Summary
La prévention de la trichinellose humaine dans de nombreux pays à travers le monde est basée sur l'examen en laboratoire des échantillons musculaires provenant d'animaux sensibles par des méthodes de digestion, dont la méthode de l'agitateur magnétique est considéré comme l'étalon-or.
Abstract
La trichinellose est une maladie débilitante chez l' homme et est causée par la consommation de viande crue ou insuffisamment cuite d'animaux infectés par les larves de nématodes du genre Trichinella. Les sources les plus importantes d'infections humaines dans le monde entier sont la viande de gibier et de porc ou des produits du porc. Dans de nombreux pays, la prévention de la trichinellose humaine est basée sur l'identification des animaux infectés au moyen de la digestion artificielle d'échantillons de muscles à partir de carcasses des animaux sensibles.
Il existe plusieurs méthodes fondées sur la digestion de la viande, mais la méthode d'agitation magnétique est considéré comme l'étalon-or. Cette méthode permet la détection des larves de Trichinella par microscopie après la digestion enzymatique des échantillons de muscle et de la filtration et la sédimentation des étapes ultérieures. Bien que cette méthode ne nécessite pas d'équipement spécial et coûteux, les contrôles internes ne peuvent pas être utilisés. Par conséquent, la gestion de la qualité rigoureuse devrait être ApplieD tout au long du test. Le but de ce travail est de fournir des instructions de manipulation détaillées et des points de contrôle critiques de la méthode pour les analystes, sur la base de l'expérience du laboratoire de référence de l' Union européenne pour les parasites et le Laboratoire national de référence de l' Allemagne pour Trichinella.
Introduction
Les nématodes du genre Trichinella peuvent être détectés dans les muscles striés de carnivores et omnivores mammifères, les oiseaux et les reptiles dans le monde entier. Ces nématodes zoonotiques peuvent atteindre les êtres humains à l'état cru ou viande semi-brut et de produits carnés provenant de porcs, chevaux et animaux de jeu sont ingérés. Cette zoonose peut être une maladie grave chez l' homme , caractérisée par des signes et des symptômes pathognomoniques, par exemple la diarrhée, la fièvre, un oedème périorbitaire et des myalgies et des complications possibles telles que la myocardite, une maladie thromboembolique et l' encéphalite 1.
Trichinella spiralis est l'agent étiologique le plus répandu de l' infection à Trichinella chez les animaux sauvages et domestiques et provoque la plupart des infections humaines dans le monde entier. En Europe, du Nord et Afrique de l' Ouest et l' Asie occidentale, Trichinella britovi est une autre source d'infections humaines. En outre, dix autres taxons sont moins fréquemment rapportés comme responsable les agents de la maladie chez l' homme et se retrouvent dans les différentes régions du monde, le plus souvent chez les animaux sauvages 2. En plus d'animaux sauvages tels que le sanglier, les ours, les morses et les blaireaux, le porc représente la plus importante source d'infection humaine dans le monde entier.
La meilleure façon de prévenir la trichinellose est de ne pas manger les produits carnés crus et faire cuire de la viande, surtout la viande de gibier à des températures sécuritaires (> 65 ° C pendant 1 min, pour changer la couleur de la viande du rose au brun dans le noyau de la produit de viande) 3. L'Union européenne et l' USDA ont précisé congélation et de cuisson des temps et températures pour les produits de porc qui peuvent être utilisés pour tuer les larves de T. spiralis dans la viande 4, 5. En outre, des recommandations pour l'inactivation de Trichinella dans la viande et les produits carnés ont été publiés par la Commission internationale sur la trichinellose"xref"> 6. En Europe, en plus de l'introduction de conditions d'hébergement contrôlées dans les troupeaux de porcs commerciaux où le risque d'infection à Trichinella est négligeable, la prévention de la trichinellose humaine est basée sur l'examen en laboratoire des échantillons musculaires provenant d' animaux sensibles 4.
Pour des raisons de sécurité alimentaire, des essais de digestion sont les seules procédures fiables pour la détection directe des larves de Trichinella dans la viande 3, 7. Même s'il existe plusieurs variantes de l'essai de la digestion, le procédé d'agitation magnétique est la méthode admise au niveau international de référence 3, 4, 7. Ce dosage est basé sur la détection des larves de Trichinella dans les tissus musculaires striées. Après la digestion enzymatique des échantillons de muscle et de la filtration et la sédimentation des étapes ultérieures, TriLes larves chinella sont identifiées par microscopie. Selon les obligations commerciales et la législation nationale, il y a une multitude de petites variations dans le protocole général de la méthode de l'agitateur magnétique. Ici, les détails techniques sont basées sur des exigences de l' UE 4, les spécifications ISO 8, les lignes directrices des TIC 6, et l'expérience du laboratoire de référence de l' Union européenne pour les parasites (EURLP) et le Laboratoire allemand de référence pour Trichinella.
Protocol
1. Préparatifs
- Collecte d'échantillons
Note: La méthode de l'agitateur magnétique peut être utilisé pour des échantillons musculaires simples ou groupés.- Prélever des échantillons à partir des sites de prédilection appropriés et en une quantité appropriée 9. Reportez-vous aux exigences du pays ou aux recommandations des TIC, de l'OIE ou ISO.
- Pour l'Union européenne, par exemple, prendre un échantillon de 1 g d'un pilier de diaphragme à la transition vers la partie tendineuse des porcs domestiques. Veiller à ce que tous les échantillons de muscle sont exempts de toutes les graisses et le fascia.
- Si la languette est testée, enlever la couche superficielle avant l'essai.
- Prenez garde si les échantillons sont congelés, comme la plupart des larves de Trichinella ne sont pas geler résistants et déroulez après la mort, sont moins résistants à la digestion et ont tendance à coller aux parois du récipient, ce qui entraîne la sensibilité du test a diminué.
Remarque: En cas de gel, le double de la taille de l'échantillon à lest et augmenter le temps de sédimentation (voir ci-dessous).
- Prélever des échantillons à partir des sites de prédilection appropriés et en une quantité appropriée 9. Reportez-vous aux exigences du pays ou aux recommandations des TIC, de l'OIE ou ISO.
- Préparation du liquide de digestion
- Ajouter HCl à 25% (16 ± 0,5 ml) à 2 litres d'eau du robinet préchauffé à 46-48 ° C dans un bêcher de 3 L de verre. Trop faible d'un résultat de température dans la digestion incomplète; trop élevé d'une température désactive les propriétés enzymatiques de la pepsine.
- Placez une tige d'agitation dans le bécher, et agiter la solution sur une plaque préchauffée (46-48 ° C).
- Ajouter 10 ± 0,2 g de pepsine (1: 10 000 NF, 1: 12.500 BP 2000 FIP) à la solution acide.
Remarque: La qualité de la pepsine est de la plus haute importance et l'activité enzymatique doivent être certifiés par le producteur. Pour des raisons de sécurité en laboratoire et pour maintenir l'activité de la pepsine, la séquence d'addition des composants du liquide de digestion doit être respectée.
- La préparation d'échantillons de muscle
- Hacher jusqu'à 100 g d'échantillons de muscle dans un mélangeur ou un broyeur. Pour faciliter blending, ajouter 2 ml d'eau préchauffée aux échantillons et mélanger à la vitesse max pour 2 - 3 s.
- Avant le second mélange, ouvrir le mélangeur et transférer un échantillon de muscle en haut du bord marge bol de mélange vers le bas et répétez le mélange. Continuer le mélange avec des éclats de 2 - 3 s jusqu'à ce qu'aucun fragments visibles de viande restent.
Remarque: Trop peu de mélange peut entraîner une digestion incomplète, alors que trop de mélange peut endommager le Trichinella larves présentes dans les échantillons 6.
2. procédure
- Muscle digestion de l' échantillon
- Transfert 1 L du liquide de digestion dans un cylindre. Transférer la viande hachée dans le bécher et diffuser dans le liquide de digestion avec une cuillère ou une fourchette. Rincer soigneusement le bol couvercle du mélangeur, la lame et mélangeur avec 500 ml de liquide de digestion préchauffé dans le 3 L bêcher.
Remarque: le rinçage incomplet peut entraîner la perte du sensibilité. - Couvrir le bécher avec une feuille d'aluminium et de garder une température constante de 44-46 ° C et surveiller avec un thermomètre.
- Agiter le liquide de digestion pendant 30 min pour créer un tourbillon profond sans éclaboussures jusqu'à ce que les particules de viande disparaissent. Selon le type de viande testés (par exemple , la viande d'animaux sauvages), augmenter le temps de la digestion jusqu'à un maximum de 60 min.
- Transfert 1 L du liquide de digestion dans un cylindre. Transférer la viande hachée dans le bécher et diffuser dans le liquide de digestion avec une cuillère ou une fourchette. Rincer soigneusement le bol couvercle du mélangeur, la lame et mélangeur avec 500 ml de liquide de digestion préchauffé dans le 3 L bêcher.
- La filtration et la sédimentation du liquide de digestion
- Pour déterminer la quantité de tissu non digérés, ajuster la balance à zéro, peser le tamis avant utilisation, et noter son poids. Le tamis doit être propre et exempt de toutes les particules de tissu, ce qui pourrait entraver les larves de Trichinella atteindre l'entonnoir de sédimentation. Vérifiez que l'entonnoir de séparation est nivelé verticalement.
- Après digestion, versez délicatement le liquide de digestion à travers un tamis de 180 um dans une ampoule de verre de séparation. La largeur de l'entonnoir en verre de séparation ne doit pas be plus grand que 55% de la longueur pour permettre une bonne sédimentation des larves. Prenez soin d'éviter tout débordement.
- Pour éviter la perte de sensibilité, bien rincer le récipient en verre et le tamis avec environ 200 ml d'eau du robinet d'une bouteille de lavage de presser et transférer l'eau de rinçage dans l'entonnoir en verre de sédimentation. Prenez soin de rincer soigneusement les bords du 3 L bêcher. Soulevez le tamis et rincer la zone sous le tamis à fond.
- Détermination du montant des tissus non digérés
Remarque: En raison d'erreurs dans l'exécution de la méthode, le tissu musculaire peut rester sur le tamis, comme fascia bien et du tissu conjonctif qui sont indigestes. La quantité de tissu non digéré est déterminé pendant la première étape de sédimentation de 10 min (voir 2.5). Cela permet à environ 30 min pour le tamis à sécher, car l'eau résiduelle peut influencer le poids déterminé du tissu non digérés.- Placez une serviette en papier sur une échelle, et peser le tamis avec les undigestissus ted.
- Soustraire le poids de tamis avant la filtration à partir du poids de tamis avec des tissus non digérés. Le processus de digestion est considéré comme satisfaisant si pas plus de 5% du poids de l' échantillon de départ reste sur le tamis ( par exemple 5 g / 100 g de matière de départ).
- Si la quantité de tissu non digérés dépasse 5%, répéter le test en utilisant des échantillons de muscle frais. Si le tissu restant est principalement constitué de tissus musculaires non digérés et les échantillons frais ne sont pas disponibles, digérer les restes non digérés de nouveau et d'examiner en plus des échantillons originaux.
- Décantation du liquide de digestion
- Garder le liquide de digestion filtré dans l'ampoule à décanter pendant 30 min. Si elle reste intacte, les larves de Trichinella se déposent au fond de l'entonnoir.
- Si les échantillons congelés sont utilisés, augmenter le temps de sédimentation à un maximum de 60 min.
- Une fois que la sédimentation est terminée, ouvrir complètement le robinetde l'ampoule à décanter de laisser au moins 40 ml de liquide de digestion rapide de ruissellement dans un cylindre de mesure (80 mL si les échantillons musculaires avaient été préalablement congelés).
- Tout d'abord, laisser la moitié du fluide dans le cylindre, puis ouvrir complètement le robinet d'arrêt dans le sens opposé pour permettre à 10 ml de liquide de digestion à passer. Enfin, ouvrir le robinet dans le sens opposé pour 10 ml. Cette procédure garantit que les larves de Trichinella ne sont pas pris au piège dans le robinet.
Remarque: la vitesse suffisante est nécessaire pour éviter les larves restant dans l'ampoule à décanter, diminution de la sensibilité.
- Sédimentation du liquide de digestion dans le cylindre
- Laisser le sédiment dans le cylindre pendant 10 minutes pour permettre aux larves de sédiments. Retirer 30 ml surnageant par aspiration avec une pipette sans perturber le sédiment 10 mL.
- Pour réduire la quantité de fibres de tissus dans l'échantillon, ajouter 30 ml d'eau du robinet pour les sédiments et quitter pour un autre 10 mdans. Répétez jusqu'à ce que le liquide est clair.
- Retirer le surnageant et transférer lavé les 10 ml de sédiments dans une boîte de Petri grillagée ou d'un bassin de comptage des larves. Rincer le cylindre avec 10 ml d'eau du robinet, puis ajouter l'eau à l'échantillon.
Remarque: Comme de grandes quantités de débris dans l'échantillon peuvent empêcher l'identification des larves de Trichinella (Figure 1), d' autres étapes de lavage doivent être effectuées, si nécessaire.
- L' examen microscopique
- Utiliser un trichinoscope ou un stéréo-microscope avec une source de lumière transmise sous-étage d'intensité réglable à un 15 grossissement de 20X pour examiner les échantillons immédiatement après les étapes de lavage.
- Après avoir versé l'échantillon dans la boîte de Petri maillées, examiner le plat / bassin systématiquement grille en grille. Si aucune structure suspects sont trouvés, déplacez doucement le liquide dans la boîte de Pétri maillées ou d'un bassin de comptage des larves de façon circulaire pour permettre à toute la Trichinellarvae, qui ont été potentiellement négligé, d'accumuler dans le centre de la boîte de Pétri. Répétez l'examen.
- Si une structure suspect est trouvé, augmenter le grossissement de 40 - 100X. Retirer les larves de Trichinella du plat / bassin avec une pipette et de recueillir dans un tube avec 90% d' éthanol.
- Après le plat complet a été examiné, répétez la procédure, à partir de l'agitation douce du plat / bassin. Répétez la procédure au moins trois fois ou jusqu'à ce que plus les larves se trouvent.
- Comptez le nombre de larves. Corréler la quantité de tissu musculaire testé et présente sous forme de larves par gramme (lpg).
- Si un trop grand nombre de larves sont présentes dans le liquide de digestion pour déterminer le nombre de larves de manière fiable, retourner le fluide contenant les larves au cylindre de mesure, rincer à l'eau du robinet d'une bouteille de lavage de compression, et de laisser les larves à se déposer au fond.
- Après un temps de sédimentation de 10 minutes, réduire le surnageant dans un volume défini (par exemple ,10 ml). Pour déterminer le volume exact, transférer le surnageant dans un nouveau cylindre avec une pipette.
- Suspendre les larves de façon homogène dans le liquide par agitation vigoureuse. Pendant le mouvement secouant, ajouter 12 gouttes de 20 ul de suspension larvaire sur une boîte de Pétri.
- Examinez chaque goutte au microscope. Déterminer le nombre de larves dans 240 pi et supprimer le nombre le plus élevé et le plus bas. Extrapoler le nombre de larves au volume total (par exemple 10 ml) de surnageant.
Remarque: La qualité de la stéréo-microscope est d' une importance primordiale pour l'identification des larves de Trichinella. - Lorsque les larves sont collectées dans un tube par une pipette, vérifier soigneusement que les larves ne colle pas sur le mur de la pipette, mais sont transférés dans le tube.
Remarque: les résultats positifs Trichinella à partir d' échantillons mis en commun doivent faire remonter de la piscine à la carcasse d'origine. Ici, la taille de la piscine doit être progressivement diminuée jusqu'à ce que la carcasse positive est identifié. La taille de l'échantillon peut également être augmenté au cours de ce processus pour augmenter la sensibilité. Lorsque l'examen d'un échantillon collectif produit un résultat positif ou incertain, un échantillon de 20 g est prélevé sur chaque porc. Les échantillons de 20 g de cinq porcs sont réunies et examinées à l'aide du procédé décrit. De cette façon, des échantillons de 20 groupes de cinq porcs seront examinés. Lorsque Trichinella est détectée dans un échantillon groupé de cinq porcs, des échantillons de 20 g sont prélevés sur les porcs individuels dans le groupe et chacun est examiné séparément jusqu'à la carcasse positive de l' origine est détectée.
Representative Results
Après digestion, la forme de la larve musculaire infectieuse peut varier, ce qui rend l'identification plus difficile. Les formes typiques comprennent les larves étroitement enroulé, larves légèrement enroulé ou en forme de c ou larves complètement déroulé (figures 2B - 2C). Le nombre de larves trouvées par gramme peut varier considérablement et peut varier d'une larve à quelques centaines de larves.
La morphologie de la larve musculaire infectieuse est représentée sur la figure 2A. Les larves de Trichinella est de 0,7 à 1,5 mm de long et d' environ 0,3 mm de largeur. L'oesophage est étroite et a une extrémité légèrement arrondie. La cuticule est lisse. Dans la moitié antérieure de la cavité du corps, l'stichosome, une structure constituée d'un long tube mince entouré d'une rangée de 45 à 55 grandes cellules (stichocytes), on peut observer. Le rectum est également arrondi sans projections ou appendices 10, 11.
t "> D' autres structures, outre les larves de Trichinella, peuvent être trouvés après digestion musculaire Quelques exemples sont présentés dans les figures 3A -.. 3F Les animaux sauvages sont souvent infectés par d' autres parasites ou les échantillons de muscles disponibles pour les tests sont contaminés pendant le processus d'éviscération par animé ou des structures inanimées / organismes. la longueur des larves, l'apparition des extrémités antérieure et postérieure et la survenue de l'aide à stichosome pour discriminer entre les différents genres de nematodes 12.
Figure 1: Examen microscopique de Trichinella Larves Après (A) insuffisant et (B) suffisantes étapes de rinçage. Les barres d'échelle indiquent 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2: Morphologie de Infective Trichinella Larves Afficher le Rectum, stichosome et Oesophage de la Chenille (A). Formes possibles des larves musculaires après digestion montrant (B) étroitement enroulées et légèrement enroulées déplacer les larves et (C) déroulé larves. Les barres d'échelle indiquent 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Exemples de découvertes fortuites après Digestion de Muscle Les échantillons avec la méthode Agitateur magnétique. (A) cheveux poils ressemblant à desver de terre trouvé dans le sanglier; (B) Alaria alata de sanglier; (C) de la fibre musculaire de sanglier; (D) Metastrongylus sp. de sanglier; Fibre (E) de la plante trouvée dans le sanglier (F): Toxocara sp. larve de sanglier. Les barres d'échelle indiquent 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Bien que la méthode de l'agitateur magnétique peut être facilement réalisée, ne respectant strictement les détails techniques conduit à une sensibilité insuffisante, mettant ainsi en danger la santé des consommateurs. Les points de contrôle critiques ont été mis en évidence dans le texte ci-dessus. En outre, l'utilisation d'un équipement approprié est crucial pour le succès de l'essai. Tous les navires doivent être faits de bouts de verre et de pipettes revêtus de silicium pour réduire l'adhérence des larves à la surface.
La sensibilité de la méthode de digestion dépend de la densité des larves dans les muscles et la quantité d'échantillon de muscle testé. Une densité des larves de 3 - 5 gpl des tissus musculaires, une sensibilité de 100% a été signalée, mais inférieure à 1 gpl la sensibilité a chuté à 40% 13. En fonction de l'espèce animale hôte testé, la sensibilité du test peut être améliorée en augmentant la quantité d'échantillon utilisée. ifardeau nfection chez les animaux sauvages est généralement faible, donc de plus grandes tailles d' échantillons sont utilisés 14. Les sites de prédilection varient également chez les animaux hôtes. Ici, la plus faible digestibilité de certains tissus musculaires tels que la languette doit être prise en compte, ce qui peut également entraîner une plus grande taille des échantillons 15.
En outre, il est important de comprendre que le procédé d'agitation magnétique ne comprend pas les contrôles internes. Par conséquent, la gestion de l'assurance qualité de l'échantillonnage à la documentation est essentielle pour obtenir des résultats exacts et précis. La qualité de la performance du laboratoire pour détecter Trichinella larves dans les échantillons de muscle doit être contrôlée par une participation régulière de chaque analyste des tests de compétence.
D'autres limitations de la méthode est que la dernière étape d'identification des larves musculaires par microscopie est très subjective et HEAvily dépend de la connaissance de la morphologie larvaire par l'analyste d'examen.
Une méthode alternative intéressante pour contourner ce problème est la méthode d'agitation magnétique / l'isolement de filtration suivie d'une détection des larves par un test d'agglutination au latex. Toutefois, selon la législation de l' UE cette méthode est seulement considéré comme équivalent pour l'analyse de la viande de l' espèce porcine domestique , mais pas pour les animaux qui sont à risque élevé d'infection tels que le sanglier 4. L'identification de l'antigène larvaire avec des anticorps monoclonaux rend le test plus objectif, mais nie le laboratoire la possibilité de déterminer le nombre de larves par gramme de viande 16.
D'autres variantes de la méthode d'agitation magnétique comprennent la mise en commun digestion de l'échantillon technique / méthode de sédimentation assistée mécaniquement, la mise en commun dig échantillon assistée mécaniquementMéthode de estion / sur la technique d'isolation du filtre, et le procédé de digestion automatique des échantillons groupés de la technique allant jusqu'à 35 g. Ces techniques sont toutes basées sur la digestion artificielle de la viande et de la visualisation et le comptage des larves de Trichinella, mais diffèrent dans l'équipement utilisé pour la filtration et de sédimentation étapes.
Les larves isolé peut encore être identifié au niveau de l' espèce par un test moléculaire (PCR , par exemple, multiplex) 17. Selon la législation européenne, tous les échantillons positifs doivent être transmis au laboratoire national de référence ou EURLP pour la détermination de l' espèce Trichinella.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions de bien vouloir Sabine Reckinger pour une excellente assistance technique et de soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knife, Scissors, Tweezers | Cutting samples and removing non-digestible tissue | ||
| Blender | With a sharp chopping blade | ||
| Magnetic stirrer | With thermostatically controlled heating plate | ||
| Stirring Rod | Teflon-coated, approximately 5 cm long | ||
| Conical glass separation funnel | Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation. | ||
| Stands, rings and clamps | |||
| Sieve | Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh | ||
| Funnel | Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves | ||
| Glass beaker | Capacity 3 L | ||
| Glass measuring cylinder | Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube | ||
| Stereo-microscope | With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table | ||
| Petri dishes | 9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope | ||
| Aluminium foil | Alternatively a lid to cover the beakers | ||
| 25% hydrochloric acid | |||
| Pepsin | Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL | ||
| Ethanol | 70-90% ethyl alcohol | ||
| Tap water | Heated to 46-48 °C before use | ||
| Balance | Accurate to at least 0.1 g | ||
| Metal tray | Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice | ||
| Pipettes and pipette holder | Different sizes (1, 10 and 25 mL) | ||
| Thermometer | Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C | ||
| Siphon | For tap water |
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