maar ook voor andere celtypes, verbindingen of gentherapieën gebruikt worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Patty Lederman bedanken voor haar hulp bij de chirurgie en Susan Borden RPE cel voorbereiding. We erkennen ook NYSTEM C028504 voor de financiering voor dit project. Justine D. Miller wordt ondersteund door de NIH grant F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
