Este protocolo descreve uma metodologia detalhada para detectar a localização de2 H2O dentro Solea senegalensis espermatozoides usando um fluorocromo sensível Diniz Melo-para ROS, uma mancha de mitocôndrias ao vivo para a mitocôndria e DAPI para núcleos visualização, respectivamente. O protocolo é projetado para ser realizada até 2 horas com espermatozoides descongelados ou frescos.
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Artigo de método
Avaliação da localização intracelular de espécies reativas de oxigênio em espermatozoides de Solea Senegalensis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estresse oxidativo é um dos fatores importantes na diminuição da qualidade do esperma. Desenvolvimento de protocolos eficientes para a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de espermatozoides é de grande importância em qualquer espécie, mas esses métodos são usados raramente e ainda menos em teleósteos. Criopreservação é uma técnica útil na aquicultura para diferentes finalidades, incluindo bancos de genes e disponibilidade de esperma ao longo do ano. Procedimentos de congelamento/descongelamento pode causar a produção de ROS e danificar as células de esperma. Considerando os potenciais danos que um excesso de produção de ROS poderia causar em espermatozoides, dependendo da sua localização, aqui uma metodologia detalhada para detectar H2O2 e avaliar sua localização intracelular por microscopia confocal é fornecido. Para este efeito, uma combinação de 3 fluorochromes (2 ′, diacetato de 7 '-Dichlorodihydrofluorescein (Diniz Melo-DA), uma mancha de mitocôndrias ao vivo e 4 ′, dicloridrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) são usados para avaliar a localização co de H2O2 com núcleos de espermatozoides ou mitocôndrias em amostras de esperma de Solea senegalesis .
Introdução
A produção de espécies reativas de oxigênio tem sido associada com a qualidade do esperma recentemente1. Embora a produção de ROS na mitocôndria pode ser considerada um processo fisiológico normal, estresse oxidativo, por um excesso de produção de ROS é uma clara causa de danos no espermatozoide em diferentes níveis. Em humanos, estresse oxidativo está associado com a infertilidade masculina, alterando a motilidade e a capacidade de se submeter a capacitação2; em mamíferos, alteração da integridade do DNA em amostras de esperma congelado tem sido também relacionada à síntese de H2O2
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Protocolo
Nota: Incubação fluorocromo e confocal análise levará pelo menos 2-3 h para um controle e uma amostra tratada. Processamento de dados não está incluído no cálculo deste tempo. Os materiais necessários podem ser encontrados na Tabela de materiais. Este protocolo pode ser aplicado a espermatozoides frescos ou criopreservados. Solea senegalensis é uma espécie de peixe que desova em água fria, trabalho sempre sob condições de frio (4-7 ° C). Veja a Figura 1 para uma visão geral do protocolo.
1. os preparativos antes do experimento
- Prepare um 1mm mitocôndrias mancham solução stock....
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Resultados
Microscopia confocal é um método ideal para avaliação de ROS intracelular em teleósteos esperma. A combinação de três fluorochromes (DAPI, uma mancha de mitocôndrias e Diniz Melo-DA) apresentado neste estudo (Figura 1) fornece muitas informações úteis que podem ser aplicados em pesquisa básica e podem ter aplicações em melhorar os procedimentos utilizados na plantas industriais de aquicultura, como protocolos de criopreservação. Diferentes tipos de análise po.......
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Discussão
É sabido que as mitocôndrias são organelas chaves para motilidade espermática e função. Estas organelas estão simultaneamente diretamente envolvidas na produção de ROS. Curiosamente, níveis controlados de ROS são necessários para esperma adequado função1. Relações positivas entre fertilidade e estresse oxidativo tem sido demonstradas em mamíferos11 mas níveis excessivos afetam esperma qualidade12. Um fator crucial que pode ser decisivo para um efeito.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 custo de ação. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce foi financiado pela Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo Social Europeo. Os autores reconhecem a Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Agradecemos também a Paula Fernández Colado pela videografia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Diacetato de 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Microscopia Confocal | Zeiss | LSM800 | |
| Lamínulas | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Grau Analítico | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Metanol, Grau Analítico | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerVermelho Profundo | Microcentrífuga Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| (refrigerada) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| de BR717810 | Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | |
| Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
Referências
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.
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Reimpressões e permissões
