Este artigo apresenta uma série de protocolos para o desenvolvimento de células manipuladas e superfícies funcionalizadas que permitem sinteticamente engenharia E. coli para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis.
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Artigo de método
Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós desenvolvemos uma interface abiótico-bióticos que permite que as células manipuladas para controlar as propriedades do material de uma superfície funcionalizada. Este sistema é feito através da criação de dois módulos: um sinteticamente estirpe de células de E. coli e uma interface de material funcionalizado. Dentro deste artigo, detalhamos um protocolo para a engenharia genética de comportamentos selecionados dentro de uma estirpe de E. coli utilizando estratégias de clonagem molecular. Uma vez desenvolvidas, esta estirpe produz níveis elevados de biotina quando exposta a um indutor químico. Adicionalmente, protocolos para a criação de detalhe duas superfícies funcionalizadas diferentes, cada um dos quais é capaz de responder a biotina sintetizado por células. Tomados em conjunto, apresentamos uma metodologia para a criação de um sistema ligado, abiótico-biótico que permite que as células para controlar a composição do material e montagem em substratos inanimados engenharia.
Introdução
Aqui, relatamos os procedimentos para o desenvolvimento de um substrato programável capaz de responder a um sinal químico a partir de uma linha celular de engenharia. 1 Fazemos isso através da criação de uma interface de biotina-estreptavidina que responde a biotina produzida pelas células Escherichia coli sinteticamente engenharia (E. coli). Anteriormente, superfícies programáveis foram projetados para uma ampla gama de aplicações de detecção de toxina 2 e point-of-care diagnóstico 3 a defesa e segurança. 4 Enquanto superfícies programáveis podem ser úte....
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Protocolo
1. Mídia e Preparação Cultura
- Prepare meios caldo lisogenia (LB) por mistura de 25 g de pó de estoque LB com 1 L de água desionizada (Dl) e autoclavagem da solução a 121 ° C durante 20 minutos para esterilizar.
- Para preparar placas de LB, adicione 15 g de ágar (1,5%) para a mídia LB antes da esterilização
- Preparar soluções stock de carbenicilina 1.000x (Cb) em água Dl (50 mg / mL).
- Se preparando meios LB, que inclui um antibiótico para selecção de transformantes resistentes, espere até que a temperatura do meio LB esterilizado é inferior a 60 ° C e, em seguida, adicione 1 mL de estoque antibiótico para todos os....
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Resultados
Os resultados representativos são apresentados nas figuras em anexo cinco. Em primeiro lugar, é apresentado o processo de clonagem graficamente (Figura 1), de modo que o leitor pode acompanhar visualmente os passos críticos para criar a estirpe de E. coli sinteticamente. A fim de caracterizar a dinâmica das populações de células, que proporcionam uma curva de crescimento (Figura 2) gerado pela medição da densidade óptica a 600 nm (DO600)
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Discussão
Nós apresentamos uma nova estratégia para a interface células manipuladas viver com uma superfície do material funcionalizado. Isto foi conseguido através do desenvolvimento de uma linha de células capazes de sintetizar níveis elevados de biotina quando induzido com IPTG. Os níveis elevados de biotina pode então ser utilizado para modificar a superfície funcionalizada. Os protocolos detalhados como engenheiro da linha de células E. coli e como criar duas superfícies funcionalizadas diferentes.
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio do prémio FA9550-13-1-0108 da Força Aérea Instituto de Investigação Científica dos EUA. Os autores adicionalmente reconhecer o apoio da adjudicação N00014-15-1-2502 do Office of Naval Research dos EUA, o financiamento do Instituto de Tecnologia da Critical e Ciência Aplicada na Virginia Polytechnic Institute e State University, e da Science Foundation Graduate Research Nacional Programa de bolsas, concessão número 1.607.310.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caldo LB, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicilina | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Sais Minimimais, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Sulfato de Magnésio, Anidro | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Cloreto de Cálcio, Dihidratado | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glicose), Anidro | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Linha Celular | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotídeo Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N síntese, purificação DSL |
| Q5 Polimerase de alta fidelidade | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 tampão de reação | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Brometo, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Epoch Biolabs | 2260250 | ||
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidil Trans-4-(maleimidilmetil) Ciclohexano-1-Carboxilato (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidil 3-(2-piridilditio) Propionato (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotina | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Peroxidase de Rábano (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), Solução 10x | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ácido etilenodiaminoacético (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Peróxido de Hidrogênio | Fisher | Scientific H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) | Concentradores | Fisher Scientific AC229280050 | |
| Vivaspin 500 | Viva Products | VS0192 | |
| Acetato de Sódio, Placas de | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Anidro 96-Well | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
Referências
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.<....
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Reimpressões e permissões
