Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

요약

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

초록

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC), 신경 그리고 glial 세포의 형태학 적 및 기능적 특성은 잘 보존 된. 이 모델은 neuroprotection, 뉴런, 신경 네트워크 또는 종양 침입에 electrophysiological 실험 연구를 포함 하는 다양 한 연구 질문을 해결 하는 데 적합 합니다. Hippocampal 건축과 multisynaptic 회로에 신경 활동은 잘 보존 OHSC, 비록 조각화 절차 자체가 처음 병 변 및 glial 흉터의 형성에 이르게. 흉터 형성 아마도 기계적 특성 및 작은 분자, 등의 방산 동작을 변경합니다. 분할 영역 동물 수술, 그리고 다양 한 두뇌 파생 된 셀 형식, 즉 이다, microglia 및 생리 적 및 병 적인 모두에서 뉴런 간의 상호 작용에 대 한 연구 없이 뇌 손상 후 시간 종속 프로세스의 모니터링 허용 조건입니다. 이 모델의 상반 된 측면 혈 및 면역 혈의 부재 이다. 신경 손상의 진행 하는 동안 혈액 재생 중요 한 역할에서에서 면역 세포를 마이그레이션. 그 셀은 조각에, 문화에 본질적인 프로세스 외부 간섭 없이 관찰 될 수 있습니다. 또한, OHSC에서 중간 외부 환경의 구성 정확 하 게 제어 됩니다. 이 방법의 더 이점은 표준 준비에 비해 희생된 동물의 낮은 수입니다. 몇몇 OHSC는 가능한 한 동물에서 여러 치료와 동시 연구를 만드는 하나의 동물에서 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, OHSC는 조직 손상 후 또는 종양 침공 기간 동안 새로운 보호 치료제의 효과 분석 하는 데 적합.

제시 하는 프로토콜 여기 매우 재현할 수 생성을 허용 하는 OHSC의 준비 방법에 설명 합니다, 그리고 잘 neuroprotection 또는 종양 침입 연구 처럼 실험적인 연구의 다양 한 사용할 수 있는 분할 영역을 보존.

서론

OHSC는 공부 microglia¹, 이다 및 신경 세포의 생리 및 병 적인 속성을 잘 특징이 생체 외에서 모델입니다. Extracellular 환경을 제어 하 고 다양 한 자극 후 셀룰러 및 형태학 상 변화를 모니터링 하는 것이 쉽습니다. Hippocampal 신경의 조직 및 그들의 연결 준비^2,3후 잘 보존 되어 있습니다. 여러 장점 중 OHSC 동물 수술 없이 뇌 상해와 종양 내 습의 모니터링 하실 수 있습니다. 6 ~ 8 OHSC 단일 설치류 두뇌에서 얻어질 수 있다. 크게 동물의 수를 줄이고 같은 동물에 여러 약물 농도, 유전자 조작 또는 다른 병 변 모델을 테스트 허용 OHSC 따라서 도움이 될. 분할 영역 기반 분석 실험에서 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 또한, 보조 손해 같은 병 적인 상태의 시간 종속 개발 시간 경과 영상에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다.

Stoppini 그 외 여러분 에 의해 원래 설립 주어진된 프로토콜에서 ⁴, 준비 단계는 설명 하 고 적절 한 조각의 선택에 대 한 중요....

프로토콜

에 의해 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU 유럽 의회의 승인으로 동물 실험 윤리 정책 및 신경 과학 연구에 있는 동물의 사용에 정책에 따라 수행 했다 고 과학적 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 유럽 연합의 위원회.

1. 준비의 악기와 문화 미디어

1. OHSC의 준비에 대 한 사용의 다음 세트: 2 개의 작은 위, 두 곡선된 핀셋, 좋은 팁, 한 트위터 (크기 11, 하나 크기 15의 2), 3 개의 블레이드 세 메스 홀더, 필터 종이 라운드 (직경: 35mm), 한 천, 한 면도날 하나 수정 파스퇴르 피 펫, 그리고 한 파스퇴르 피 펫 팁 없이 수정. ( 그림 1) 사용 전에 압력솥에 모든 재료를 소독.
2. 한 천 5 g의 무게와 증류수 100 mL 물에 용 해. 압력솥에 210.8 kPa에서 121.7 ° C에서 20 분에 대 한 솔루션을 소독. 60 mm 페 트리 요리를 멸 균 유리 피 펫을 사용 하 여 3 mL 액체 agar 솔루션 배포, 5 h에 대 한 강화, 오염을 방지 하 고 더 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 플라스틱 파라핀 영화 커버 수 있습니다. 한 블록 조각화 절차 동안 두뇌를 안정화 하는 데 필요한.
3. <....

결과

Neuroprotection 연구: 신경 손상, PI 긍정적인 핵과 IB₄ 가 이랑 (DG)의 립 세포 층 (GCL)의 모든 3 광학 섹션에서 microglia 계산 했다 긍정적인의 수를 결정 합니다. 종양 내 습 실험, 스택의 최대 강도 z 프로젝션 계산 침략의 다른 침입 패턴 (그림 6)를 시각화 하는 측정으로 종양 세포에 의해 커버 된 지역에 대 한 사용 되었습니다.

치료 컨트롤 OHSC (CTL)에서 신경 잘 보존 되 남아 있었다. DG의 GCL에 거의 아무 PI 긍정적인 신경 핵 (그림 5A) 관찰 되었다. 분자 층에서 microglial 셀의 대부분 ramified 했다. 만 년 DG의 GCL에 거.......

토론

현재 프로토콜 OHSC의 준비를 설명합니다. 이 모델은 내장 기능 및 뇌 조직의 반응의 생리 및 병리학 자극의 적용 후 테스트 수 있습니다. Electrophysiological 매개 변수 분석, 외 OHSC lesioned 수와 모든 세포 유형에 손상의 효과 확인할 수 있습니다. 다른 물질 및 lesioning 프로세스 또는 대 식 세포와 림프 톨의 부재에서 치유의 자세한 설명과 함께 치료 가능 하다.

The most 중요 한 단계는 성공적인 준비와 자란 있습니다: 1) 무 균 조건 하에서 작동, 2) 준비 미디어 제대로, pH, 온도 고려 하 고 3) OHSC의 처리 동안에 필요한 수동 손 재주를 개발.

OHSC의 특성

신경 세포의 변형된 형태 때문에 그들의 vivo에서-조직 같이, 조각 organot.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6-Well	Falcon	35-3046
Agar	Fluka	5040
Autoclav	Systec	DX-45
CFDA	Thermo Fisher	V12883
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) LSM700	Carl Zeiss
Eagle´ s 미니멀 에센셜 미디엄	Invitrogen	32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Labs	FL-1101
글루코스	머크	1083371000
글루타	민 Invitrogen	25030-024
Hank´ s 평형 염 용액 (Ca2+ 및 Mg2+)	Invitrogen	24020-133
Hank´ s 평형 염 용액(Ca2+  및 Mg2+)	Invitrogen	14170-138
Insulin	Sigma Aldrich	I5500
L-아스코르브산	Sigma Aldrich	A5960
L-글루타민	Invitrogen	25030-024
LN229	세포주-서비스	300363
의료용 시아노아크릴레이트 접착제(Histoacryl glue)	B.Braun	1050052
밀리셀 배양 인서트	Millipore	PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid	Sigma Aldrich	M3262
Normal Horse Seum	Invitrogen	26050-088
Penicillin Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Petri dish (모든 크기)	Greiner	627160/664160/628160
PFA	Roth	0335.1	독성
Propidium iodid (PI)	Sigma Aldrich	81845-25MG	독성
U138	ATCC	HTB-14
Vibratome	Leica Leica	VT 1200