이 논문은 조작 된 세포와 합성 제어 프로그램 재료 표면을 조작하는 대장균을 설계 에이블 작용 표면을 개발하기위한 프로토콜의 시리즈를 제공합니다.
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방법 논문
살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스
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이 논문에서
요약
초록
우리는 설계 세포 관능 표면의 물성을 제어 할 수있는 생물 적 생물 - 인터페이스를 개발했다. 대장균의 합성 조작 된 균주 및 관능 재 계면이 시스템은 두 개의 모듈을 생성함으로써 만들어진다. 이 논문에서, 우리는 세부 유전자 분자 복제 전략을 사용하여 대장균의 균주 내에서 선택 행동을 설계하기위한 프로토콜. 화학 유도제에 노출 될 때 회 전개,이 균주는 바이오틴의 높은 수준을 생성한다. 또한, 세포 합성 비오틴에 응답 할 수있는 각각의 두 가지 작용 표면을 만들기위한 우리 상세히 프로토콜. 종합하면, 우리는 무생물 재료 기판 상 조성물 및 조립을 제어하는 셀을 설계 허용 연결된, 비 생물 - 생물학적 시스템을 생성하는 방법을 제시한다.
서론
여기서, 우리는 조작 세포주에서 화학적 신호에 응답 할 수있는 프로그래밍이 된 기판을 현상하는 절차를보고한다. (1) 우리는 합성 조작 된 대장균 (대장균) 세포에 의해 생성 비오틴에 응답 비오틴 - 스트렙 타비 딘 인터페이스를 작성하여이를 수행합니다. 이전 프로그램은 독소의 표면 검사 2 및 치료 시점 진단 3 방위 및 보안에서 다양한 애플리케이션을 위해 설계되었다. 프로그래머블 표면 센서 및 액추에이터로서 유용 할 수있는 4이지만, 서로 다른 환경 문제에 적응할 수있는 능력을 부여하는로 '똑똑한'할 수있다. 대조적으로, 대장균 심지어 간단한 미생물은 본래 적응성이 있고 정교 종종 예기치 솔루션 과제에 응답 할 수있다. 이 적응성은 E. 사용할 수있다복잡한 유전자 네트워크에 의해 제어 대장균 인구는 비용 효율적으로 자원을 찾아, 5 부가가치 제품, 6, 심지어 전원 마이크로 규모의 로봇을 만들 수 있습니다. 7 프로그래밍 표면을 이....
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프로토콜
1. 미디어와 문화 준비
- 탈 이온수 (DI) 물 1 L에 LB 분말 주식의 25g을 혼합하여 살균 20 분 동안 121 ° C의 솔루션을 고온 가압 멸균하여 원성 국물 (LB) 미디어를 준비합니다.
- , LB 플레이트를 준비 멸균 전에 LB 미디어에 15g 한천 (1.5 %)을 추가하려면
- DI 물에 1000 배 카르 베니 실린 (의 Cb) (50 ㎎ / ㎖)의 재고 솔루션을 준비합니다.
- 멸균 LB 매체의 온도가 60 ° C 이하가 될 때까지 내성 형질 전환 체의 선택을위한 항생제를 포함하는 LB 미디어를 준비하는 경우, 기다린 후 매 1 mL의 LB의 미디어에 대한 항생제 주식의 1 μL를 추가합니다.
- 5X M9 염 (56.4 g의 /에 L), 1 M 황산, 1 M CaCl2를 20 % 글루코스 및 2 % 비오틴 무 카사 미노산 : M9 최소 배지 (표 1)의 경우, 다음의 별도의 스톡 용액을 준비한다.
- 오토 클레이브 안전 병에 결합하여 20 mL의 5 배 M9의 염, 200# 181, 1M 황산, DI 물 1 M CaCl2를 20 ....
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결과
대표 결과 첨부 다섯 수치로 표시됩니다. 리더 시각적 합성 조작 된 대장균 균주를 생성하기위한 중요한 단계를 수행 할 수 있도록 먼저, 그래픽 복제 프로세스 (도 1)을 제시한다. 세포 집단의 동력학을 특성화하기 위해, 우리는 인구의 600 나노 미터 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정함으로써 생성되는 성장 곡선 (도 2)을 제공한다. 그 후, 우리는 조절 유전자 네트워크 우리 광학적 IPTG로 유도시 세포에 의해 생성 될 bioB의 상대적인 양을 측정 할 수 bioB 대한 프록시로서 (도 3) mCherry를 이용하여 검증하는 방법을 보여준다. 다음은 간접적 인 제어 및 직접 제어 작용면에 대해 응답 데이터를 제시한다. 이러한 데이터 그래프 (그림 4)는 무료의 측정 솔루션을 사.......
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토론
우리는 작용 물질의 표면과 생활 설계 세포를 인터페이스하기위한 새로운 전략을 발표했다. 이 IPTG로 유도 할 때 비오틴 수준 상승을 합성 할 수있는 세포주를 개발함으로써 달성되었다. 비오틴의 상승 된 수준은 기능화 된 표면을 수정하는 데 사용될 수있다. 프로토콜은 대장균 세포 라인을 설계하는 방법에 두 가지 작용 표면을 생성하는 방법을 상세히.
이 프로토콜에서 중요한 단계는 설계 세포주의 구축에 걸쳐 발생한다. 다운 스트림 문제, 모두 성장 곡선으로 설계 세포주의 특성 (그림 2)와 형광 응답 (그림 3)을 방지하기 위해 권장합니다. 절차상의 문제가 발생하는 경우, 이러한 PCR 추출 및 깁슨 조립체 (14)와 같은 다른 분자 클로닝 전략, 여기서 단계 적절한 치환 될 수있다. 비오틴 yie을 최적화조작 된 세포주 LD, DTB 충분한 양의 세포에 제공되는.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
저자는 기꺼이 미국의 과학 연구의 공군 사무실에서 수상 FA9550-13-1-0108 지원을 인정합니다. 저자는 또한 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서 중요한 기술 및 응용 과학 연구소에서와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구에서 자금, 미국의 해군 연구소의 사무실에서 수상 N00014-15-1-2502의 지원을 인정 원정대 프로그램, 보너스 번호 1607310.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| LB 브로스, 밀러 | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| 카르베니실린 | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, 최소 염, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| 카사미노산 | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| 황산마그네슘, 무수 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| 염화칼슘, 이수화물 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| 포도당(D-포도당), 무수 | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB 터보 세포주 | New England Biolabs | C2984l | |
| 올리고뉴클레오티드 프라이머 | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N 합성, DSL 정제 |
| Q5 고충실도 중합효소 | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 반응 버퍼 | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP 솔루션 믹스 | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium 브로마이드, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| 겔 추출 키트 | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch 플라스미드 DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart 버퍼 | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA 리가제 | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase 반응 버퍼 | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle 유리 도금 비즈 | EMD Millipore | 7101-3 | |
| 글리세롤 | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| 이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-데스티오비오틴 (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| 숙시니미딜 트랜스-4-(말리미딜메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| 숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-비오틴 | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS), 10x 용액 | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin(SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| 디티오트레이톨 (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 에틸렌디아민테타아세트산 (EDTA) | 피셔 사이언티픽 | S311-500 | |
| 트윈 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 과산화수소 | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 원심 집중기 | Viva Products | VS0192 | |
| 아세트산 나트륨, 무수 | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96웰 폴리스티렌 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
참고문헌
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.<....
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