신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 근육 학 교차로 (NMJ) 기능 모터 신경 및 근육 사이 통신 장애, 노화 등 루 경화 증 (ALS)에서는 질병을 공부 하는 때 중추적인 역할을 한다. 여기 우리가 NMJ 기능 전기 자극의 두 종류를 결합 하 여 측정 하는 데 사용할 수 있는 실험 프로토콜 설명: 근육 막 자극과 자극이 신경을 통해 직접. 이러한 두 가지 다른 stimulations에 근육 응답의 비교 정의 기능 수준, 근육에서 기능 감소로 이어질는 NMJ에 잠재적인 변경 시킬 수 있습니다.
Ex vivo 준비는 잘 통제 연구에 적합. 여기는 근육 기능과 NMJ soleus 좌 골 신경 준비 및 다이어 프 램 인할지 신경 준비의 여러 매개 변수를 측정 하는 집중적인 프로토콜에 설명 합니다. 프로토콜 약 60 분을 지속 하 고는 주문에 의하여 uninterruptedly 실시 트 위치 속도 론 속성, 근육 및 신경 stimulations의 힘-주파수 관계와 두 개의 매개 변수 NMJ 기능, 즉 neurotransmission 실패와 intratetanic 피로 측정 소프트웨어. 이 방법론 soleus과 횡 경 막 근육 신경 준비에 SOD1G93A 유전자 변형 마우스, 편 overexpresses 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) ALS의 실험 모델을 사용 하 여 손해를 검출 하 사용 되었다.
서론
신경 근육 학 교차로 (NMJ) 근육 섬유의 모터 종판 및 터미널 모터 신경 축 삭 사이 연결에 의해 형성 된 화학 시 냅 스 이다. NMJ 근육과 신경 사이 통신 장애, 노화 또는 루 경화 증 (ALS)에서 발생 되는 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 근육과 신경, 의사 소통 양방향 방법1,2로 근육 결함 별도로 NMJ 결함을 측정할 수 있는 그들의 physiopathological 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사실,이 기능 평가 형태학 또는 생 화 확 적인 변경 감소 neurotransmission 신호 기능을 도울 수 있다.
근육 수축 반응 elicited 신경 자극과 같은 근육의 막의 직접 자극에 의해 evoked의 응답에 의해 비교 NMJ 기능의 간접 측정으로 제안 되었습니다. 실제로, 막 자극에 의해 패스 neurotransmission 신호, 이후 두 수축 성 반응의 차이 변화는 NMJ에 관찰 될 수 있습니다. 이 방법은 광범위 하 게 쥐3,,45,6,7, 제안 되었고 또한 마우스 모델8,,910,,1112에 정보를 수집 하는 데 사용.
여기, 우리가 자세히 설명 삭제할 soleus 좌 골과 횡 경 막 인할지 준비 두 근육 신경 준비, 즉 테스트 하는 프로시저. 주문 품을 사용 하 여 소프트웨어, 우리 설계 NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수 측정을 결합 하 여 지속적인 테스트 프로토콜 함으로써 근육의 NMJ 손상의 포괄적인 평가 별도로 저조한. 특히, 프로토콜 트 위치 힘, 근육 활동, 힘 주파수 곡선에 대 한 직접 및 신경 stimulations, 모두는 발사와 tetanic 주파수 및 intratetanic 피로7neurotransmission 실패13 측정합니다.
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프로토콜
모든 동물 실험은 로마 라 사피엔자 대학교(Sapienza University of Rome) 조직학 및 의학 배아학 부서의 윤리 위원회 승인을 받았으며, 동물 보호에 관한 이탈리아 법률의 최신 버전에 따라 수행되었습니다.
1. 실험 설정
- 액추에이터/트랜스듀서 1개, 자극기 2개, in-vitro 근육 장치 1개, 준비용 조직 욕조 1개, 흡입 전극 1개, 디지털 오실로스코프 1개, 실체 현미경 1개, 냉광 조명 장치 1개, 데이터 수집 보드 1개, 커넥터 블록 1개 및 개인용 컴퓨터로 구성된 실험 시스템을 설정합니다.
참고: 여기서 제어 소프트웨어는 LabView로 프로그래밍되었으며, 자극의 높은 유연성, 정확성 및 재현성을 보장하도록 설계되었습니다. 각 자극에 대해 사용자는 펄스 폭, 주파수, 지속 시간을 선택할 수 있으며, 자극을 막에 직접 전달할지 또는 신경을 통해 전달할지를 결정할 수 있습니다. 또한 사용자는 각 자극 전의 휴지기 길이를 선택할 수 있습니다.
2. 가자미근 및 횡격막 근육의 NMJ 수축 특성 평가
- 시스템 예열
- Krebs Ringer 완충액14을 준비하여 장착 장치의 수조와 조직 준비 수조에 넣습니다. 4 ml의 실리콘이 준비된 60 mm 접시를 조직 준비 수조에 배치합니다.
- 순환 수조를 켜고 온도를 가자미근(soleus muscle)의 경우 30 °C로, 횡격막근(diaphragm muscle)의 경우 27 °C로 설정합니다.
- 95% O2 - 5% CO2 혼합 가스가 두 수조로 흐르게 합니다.
- 액추에이터/트랜스듀서(actuator/transducer)와 두 개의 펄스 자극기를 켜고 전류 값을 막 자극(membrane stimulation)용으로는 300 mA, 신경 자극(nerve stimulation)용으로는 5 mA로 설정합니다.
참고: 300 mA 전류 값은 용액에 D-tubocurarine을 첨가했을 때 신경 분지에서 유의미한 수축을 유도하지 않는 것으로 이전에 입증되었습니다15. 5 mA 전류 값은 용액에 의해 유도되는 막 자극과 중첩되지 않으면서 신경을 통해 근육을 자극하는 데 필요한 전류 양에 해당합니다. 흡입 전극과 근육 사이의 거리는 신경 길이에 따라 달라지므로, 아래 설명된 바와 같이 각 실험 전에 이 전류 값을 세심하게 조정해야 합니다.
- 가자미근 및 횡격막 박리
- 고통을 최소화하기 위해 경추 탈골법으로 마우스를 안락사시키고, 즉시 다음과 같이 테스트용 근육을 적출합니다.
- 가자미근-좌골신경 표본 준비, 박리 및 설정
- 마우스 다리에 70% 에탄올을 뿌리고 다리를 덮고 있는 피부를 제거합니다. 가위로 다리 윗부분을 절개한 후 피부를 단단히 잡아당깁니다. 경골(tibia)에서 아킬레스건을 분리한 다음 가위로 아킬레스건을 절단합니다.
- 포셉(forceps)으로 건을 단단히 잡고 가자미근과 함께 비복근(gastrocnemius muscle)을 조심스럽게 잡아당깁니다. 가자미근의 근위부 건이 노출되면 아킬레스건을 잡은 상태에서 종아리 전체를 가위로 절단합니다. 즉시 조직 샘플을 조직 준비 수조에 넣습니다.
- 준비 수조를 실체 현미경 아래에 두고 0.20 mm 직경의 스테인리스 스틸 핀을 사용하여 종아리를 실리콘 접시에 고정합니다. 포셉으로 가자미근의 근위부 건을 잡고 조심스럽게 잡아당겨 좌골신경 분포(sciatic innervation)를 노출시킵니다.
- 신경 분포가 노출되면 (그림 1), 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 신경의 약 5 mm 부분을 노출시킵니다. 미세 가위를 사용하여 신경을 절단합니다. 포셉으로 근위부 건의 가자미근을 단단히 잡은 상태에서 다시 잡아당기고, 가위로 아킬레스건을 절단하여 적출합니다.
- 액추에이터/트랜스듀서의 레버 암 구멍에 나일론 와이어를 통과시킵니다. 와이어 끝에 고리를 만들어 아킬레스건을 잡은 후, 근육이 장착 장치의 수조에 닿을 때까지 와이어를 뒤로 당깁니다. 근위부 건을 고정 클램프 내에 고정하고 레버 암 주변에 나일론 와이어를 묶습니다. 근육이 용액 내에서 평형을 이룰 때까지 둡니다.
- 초기 최적 길이(L0)를 결정합니다.
- 먼저 근육을 신장시켜 10 mN으로 사전 부하(preload)를 줍니다(이 값은 경험적으로 최대 수축력을 보장합니다). 그런 다음 근육을 조심스럽게 신장시켜 사전 부하를 변경하며 일련의 단일 펄스로 자극합니다. 최대 수축력이 측정될 때 최적 길이에 도달한 것입니다.
- 횡격막-횡격막신경 표본 준비, 박리 및 설정
- 마우스 피부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 흉골(sternum) 위를 절개하고 피부를 단단히 잡아당겨 횡격막근을 덮고 있는 피부를 제거합니다.
- 가위로 흉골 아래 복부를 가로로 절단하고 포셉으로 장과 장기를 조심스럽게 제거합니다. 두꺼운 가위를 사용하여 척추를 절단합니다.
- 흉골 위 약 1 cm 지점에서 갈비뼈를 자르고 가로 방향으로 진행합니다. 포셉으로 외부 장기를 조심스럽게 제거하고 척추를 절단하여 횡격막을 포함하는 원형의 갈비뼈 링을 얻습니다.
- Krebs Ringer 완충액이 담긴 접시에서 표본을 세척한 후, 윗면이 위로 가고 흉골이 앞을 향하게 하여 조직 준비 수조 내의 실리콘 접시에 배치합니다.
- 실체 현미경을 사용하여 폐와 나머지 장기를 조심스럽게 제거합니다. 그러면 오른쪽에 횡격막신경(phrenic nerve)이 보일 것입니다 (그림 2A).
- 횡격막을 따라 약 2 mm의 링이 남도록 갈비뼈를 다듬습니다.
- 포셉을 사용하여 횡격막신경 분포에 해당하는 지점의 횡격막 중심건(central tendon)에 0.20 mm 직경의 스테인리스 스틸 핀 하나를 고정하고, 관심 있는 횡격막 조각(strip)을 확인하기 위해 동일한 축상의 갈비뼈에 또 다른 핀을 고정합니다.
- 선택한 조각의 양측 중심건에 두 개의 핀을 추가로 고정하고 갈비뼈에 다시 두 개의 핀을 고정하여 횡격막을 펼칩니다. 필요한 경우 포셉을 사용하여 주변 결합 조직으로부터 횡격막신경을 깨끗하게 분리합니다.
- 곡선형 칼날을 사용하여 신경 분포의 양측 횡격막을 절단하여 그림 2B와 같이 건-근육-갈비뼈 조각을 만듭니다.
- 액추에이터/트랜스듀서의 레버 암 구멍에 나일론 와이어를 통과시킵니다. 와이어 끝에 고리를 만들어 건을 잡은 후, 근육이 장착 장치의 수조에 닿을 때까지 와이어를 뒤로 당깁니다.
- 갈비뼈를 고정 클램프 내에 고정하고 레버 암 주변에 나일론 와이어를 묶습니다.
- 근육이 용액 내에서 평형을 이룰 때까지 두고 초기 최적 길이(L0)를 결정합니다.
- 근육을 신장시켜 5 mN으로 사전 부하를 줍니다. 근육을 조심스럽게 신장시켜 사전 부하를 변경하며 일련의 단일 펄스로 자극합니다. 최대 수축력이 측정될 때 최적 길이에 도달한 것입니다.
그림 1 - 가자미근-좌골신경 준비. 기능 테스트를 위한 수술 과정 중의 가자미근-좌골신경. 포셉 한 쌍을 사용하여 좌골신경을 노출시킨 모습이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 - 횡격막-횡격신경 표본. 사진은 횡격막-횡격신경 표본 적출 단계(A)와 기능 테스트를 위해 장착될 조직 조각(B)을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 근육 수축력과 분리하여 신경근 접합부(NMJ) 특성을 측정하기
- 신경을 통한 자극에 최적의 전류 강도를 설정하고, 흡입 전극을 통해 전달되는 전류 펄스가 배양액 내 전류 확산으로 인해 근육 수축을 유발하지 않는지 확인하십시오.
- 흡입 전극을 근육 근처에 배치하고 신경을 안쪽으로 당깁니다. 전류 강도를 서서히 높이면서(5mA부터 시작), 일련의 단일 펄스로 근육을 자극합니다. 경련력이 최대가 될 때의 전류 값을 최적 전류 값으로 결정합니다.
- 신경을 전극 밖으로 밀어낸 후 단일 펄스를 몇 차례 가합니다. 용액에 의한 막 자극과 겹쳐 근육이 수축하지 않는지 확인하십시오. 그 후 신경을 다시 안으로 당깁니다.
- 프로그램을 실행하고 입력 파일을 선택하여 원하는 테스트 프로토콜을 수행하십시오.
참고: 입력 파일에는 전체 프로토콜을 실행하는 데 필요한 모든 자극 파라미터가 포함되어 있습니다. 두 근육에 대해 동일한 프로토콜 구조가 사용되지만, 자극 파라미터는 해당 프로토콜이 가자미근 또는 횡격막근 중 어느 것을 대상으로 하느냐에 따라 달라집니다.- 가자미근-좌골신경 자극 (표 1 참조)
- 모든 전기 자극에 대해 다음과 같은 펄스 폭을 사용하십시오: 좌골 신경 자극의 경우 1.4 ms, 가자미근 직접 자극의 경우 0.1 ms입니다. 전체 프로토콜은 약 65분 동안 진행됩니다.
- 횡격막-횡격신경 자극 (표 2 참조)
- 모든 전기 자극에 대해 다음과 같은 펄스 폭을 사용하십시오: 횡격막 신경 자극에는 1.8 ms, 횡격막 직접 자극에는 0.2 ms를 사용합니다. 전체 프로토콜은 약 55분 동안 진행됩니다.
- 실험 프로토콜의 마지막 단계에서, 0.05 mm 정확도의 아날로그 캘리퍼스와 0.1 mg 정확도의 정밀 저울을 사용하여 각각 근육의 길이와 습중량을 측정하십시오.
- 근육 질량을 최적 섬유 길이(L)와 밀도의 곱으로 나누어 단면적(CSA)을 계산하십시오.f) 및 포유류 골격근의 밀도(1.06 mg/mm3)16.
참고: Lf L을 곱하여 얻습니다0 섬유 길이/근육 길이 비율에 의해 (가자미근의 경우 0.71)16 그리고 횡격막근의 경우 1로 설정합니다.17).
- 근육 질량을 최적 섬유 길이(L)와 밀도의 곱으로 나누어 단면적(CSA)을 계산하십시오.f) 및 포유류 골격근의 밀도(1.06 mg/mm3)16.
- 가자미근-좌골신경 자극 (표 1 참조)
- 신경을 통한 자극에 최적의 전류 강도를 설정하고, 흡입 전극을 통해 전달되는 전류 펄스가 배양액 내 전류 확산으로 인해 근육 수축을 유발하지 않는지 확인하십시오.
| 실험 유형 | 빈도 | 소요 시간 | 반복 수행 | 근육 또는 신경 자극 | 목적 |
| (Hz) | (s) | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 근육 | 수축력 및 역학 | |
| 휴식 | 30 | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 신경 | ||
| 휴식 | 30 | ||||
| 트위치 | 단일 펄스 | 1 | 근육 | ||
| 휴식 | 30 | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 신경 | ||
| 휴식 | 120 | ||||
| 비융합 파상풍 | 40 | 0.8 | 1 | 신경 | 신경 및 근육 자극에 따른 힘/빈도 곡선 |
| 휴식 | 180 | ||||
| 비융합 파상풍 | 60 | 0.8 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 융합 파상풍 | 80 | 0.8 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 비융합 파상풍 | 20 | 0.8 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 비융합 파상풍 | 60 | 0.8 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 융합 파상풍 | 80 | 0.8 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 비융합 파상풍 | 20 | 0.8 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 비융합 파상풍 | 40 | 0.8 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 300 | ||||
| 피로 패러다임 | 35 | 0.8 | 근육 자극 1회 후 각각 1.2초의 휴지 시간을 두고 신경 자극 14회를 실시하며, 이를 20회 반복함 | 신경전달 실패 (NF) | |
| 휴식 | 900 | ||||
| 피로 패러다임 | 80 | 0.8 | 근육 자극 1회 후 신경 자극 14회를 각각 1.2초의 휴지 시간을 두고 실시하며, 이를 20회 반복함 | 신경전달 실패(Neurotransmission failure, NF) 및 강직 내 피로(Intratetanic fatigue, IF) | |
표 1 - 가자미근-좌골신경 자극 프로토콜. 이 표는 가자미근-좌골신경 표본 테스트를 위한 전체 프로토콜을 구성하는 테스트 순서를 나열합니다.
| 실험 유형 | 빈도 | 소요 시간 | 반복 실험 | 근육 또는 신경 자극 | 목적 |
| (Hz) | (s) | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 근육 | 수축력 및 역학 | |
| 휴식 | 30 | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 신경 | ||
| 휴식 | 30 | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 근육 | ||
| 휴식 | 30 | ||||
| 경련 | 단일 펄스 | 1 | 신경 | ||
| 휴식 | 120 | ||||
| 비융합 파상풍 | 60 | 0.5 | 1 | 신경 | 신경 및 근육 자극에 따른 힘/주파수 곡선 |
| 휴식 | 120 | ||||
| 융합 파상풍 | 100 | 0.5 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 비융합 파상풍 | 40 | 0.5 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 120 | ||||
| 비융합 파상풍 | 20 | 0.5 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 120 | ||||
| 비융합 파상풍 | 80 | 0.5 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 150 | ||||
| 비융합 파상풍 | 80 | 0.5 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 150 | ||||
| 비융합 파상풍 | 20 | 0.5 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 120 | ||||
| 융합 파상풍 | 100 | 0.5 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 150 | ||||
| 융합 파상풍 | 100 | 0.5 | 1 | 신경 | |
| 휴식 | 180 | ||||
| 융합되지 않은 파상풍 독소 | 60 | 0.5 | 1 | 근육 | |
| 휴식 | 300 | ||||
| 피로 패러다임 | 35 | 0.33 | 근육 자극 1회 후 0.67초의 휴지 시간을 두고 신경 자극 14회를 수행하며, 이를 20회 반복함 | 신경전달 실패 (Neurotransmission failure, NF) | |
| 휴식 | 900 | ||||
| 피로 패러다임 | 80 | 0.33 | 근육 자극 1회 후 신경 자극 14회를 각각 0.67초의 휴식 시간을 두고 시행하며, 이를 20회 반복함 | 신경전달 실패(NF) 및 파상성 피로(IF) | |
표 2 - 횡격막-횡격막신경 자극 프로토콜. 이 표는 횡격막-횡격막신경 표본 테스트를 위한 전체 프로토콜을 구성하는 테스트 순서를 나타냅니다.
3. 데이터 분석
참고: 프로토콜 마지막 단계에서 모든 원하는 파라미터를 다음과 같이 계산하십시오.
- 단일 펄스 자극으로부터
- 트위치 힘(mN; 트위치 동안 생성된 최대 능동 힘) 및 비트위치 힘(mN/mm²)을 계산하십시오.2). 근육에 의해 생성된 최대 힘에서 초기 사전 부하 값을 빼서 계산하십시오. 수축력을 근육의 단면적으로 나누어 비수축력을 계산하십시오.
- 맥박 방출부터 수축력 발생까지의 시간을 정점 장력 도달 시간(TTP)(ms)으로 계산하십시오.
- 트위치 힘에서 트위치 힘의 50%까지 걸리는 시간으로 반-이완 시간(1/2RT) (ms)을 계산하십시오.
- 수축 단계 동안 힘 미분값의 최댓값으로 dF/dt (mN/ms)를 산출하십시오.
- 이완 단계 동안의 힘 도함수 최댓값을 -dF/dt (mN/ms)로 계산하십시오.
- 펄스 열 자극으로부터
- 미융합 힘(mN) 및 비융합 힘(mN/mm²)을 계산하십시오.2). 근육에 의해 생성된 최대 힘에서 초기 예하중 값을 빼서 계산하십시오. 미융합 힘을 근육의 단면적(CSA)으로 나누어 비미융합 힘을 계산하십시오.
참고: 비융합력은 강직 주파수보다 낮은 주파수의 펄스 열 동안 생성되는 최대 활성력입니다. - 강직성 힘(mN)과 비강직성 힘(mN/mm2)을 계산하십시오. 최대 힘은 강직성 주파수로 전달된 펄스 열 동안 생성된 최대 능동 힘입니다. 근육에 의해 생성된 최대 힘에서 초기 사전 부하 값을 빼어 이를 계산하십시오. 비강직성 힘은 강직성 힘을 근육의 단면적(CSA)으로 나누어 계산하십시오.
- 힘-빈도 곡선을 계산하십시오. 각 자극에서 얻은 힘(또는 비힘)의 값을 증가하는 자극 빈도에 대해 도식화하십시오. 일반적으로 단일 펄스 자극으로 시작하여 강직 빈도에서 종료합니다.
- 미융합 힘(mN) 및 비융합 힘(mN/mm²)을 계산하십시오.2). 근육에 의해 생성된 최대 힘에서 초기 예하중 값을 빼서 계산하십시오. 미융합 힘을 근육의 단면적(CSA)으로 나누어 비미융합 힘을 계산하십시오.
- 피로 패러다임으로부터
- 신경전달 실패(NF)를 다음과 같이 계산하십시오:
여기서 MF는 근육 자극 후의 힘 감소이며, F는 근육 자극 후 첫 번째 펄스 열에서 측정된 신경 자극 후의 힘 감소이다. - 강직 내 피로(IF)를 다음과 같이 계산합니다:
여기서 F는lp 자극의 마지막 펄스에서 근육에 의해 생성된 힘이며, Fm 동일한 펄스 열 동안 근육에서 생성된 최대 힘입니다. 신경 자극과 관련하여, 직접 자극 직후의 첫 번째 펄스 열에 대한 테타누스 내 피로도를 계산하십시오.
- 신경전달 실패(NF)를 다음과 같이 계산하십시오:
4. 통계 분석
참고: 통계 분석 모델은 신경 자극과 막 자극 모두에 대한 근육 반응을 동일한 동물 모델 내에서 비교하는지, 아니면 두 가지 서로 다른 동물 모델 간에 비교하는지에 따라 선택해야 합니다18,19.
- 직접 및 간접 자극에 대한 근육 반응만을 비교하는 경우, TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt에 대해 Student's t test를 사용하십시오. 서로 다른 2가지 마우스 계통에서 얻은 근육 표본을 비교하는 경우에는 자극 유형과 마우스 계통을 고정 요인으로 하여 2-way ANOVA를 사용하십시오. 2-way ANOVA 결과가 유의미한 경우, 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 차이를 확인하십시오.
- 힘-주파수 곡선의 경우(직접 및 간접 자극에 대한 근육 반응만을 비교하는 경우), 자극 유형과 자극 주파수를 고정 요인으로 하여 2-way ANOVA를 사용하십시오. 필요한 경우 다중 비교 검정을 사용하십시오.
- 서로 다른 2가지 마우스 계통에서 얻은 근육 표본을 비교하는 경우에는 자극 유형, 자극 주파수 및 마우스 계통을 고정 요인으로 하여 3-way ANOVA를 사용하십시오.
- 3-way ANOVA에서 동물 계통과 자극 유형 요인의 유의미한 효과가 나타나면, 2-way ANOVA를 사용하여 한 번에 두 그룹 간의 유의미한 차이를 식별하십시오. 예를 들어, 막 자극에 대한 두 그룹의 근육 반응 차이 또는 한 그룹 내에서 직접 및 간접 자극에 대한 근육 반응의 차이를 평가할 수 있습니다.
- 서로 다른 2가지 마우스 계통에서 얻은 근육 표본을 비교하는 경우에는 자극 유형, 자극 주파수 및 마우스 계통을 고정 요인으로 하여 3-way ANOVA를 사용하십시오.
- 강직 내 피로(Intratetanic fatigue)
참고: 본 프로토콜은 대조군 마우스에서도 신경 자극에 반응하여 피로가 유도되도록 설계되었으므로, 이 파라미터는 두 마우스 계통 간의 차이를 조사하는 데만 사용할 수 있으며, 단일 그룹 내에서의 통계 분석은 항상 유의미한 차이를 나타냅니다.- 두 그룹을 비교하려면 자극 유형, 시간 및 마우스 계통을 고정 요인으로 하여 3-way ANOVA를 사용하십시오. 3-way ANOVA에서 동물 계통과 자극 유형 요인의 유의미한 효과가 나타나면, 힘-주파수 곡선에서와 마찬가지로 2-way ANOVA를 사용하여 한 번에 두 그룹 간의 유의미한 차이를 식별하십시오.
- 신경전달 실패의 경우, 동물 계통과 시간을 고정 요인으로 하여 2-way ANOVA를 사용하십시오. 결과가 유의미한 경우, 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 차이를 확인하십시오.
참고: 이 파라미터는 각 마우스 계통에 대해 하나의 값만 반환하므로, 서로 다른 마우스 모델을 비교할 수 있습니다. - 근육 무게, 길이 및 CSA의 경우, 서로 다른 동물 모델의 근육-신경 표본을 비교하여 차이를 조사할 때 Student's t test를 사용하십시오.
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결과
우리가 설명 하는 프로토콜은 여러 신경 근육 학 질병 또는 노화 sarcopenia 기능 denervation에 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜 여부 (그리고, 그렇다면, 어떤 수준)를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 근육 변경 근육 자체 또는 신경 근육 학 전송에서 발생 하는 선택적인 변경 됩니다. 아래 데이터는 우리의 그룹18, 루 경화 증 질병20의 최종 단계에서의 SOD1G93A 유전자 변형 마우스 모델에 의해 이전 작업의 결과입니다. SOD1G93A 유전자 변형 마우스 편 돌연변이 항 산화 효소 superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses. 그림 3과 4는 dF/dt 및 tetanic 힘 값 soleus 좌 골 신경 (왼쪽)와 횡 경 막 인할지 신경 (오른쪽) 준비를 보여줍니다. 이러한 결과 근육 자...
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토론
위에서 설명한 실험 프로토콜에는 측정 하 고 차별 어떤 기능 변경 발생 한 근육에 직접 또는 간접적으로 신경 근육 학 교차로 수준에서의 이상적인 방법을 제공 한다. 이 기술은 NMJ 기능의 간접 측정을 기반으로, 이후 형태학 변화 또는 생 화 확 적인 변화에 어떤 결함 관련 된 경우 설정 하에서 사용할 수 없습니다. 대조적으로, 그것은 어떤 형태 또는 생 화 확 적인 변경 neurotransmission 기능 신호 감소 여부 결정의 효과적인 방법을 제공지 않습니다. 그러나, 힘 측정 완료 근육 목욕에서 제거, 얼룩이, 최적의 길이에 고정, 포함 화합물으로 둘러싸인 고 빠르게 녹는 isopentane에 냉동. 근육 후속 평가-80 ° C에서와 같은 immunohistochemical 및 형태소 분석에 대 한 저장할 수 있습니다.
우리가 여기에서 제안 하는 기술은 결합, 처음으로, NMJ 및 근육 기능을 특성화 하는 여러 매개 변수를 측정 하는 실험 테스트 프로토콜을 기반으로 합니다...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자의 연구실에서 작업 피코 로마와 텔 레 톤 (no를 부여에 의해 지원 되었다 GGP14066)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 듀얼 모드 레버 시스템 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 300B | 액추에이터/트랜스듀서 |
| 고출력 바이페이즈 자극기 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 701B | 펄스 자극기 (신경) |
| 고출력 바이페이즈 자극기 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 701C | 펄스 자극기(근육) |
| 체외 근육 장치 | 오로라 사이언티픽 Inc. | 800A | |
| 준비 티슈 목욕 | Radnoti | 158400 | |
| 단극 흡입 전극 | A-M 시스템 | 573000 | 집에서 만든 참조 |
| 오실로스코프 | Tektronix | TDS2014 | |
| 실체현미경 | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| 수집 보드 | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| 커넥터 블록 | National Instruments | NI 2110 | |
| 개인용 컴퓨터 | AMD Phenom II x4 970 | 프로세서 3.50 Ghz (Windows 7 | |
| 포함) LabView 2012 소프트웨어 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer 중탄산염 버퍼 | 시그마-알드리치 | K4002 | 생리적 완충액 |
| 중탄산나트륨 | 시그마-알드리치 | S5761 | |
| 염화칼슘 CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | 무수, 분말, ≥ 97 % |
| 버퍼 HEPES | 시그마 - 알드리치 | H3375 | ≥ 99.5% (적정) |
| 접시 60mm x 15mm | 팔콘 | 353004 | 폴리스티렌 |
| 실리콘 | 실가드; | 184 실리콘 | 엘라스토머 키트 0.5Kg. |
| 온도조절기 | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| 펌프 | Newa Mini | MN 606 | 수족관 |
| 내열성 열케이블 Lucky | Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| 버킷 | 10 | 폴리프로필렌 | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 아이템 |
| 스프링 가위 - 8mm 블레이드 | Fine Science Tools | 15024-10 | 신경 절제 |
| 날카로운 가위 | 고급 과학 도구 | 14059-11 | 근육 제거 |
| 섬세한 가위 | Wagner | 02.06.32 | 동물 외부 |
| 학생 메스 핸들 #3 | 고급 과학 도구 | 91003-12 | |
| 메스 블레이드 #10 | 파인 사이언스 도구 | 10010-00 | |
| 메스 블레이드 #11 | 파인 사이언스 도구 | 10011-00 | |
| 나일론 와이어 &오슬래시; 0.16mm | 임의 |
참고문헌
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