Summary
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.
Abstract
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC), 신경 그리고 glial 세포의 형태학 적 및 기능적 특성은 잘 보존 된. 이 모델은 neuroprotection, 뉴런, 신경 네트워크 또는 종양 침입에 electrophysiological 실험 연구를 포함 하는 다양 한 연구 질문을 해결 하는 데 적합 합니다. Hippocampal 건축과 multisynaptic 회로에 신경 활동은 잘 보존 OHSC, 비록 조각화 절차 자체가 처음 병 변 및 glial 흉터의 형성에 이르게. 흉터 형성 아마도 기계적 특성 및 작은 분자, 등의 방산 동작을 변경합니다. 분할 영역 동물 수술, 그리고 다양 한 두뇌 파생 된 셀 형식, 즉 이다, microglia 및 생리 적 및 병 적인 모두에서 뉴런 간의 상호 작용에 대 한 연구 없이 뇌 손상 후 시간 종속 프로세스의 모니터링 허용 조건입니다. 이 모델의 상반 된 측면 혈 및 면역 혈의 부재 이다. 신경 손상의 진행 하는 동안 혈액 재생 중요 한 역할에서에서 면역 세포를 마이그레이션. 그 셀은 조각에, 문화에 본질적인 프로세스 외부 간섭 없이 관찰 될 수 있습니다. 또한, OHSC에서 중간 외부 환경의 구성 정확 하 게 제어 됩니다. 이 방법의 더 이점은 표준 준비에 비해 희생된 동물의 낮은 수입니다. 몇몇 OHSC는 가능한 한 동물에서 여러 치료와 동시 연구를 만드는 하나의 동물에서 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, OHSC는 조직 손상 후 또는 종양 침공 기간 동안 새로운 보호 치료제의 효과 분석 하는 데 적합.
제시 하는 프로토콜 여기 매우 재현할 수 생성을 허용 하는 OHSC의 준비 방법에 설명 합니다, 그리고 잘 neuroprotection 또는 종양 침입 연구 처럼 실험적인 연구의 다양 한 사용할 수 있는 분할 영역을 보존.
Introduction
OHSC는 공부 microglia1, 이다 및 신경 세포의 생리 및 병 적인 속성을 잘 특징이 생체 외에서 모델입니다. Extracellular 환경을 제어 하 고 다양 한 자극 후 셀룰러 및 형태학 상 변화를 모니터링 하는 것이 쉽습니다. Hippocampal 신경의 조직 및 그들의 연결 준비2,3후 잘 보존 되어 있습니다. 여러 장점 중 OHSC 동물 수술 없이 뇌 상해와 종양 내 습의 모니터링 하실 수 있습니다. 6 ~ 8 OHSC 단일 설치류 두뇌에서 얻어질 수 있다. 크게 동물의 수를 줄이고 같은 동물에 여러 약물 농도, 유전자 조작 또는 다른 병 변 모델을 테스트 허용 OHSC 따라서 도움이 될. 분할 영역 기반 분석 실험에서 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 또한, 보조 손해 같은 병 적인 상태의 시간 종속 개발 시간 경과 영상에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다.
Stoppini 그 외 여러분 에 의해 원래 설립 주어진된 프로토콜에서 4, 준비 단계는 설명 하 고 적절 한 조각의 선택에 대 한 중요 한 형태학 랜드마크 강조 표시 됩니다. 생 후 7-9 일 쥐 또는 산 후 4-5 일 쥐의 준비를 좋습니다. 이 기간에서 OHSC 기계적 충격 및 신경 회로의 개편을 위한 높은 잠재력에 강력한 저항을 표시. 반면, 배아 또는 성인 쥐에서 준비 급속 하 게 그들의 구조를 변경 재배 하는 동안 그들의 organotypic 형태를 잃고 고 따라서 덜 공부 하는 기초 연구5,6 장기 프로세스에 적합 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. OHSC의 생존 율에 대 한 또 다른 중요 한 포인트 확산 및 따라서 영양소 공급은 제한 된12,,1314조각 자체의 두께입니다.
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Protocol
에 의해 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU 유럽 의회의 승인으로 동물 실험 윤리 정책 및 신경 과학 연구에 있는 동물의 사용에 정책에 따라 수행 했다 고 과학적 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 유럽 연합의 위원회.
1. 준비의 악기와 문화 미디어
- OHSC의 준비에 대 한 사용의 다음 세트: 2 개의 작은 위, 두 곡선된 핀셋, 좋은 팁, 한 트위터 (크기 11, 하나 크기 15의 2), 3 개의 블레이드 세 메스 홀더, 필터 종이 라운드 (직경: 35mm), 한 천, 한 면도날 하나 수정 파스퇴르 피 펫, 그리고 한 파스퇴르 피 펫 팁 없이 수정. ( 그림 1) 사용 전에 압력솥에 모든 재료를 소독.
- 한 천 5 g의 무게와 증류수 100 mL 물에 용 해. 압력솥에 210.8 kPa에서 121.7 ° C에서 20 분에 대 한 솔루션을 소독. 60 mm 페 트리 요리를 멸 균 유리 피 펫을 사용 하 여 3 mL 액체 agar 솔루션 배포, 5 h에 대 한 강화, 오염을 방지 하 고 더 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 플라스틱 파라핀 영화 커버 수 있습니다. 한 블록 조각화 절차 동안 두뇌를 안정화 하는 데 필요한.
- 미디어
- 준비 매체 (pH 7.35)의 게 200 mL로 구성 된 198 mL 최소한의 필수 매체 (MEM)와 2 mL L-글루타민 솔루션 (최종 농도 2 m m). 미디어 준비의 날에는 솔루션을 준비 하 고 4에서 저장 ° c.
- 준비 49 mL MEM, 25 mL 행 크 스의 구성 된 문화 매체의 100 mL ' 균형 소금 솔루션 (HBSS), 25 mL (v/v) 정상 말 혈 청 (NHS), L-글루타민 솔루션 1 mL (최종 농도 2 m m), 100 µ g 인슐린, 혈당 120 mg, 10 mg 스 10000 U 페니실린과 800 µ g 비타민 C로 이전 보고. 따뜻한 매체 (37 ° C), pH 값 pH 7.4와 살 균 필터 (0.2 µ m 기 공 크기)을 조정. 매체를 변경 하기 전에 모든 둘째 날 (워밍업, pH 조정, 등.) 하는 절차를 반복 합니다. 1 주일 동안 매체를 가장 사용 하는 방법 4에 저장 될 때 ° c.
- 준비 중간 두뇌를 저장 한 35 mm 페 트리 접시를 채워. 작업 영역에서 냉각 팩에 조직을 수집 하기 위해 두 개의 빈 접시를 놓습니다.
2. 준비 하 고는 Vibratome와 썰
- 사용 두뇌 4-5 일 또는 7-9 일 오래 된 쥐에서 Stoppini 동부 표준시 알에 따르면 OHSC 준비에 대 한 오래 된 쥐. 4 후 동물의 잘린, 제거 피부 두개골에서가 위.
- 구멍 매그넘으로 좋은 시저의 블레이드를 소개 하 고 꼬리 (다시) rostral (프론트) 축 따라 절단 하 여 두개골을 엽니다. 두 게가 위가 각각 왼쪽과 오른쪽 귀 쪽으로 포인트를 첫 번째 수직 인하 (" T-절 개 ").
- 주목 하지 뇌 손상 미세 집게와 신중 하 게 두개골을 엽니다. 메스 (블레이드 크기 11)를 사용 하 여 정면 극과 소 뇌의 가장 rostral 부분을 잘라.
- 주걱의 두뇌를 제거 하 고 신중 하 게 준비 중간 ( 그림 2)으로 가득 페 트리 접시에 배치에 의해 의미 합니다. 두뇌 견본 홀더를 놓고 의료 cyanoacrylate 접착제로 그것을 수정 합니다. 한 천 조각을 사용 하 여 기계적인 안정화 보장.
- 350 µ m에 가로 조직 해 부 슬라이딩 vibratome를 사용 하 여 두꺼운 OHSC.
- 광학 쌍 안 현미경을 사용 하 여 분할 영역을 평가 합니다. 낮은 품질의 OHSC를 즉시 삭제 합니다. 만 그 조각 그대로 cytoarchitecture 해 마의 중간 부분에서 고립 된 데는 것이 중요 하다 (그림 3 및 4 참조)는 지 느 러 미 및 복 부 해 마 사이.
- Hippocampal 지역과 entorhinal 외피 (둥근 블레이드 크기 15; 메스를 사용 하 여 분리 그림 3)입니다. Perforant 통로 entorhinal 외피를 유지 해야 합니다.
- 6 ~ 8 OHSC 각 뇌에서 얻을 수 있습니다. 한 셀 문화 삽입 (기 공 크기 0.4 µ m)에 2-3 조각을 전송 하 고 잘 당 1 mL 문화 매체를 포함 하는 6-잘 문화 접시의 한 잘에.
- 5% (v/v) 공동 2 완벽 하 게 습도 분위기에서 35 ° C에서 6-잘 요리를 품 어 및 변경 세포 배양 매체 마다 둘째 날.
참고: 6 일간에 체 외에서 (div)에서 실험을 실시 합니다. 조각화 절차와 관련 된 염증 성 반응 하루 6 사라집니다. 이 단계에서 microglial 셀 다시 없는 형태 표시 고 시 냅 스 연결 성숙 했다.
3. 조직의 품질의 평가
- 고정, 라벨 및 OHSC 서에서 degenerating 신경의 시각화
- 실험을 수행한 후에 5 µ g/mL propidium 요오드 화물 (PI) 이전에 고정, 2 h와 OHSC를 품 어 degenerating 신경 세포의 핵을 얼룩 순서.
주의: PI는 의심 되는 발암 물질, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 항상 착용. - 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.4)와 OHSC를 세척 하 고 24 헤 대 한 paraformaldehyde (PFA)의 4% (v/v) 솔루션으로 해결
주의: PFA 의심과 독성 발암 물질 이다. 증기 두건에서 작업 및 보호구 착용. - 1 mL PBS와 삽입에는 OHSC를 세척 하 고 찡그린 브러시 막에서 분할 영역을 사용 하 여.
- 24-잘 접시 ( 그림 5)에 IB 4 염료와 OHSC 라벨.
- 실험을 수행한 후에 5 µ g/mL propidium 요오드 화물 (PI) 이전에 고정, 2 h와 OHSC를 품 어 degenerating 신경 세포의 핵을 얼룩 순서.
- 붙일 사용 하 여 종양 내 습 실험의 전도 라는 단일 셀
- 실험의 시작에 앞서 24 h 형광 염료 Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl를 사용 하 여 종양 세포를 라벨 에스테 르 (CFDA SE).
- 분리 Neubauer 챔버를 사용 하 여 종양 세포를 계산 하 고.
- 매체에 셀 서 스 펜 션의 10 µ L 원하는 휴대폰 번호 (일반적으로 50000 또는 100000 세포) 포함 되도록 resuspend.
- 슬라이스 문화에 세포 현 탁 액의 10 µ L을 적용 하 고 3 일에 대 한 침략을 세포 허용.
- 실험의 끝에, 4% (v/v) PFA 24 h를 사용 하 여 슬라이스 문화를 수정 하 고는 cytoarchitecture를 시각화 하기 위해 또 다른 24 h에 대 한 PI와 공동 문화를 라벨.
주의: PFA 의심과 독성 발암 물질 이다. 증기 두건에서 작업 및 보호구 착용. - 설치 미디어를 사용 하 여 추가 분석을 위해 커버 슬립에 공동 문화를 탑재.
4. OHSC 실험의 평가
는 OHSC confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 분석. PI의 감지 표시, 신경 세포를 변질 또는 파장 λ의 단색 광을 사용 하는 cytoarchitecture를 표시 하는 PI = 543 nm 및 방출 밴드 파장 λ에 대 한 필터를 통과 = 585-615 nm. CFDA 레이블이 종양 세포 또는 IB 4 microglia는 여기 파장 λ의 사용 = 488 nm. 두 실험 종류에 대 한 z-스택 2 µ m 두께 광 조각으로 기록 하 고 평가 대 한 사용.
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Representative Results
Neuroprotection 연구: 신경 손상, PI 긍정적인 핵과 IB4 가 이랑 (DG)의 립 세포 층 (GCL)의 모든 3 광학 섹션에서 microglia 계산 했다 긍정적인의 수를 결정 합니다. 종양 내 습 실험, 스택의 최대 강도 z 프로젝션 계산 침략의 다른 침입 패턴 (그림 6)를 시각화 하는 측정으로 종양 세포에 의해 커버 된 지역에 대 한 사용 되었습니다.
치료 컨트롤 OHSC (CTL)에서 신경 잘 보존 되 남아 있었다. DG의 GCL에 거의 아무 PI 긍정적인 신경 핵 (그림 5A) 관찰 되었다. 분자 층에서 microglial 셀의 대부분 ramified 했다. 만 년 DG의 GCL에 거의 IB4 긍정적인 microglial 셀 (그림 5A) 감지 했다. 50 µ M N-메 틸-D-aspartic 산 (NMDA)는 강한 부 화 후 PI 긍정적인 신경 핵 (그림 5B)의 수가 증가 하 고 제어 OHSC에 비해 IB4 긍정적인 microglial 셀 (그림 5B) 검색 되었습니다. 낮은 품질의 미리 손상 된 OHSC amoeboid microglia 및 제어 조건 하에서 DG (그림 5C)에서 PI 긍정적인 세포의 더 높은 숫자로 식별할 수 있습니다. NMDA와 사전 손상 된 조각 치료 DG cytoarchitecture와 매우 높은 수가 hilum CA3 영역 (그림 5D)를 확산 하는 PI 긍정적인 죽음 세포의 파괴에 지도 했다.
종양 침입 연구: 조각 (그림 6A) 두 세포종 세포 라인 U138의 50000 셀으로 치료 했다 및 LN229 (그림 6B) 3 일 동안. 두 경우 모두 조각 문화의 cytoarchitecture 그대로 남아 있고 뿔 ammonis와는 DG 유지 했다. 또한, 둘 다 세포 라인 명백한 침략 행동을 보였다. U138 셀 라운드, 명확 하 게 뚜렷한 종양 (그림 6A), 형성 하는 동안 LN229 셀 단일 종양 spheroids 내 종양 네트워크 건설과 자주 구별 하기 단단 했다. 슬라이스 문화에서 종양의 크기에서 볼 때, LN229 세포에 대 한 높은 침해 U138 세포와 비교할 때 발견 되었습니다.
그림 1: 해 부 도구 및 재료. 조각 문화의 준비, 해 부 도구와 재료의 적당 한 세트가 그림과 같이 필요 합니다. 세트는 포함 3 scalpels 작은 교환 블레이드, 한 주걱, 두 좋은 위, 3 집게, 한 정상적인 파스퇴르 피 펫, 팁 없이 한 파스퇴르 피 펫, 천, 접시, 필터 종이, 냉각 팩와 준비 매체, 의료 cyanoacrylate 접착제입니다. 해 부 도구 사용 전에 압력가 이어야 하며 메 마른 분위기에 그것을 유지 하는 플라스틱 패키지에 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 쥐 두뇌에서 hippocampal 형성 위치. 검은 점선으로 표시 된 hippocampal 형성, 대뇌 피 질과 시상으로 둘러싸인 양자 구조 이다. 해 마는 측면 뇌 실의 일시적인 경적으로 bulges. 해 마는 다른 내부 뿔 ammonis (해 마 적절 한)와 이랑 (또는 근 막이), 한 lamina 압 연으로 구성 된 bilaminar 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 쥐 OHSC의 시각화. OHSC를 포함 하는 전체 뇌 슬라이스 조직 품질을 평가 하는 눈에 의해 시각 이다. 분할 영역 (A, B) 냉각된 준비 중간으로 가득 페 트리 접시에 보관 됩니다. 뇌 조각의 확대입니다. 그대로 해 (HC) 마 그리고 entorhinal 외피 왼쪽 및 이미지 (C)의 오른쪽에 표시 됩니다. OHSC 두뇌의 나머지에서 분리 된다. DG, 뿔 ammonis 하위 CA1 및 CA3 hilus 지역 (HI), entorhinal 외피 (EC)와 분자 층 (ML)의 립 세포 층 (GCL)는 명확 하 게 구별할 수 (D). C, D: 눈금 막대 = 4 m m.
그림 4: OHSC에서 종속 변경 시간.
직접 준비, 후 microglia 이다 시작 glial 흉터를 형성 하기 위하여. 1-3 일에서 생체 외에서 (div) gliosis 및 부 종 형성에서 관찰 된다. Hippocampal 형성 및 DG의 층 리 더 이상 표시 됩니다. 세포 수준에서 5 div에 OHSC 활성화 된 셀의 수에 있는 감소를 표시 합니다. 6 div에 거의 없는 부 종 있으면 하 고 슬라이스는 얇은, 내장 신경 회로에 포함 된 지역 살아. OHSC는 실험에 대 한 지금 사용할 수 있습니다. 눈금 막대 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: CLSM 조직 품질 평가. CLSM 밝혀, 좋은 신경 보존 비 lesioned 제어 OHSC (CTL)에서 관찰 됩니다. 거의 아무 PI 긍정적인 신경 핵 (빨간색)와 몇 가지 IB4 긍정적인 microglial 셀만 (녹색) DG (A)의 립 세포 층 (GCL)에서 발견 된다. 달리 비 lesioned OHSC, PI와 IB4 긍정적인 세포의 수에 있는 강한 증가 NMDA-lesioned OHSC (B)의 GCL에 표시 됩니다. DG, 활성화 된 microglial 세포와 사전 손상 된 OHSC (C, D)에 PI 긍정적인 핵의 많은 수의 형태를 note 하십시오. 바 = 50 µ M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: CLSM에 의해 종양의 시각화. (빨간색)에 PI 적용 고정 라벨 후 OHSC, cytoarchitecture 동안 CFDA (녹색)에 조각에 침입 종양 세포를 보여 줍니다. U138 셀의 침공 과정 3 일 침공 시간 후 시각 이다. 단일 종양 spheroids명확 하 게 구별할 수 (A)는. 반면, 세포종 세포 라인 LN229 (B) 종양 네트워크 형성. 바 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
현재 프로토콜 OHSC의 준비를 설명합니다. 이 모델은 내장 기능 및 뇌 조직의 반응의 생리 및 병리학 자극의 적용 후 테스트 수 있습니다. Electrophysiological 매개 변수 분석, 외 OHSC lesioned 수와 모든 세포 유형에 손상의 효과 확인할 수 있습니다. 다른 물질 및 lesioning 프로세스 또는 대 식 세포와 림프 톨의 부재에서 치유의 자세한 설명과 함께 치료 가능 하다.
The most 중요 한 단계는 성공적인 준비와 자란 있습니다: 1) 무 균 조건 하에서 작동, 2) 준비 미디어 제대로, pH, 온도 고려 하 고 3) OHSC의 처리 동안에 필요한 수동 손 재주를 개발.
OHSC의 특성
신경 세포의 변형된 형태 때문에 그들의 vivo에서-조직 같이, 조각 organotypic 불린다. 지층 pyramidale 및 지층 granulosum, 피라미드 뿔 ammonis (CA1, CA2, CA3)와 DG 세분화 된 셀으로 구성 된 OHSC에 의하여 이루어져 있다. 해 마의 일부는 매우 주문 하 고 구심 섬유 예측 겹치지 않는 방법으로 명료한 층에서 종료. Entorhinal 외피 (perforant 통로), DG, 사이 efferences CA3 및 CA1 신경 준비 후 그대로 유지 하 고 그 비보를 기능적으로 유사한 행동. 이전 표시, 수지상 나무의 개발 OHSC에 세분화 된 세포의 시 냅 스 형성 및 네트워크 활동 시간 일치 컨트롤14,,1516에서 얻은 심각한 슬라이스를 비교할 수 있습니다.
Oligodendrocytes 고 이다 OHSC에는 빛과 전자 현미경에 의해 연구 되었습니다. Oligodendrocytes는 organotypic 공간 분포, 다른 형태학 하위17,18를 포함 하 여 표시 합니다. 또한, 축 삭 될 첫 번째 이주 체 외동안 myelinated. 일부 저자 가정 이다의 레이어 특정 지역화는 슬라이스 문화에서 결 석 하 고는 이다는 완전 성숙에 체 외에도달 하지 않습니다 믿습니다. 이 측면 수 없습니다 완전히 답변, 이다의 모든 활성화 단계에 대 한 특정 마커는 아직1,,1920실종 이후.
준비 후 첫 3 일 이내에 microglial 셀 마이그레이션 및 확산 반응 하 고 그들은 함께 이다 glial 흉터를 형성 하는 어디 조각 표면에 축적. 모든 셀 매우 활성화 상태에 있을 것 같다. 그러나, 내부 레이어 OHSC 고 3 및 6 div 사이에서 microglial 셀 작은 세포 시체 및 모든 방향21에서 긴 분기 잘 세포질 돌출 특징 없는 형태, 그들의 amoeboid 형태 변경 ,22.
유사한 식 및 글루타민 산 염 수용 체의 성인 조직 및 OHSC2,23에 보고 되었습니다. 시 냅 스 전류, 미니어처 시 냅 스 전류 및 전류 OHSC (7, 14 및 21 div)에 크게 다른 출생 후 일 14 또는 15에 각각 급성 준비에 비해 GABAergic의 주파수의 주파수. 대조적으로, glutamatergic 신호 주파수 급성 조각15보다 OHSC에서 높은 수준 이다.
다른 준비 방법의 비교
배아 및 조기 산 후 조직의 준비 매우 쉽습니다, 좋은 세포 생존 율 시험관에 때문에. 그것은이 초기 단계에서 신경 세포는 여전히 철새와 활성을 잃게 organotypic 조직 조각1의 것을 고려해 야 합니다. 생 후 7-9 일 후 쥐에 어떤 시 냅 스 연결 설정 됩니다. 다음 2-3 주에 동안 생체 외에서 시 냅 스13성숙. 제시 모델의 장점 중 하나는 준비와 동물 (7-9 일)1,,1424의 나이 높은 소성 동안 기계적인 외상에 그것의 저항입니다. 그것은 해야 합니다 언급 슬라이스는 기계적 조작에 매우 민감한 악기에 의해. 슬라이스도 잘못 각도 신경 섬유 참가자 또는 퇴행 성 신경 죽음에 대 한 책임의 경사 절단을 발생할 수 있습니다. 장기 목적을 위해 성인 동물에서 슬라이스 문화의 준비 도전 이며 아직 설립 하지. 이러한 OHSC 소성1의 손실로 인해 아마도 준비 직후 대규모 변성을 보여줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 거기 이다 강한 성인 조각 작업에 대 한 허용 하는 준비 방법에 대 한 필요.
몇 가지 준비 방법에 대 한 갓 삭제 조직 조직 헬기를 사용 하 여 격리 된 해 마를 300-400 µ m의 두께로 슬라이스는. 이 빠른 메서드는 광범위 한 조직 손상에 자주 발생할 수 있습니다. OHSC의 품질에 대 한 중요 한 요소는 그들의 마지막 두께 그들은 체 외에보관 되는 시간입니다. 300-400 µ m 두꺼운 조각에 대 한 생존 률이 높은 최상의 결과 달성 되었습니다. 두꺼운 조각에서 상위 계층 확산 제한1인 문화에 타락 한. 과학 질문, 따라 OHSC 준비 후 직접 또는 문화에 몇 일 후에 사용 됩니다. 따라서, 수 년에 걸쳐 여러 재배 기술, 설치 되었다 롤러 튜브 기술1,13 또는 정적 슬라이스 기법4.
다른 준비 방법에서 우리는 vibratome 함께 인터페이스 기술을 사용 하 여 날짜를 OHSC를 준비 하기 위한 가장 정확 하 고 가장 파괴적인 절차는 납득 된다. 이 방법은 다공성 멤브레인을 사용 하 여 더 향상 됩니다. OHSC 그들의 3 차원 구조를 유지, 개월, 형태학 상으로 그리고 기능적으로 그대로 유지 하 고 재배 기간25동안 시각적으로 평가 될 수 있습니다.
응용 프로그램
OHSC 야생 유형 및 유전자 변형 동물14,26에서 준비 될 수 있다. 그들은 달에 대 한 생존 하 고 장기 실험12,13에 대 한 옵션을 제공. OHSC 생리, 약리, 형태학 및 발달 질문14,27 에서 해결 하는 데 사용 됩니다 매우 표준예: neurotherapeutics 또는 줄기 세포 치료26,,2728의 만성 응용 프로그램 화 된 조건. 신경 연결 또는 프로세스의 개발 측면의 조사와 관련 된 시 냅 시스 전송, 시 냅 스가 소성, 피라미드 세포의 수지상 등뼈의 만성 간 질에의 영향 또는 모든 신생 대표 추가 필드 29,30,,3132.
조미료, 기본 흥분 성의 신경 전달 물질, 그리고 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체는 중앙에 역할 excitotoxicity. Excitotoxic 병 변 뇌졸중, Alzheimer 질병, HIV neurotoxicity, 외상 성 뇌 손상 및 복구 메커니즘14,24같은 신경 질환 중 발생합니다. 글루타민 산 염 수용 체 주 작동 근 NMDA의 응용 프로그램, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA), 또는 kainic 산 OHSC 모방 선택적 및 지역 특정 신경 세포 죽음26,28,33 ,34. 또한, 신경 부상을 예를 들어, microglial 마이그레이션 및 OHSC에 먹어서 glial 세포 반응 분석된3,35되었습니다 이전. Microglia 병 변 중의 영향 bisphosphonate clodronate36에 의해이 세포의 약리 고갈에 의해 예언 될 수 있다.
더 중요 한 응용 프로그램 OHSC를 사용 하 여 종양의 조사 조건 vivo에서 흉내 낸 발생 합니다. Spheroids glioma 셀 라인에 의해 형성 된 조각 문화, 그 종37겹치는 현상이 침입 할 수 있었다. 사용 되는 셀의 확산 침투 무늬37 vivo에서관찰 된 패턴을 닮았다. 또한, 기본 세포종 spheroids OHSC로 이식 그들의 침입을 잠재적인 보관 및 줄기 세포 생체 외에서몇 일38이상의 문자. 따라서, 모델 관찰을 침입 패턴 및 신경 조직 및37,38 vivo에서관찰 하는 그에 해당 하는 종양 세포 사이 상호 작용의 수 있습니다. 콜라겐 또는 젤에 비해 기반된 모델 (예:)39, OHSC 사용 하 여 뇌에 전이 및 종양 침입에 분석에 대 한 더 많은 도움이 보인다. 신경 그리고 glial 세포 유형 및 기질를 포함 하 여 생리 적 환경 그대로 남아 있습니다.
또한, OHSC 단일 종양 세포 및 제어 조건 하에서 뇌 조직 간의 직접적인 상호 작용을 공부 하 고 있습니다. 예를 들어 microglial 셀 침공35에 대 한 기본 구조를 형성 하 여 두뇌를 입력 하는 종양 세포의 기능 향상을 발견 했다.
또한, 내 습 프로세스에 임시 및 영구 셀룰러 변경의 효과 분석할 수 있습니다. 안정적인 표현의 glioma 세포에 전이 관련 된 결 장 암 유전자 1 (MACC1) 증가 확산 및 후속 침공40와 연관 되었다. 세포종 세포 라인에 셀 강성 과도 변경 셀 라인41의 침략 적 속성 직접 상관 했다. OHSC와 종양 세포 공동 문화 따라서 잠재적으로 사용할 수 있습니다 약물 검사, 임상 관찰, 그리고 매우 제어 하 고 표준화 된 조건 하에서 종양 내 습 모델 및 이미지 복제에 대 한.
1 차 셀 문화 연구, 후 OHSC는 vivo에서 조건을 좀 더 복잡 한 시스템에서 실험을 수행 하기 위한 논리 다음 선택. 뇌 조각에 대 한 관심의 또 다른 분야에서 비보를 테스트 하기 전에 잠재적인 치료 약의 심사입니다. 뇌 조각 모니터링 및 관찰자 제어와 동물 수술 없이 부상의 흉내 낸 수 있습니다. 8 OHSC 최대를 얻을 수 있다 고 필요한 동물의 수는 크게 감소. 그것은 비슷한 설정 하지만 다른 같은 동물 또는 여러 조건에서 결과 얻을 수 있습니다. 따라서, OHSC 병 변 기간, 2 차 손상 및 종양 확산의 개발 하는 동안 다른 형태학, 세포, 분자 변화를 관찰 하는 강력한 도구 이다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
저자는 크리스틴 Auste 그의 우수한 기술 지원에 대 한 비디오 녹화 및 종합 Ghadban 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. Urszula Grabiec 루 프로그램 FKZ 29/18에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
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