Summary
Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.
Abstract
Em culturas hippocampal fatia de organotypic (OHSC), as características morfológicas e funcionais dos neurônios e células gliais estão bem conservadas. Este modelo é apropriado para abordar questões de pesquisa diferentes que envolvem estudos na neuroproteção, eletrofisiológicos experiências em neurônios, redes neuronais ou invasão do tumor. A arquitetura hippocampal e atividade neuronal em circuitos multisynaptic estão bem conservados em OHSC, mesmo que o próprio procedimento corte inicialmente lesões e leva à formação de uma cicatriz glial. A formação de cicatriz presumivelmente altera as propriedades mecânicas e comportamento difusiva de pequenas moléculas, etc. Fatias de permitam o monitoramento de processos dependentes de tempo após a lesão cerebral sem cirurgia animal e estudos sobre interações entre vários tipos de células derivado do cérebro, ou seja, astrócitos, micróglia e neurônios sob fisiológicos e patológicos condições. Um aspecto ambivalente deste modelo é a ausência de fluxo sanguíneo e as células imunes do sangue. Durante a progressão da lesão neuronal, migração de células do sistema imunológico da peça sangue um papel importante. Como essas células estão falta em fatias, os processos intrínsecos da cultura podem ser observados sem interferência externa. Além disso, em OHSC a composição do ambiente externo médio é precisamente controlada. Uma vantagem adicional desse método é o menor número de animais sacrificados, em comparação com preparações padrão. Vários OHSC pode ser obtido de um animal, possibilitando estudos simultâneos com vários tratamentos em um animal. Por estas razões, OHSC são adequados para analisar os efeitos das novas terapias protetora após dano tecidual ou durante a invasão do tumor.
O protocolo apresentado aqui descreve um método de preparação de OHSC que permite gerar altamente reprodutível, bem preservado fatias que podem ser usadas para uma variedade de pesquisa experimental, como estudos de invasão de neuroproteção ou tumor.
Introduction
OHSC é um modelo bem caracterizadas em vitro para estudar propriedades fisiológicas e patológicas dos neurônios, astrócitos e microglia1. É fácil de controlar o ambiente extracelular e monitorar as mudanças morfológicas e celulares após vários estímulos. A organização dos neurônios hippocampal e suas conexões estão bem conservadas após preparação2,3. Fora várias vantagens, OHSC permitem o monitoramento da invasão de lesão e tumor cerebral sem cirurgia animal. Seis a oito OHSC pode ser obtido de um único cérebro de roedor. OHSC, portanto, ajudar a significativamente reduzir o número de animais e permitir testes várias concentrações de droga, manipulações genéticas ou modelos de lesão diferentes no mesmo animal. Fatia com base em ensaios, em condições experimentais podem ser precisamente controladas. Além disso, desenvolvimento dependente do tempo de condições patológicas como danos secundários facilmente pode ser monitorado pela imagem latente de lapso de tempo.
No protocolo determinado, originalmente estabelecido por Stoppini et al 4, as etapas de preparação são descritas e destacam-se importantes marcos morfológicos para a seleção de fatias apropriadas. Recomendamos a preparação de pós-Natal dia 7-9 ratos ou camundongos pós-Natal dia 4-5. Nesses períodos, OHSC mostram uma resistência robusta de traumas mecânicos e um elevado potencial para a reorganização dos circuitos neuronais. Em contraste, preparações de ratos embrionários ou adultos rapidamente mudam sua estrutura e perdem sua morfologia de organotypic durante o cultivo e, portanto, são menos adequadas para o estudo de processos a longo prazo em investigação básica5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. outro ponto crítico para a taxa de sobrevivência de OHSC é a espessura da fatia em si, como a difusão e, portanto, o fornecimento de nutrientes são limitadas12,13,14.
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Protocol
experiências em animais foram realizadas em conformidade com a política da ética e da política sobre a utilização de animais na investigação neurociência como aprovado pela Europeu comunidades Conselho Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho da União Europeia relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.
1. preparação dos instrumentos e meios de cultura
- para a preparação de OHSC usar o seguinte conjunto de instrumentos: duas tesouras pequenas, duas pinças curvas, uma pinça com ponta fina, três lâminas (duas de tamanho 11, um de tamanho 15), três suportes de bisturi, ronda os papéis de filtro (diâmetro: 35mm), agar, uma lâmina de barbear, um não modificado pipeta Pasteur, e um modificado pipeta Pasteur sem uma dica. Esterilize todos os materiais em autoclave antes do uso ( Figura 1).
- Pesa agar 5g e dissolvê-lo em 100 mL de água destilada. Esterilize a solução por 20 min a 121,7 ° C, a 210.8 kPa em autoclave. Distribuir a 3 mL de solução de ágar líquido em placas de Petri 60mm usando uma pipeta de vidro estéril, deixe-o solidificar por 5h, cubra com filme plástico parafina para evitar contaminação e armazenar a 4 ° C até nova utilização. Blocos de ágar são necessários para estabilizar o cérebro durante o procedimento de corte.
- Media
- fazer 200 mL do meio de preparação (pH 7,35) consistindo de meio essencial mínimo (MEM) de 198 mL e 2 mL de solução de L-glutamina (concentração final de 2 milímetros). Preparar a solução no dia da preparação de mídia e armazená-lo em 4 ° C.
- Preparar 100 mL de meio de cultura composto por 49 mL MEM, 25ml Hanks ' equilibrada soluções salinas (HBSS), soro de cavalo normal de 25 mL (v/v) (NHS), 1 mL de solução de L-glutamina (concentração final 2 mM), 100 µ g insulina, glicose de 120 mg, estreptomicina 10 mg , 10.000 U de penicilina e 800 µ g de vitamina C, como relatado anteriormente. Aquecer o meio (37 ° C), ajuste o valor de pH para filtro pH 7,4 e estéril (tamanho de poro de 0,2 µm). Repita o procedimento (aquecimento, ajuste de pH, etc.) em dois dias antes de mudar o meio. Utilize o meio, no máximo, por uma semana quando conservado a 4 ° C.
- Encha uma 35mm placa de Petri com meio de preparação para armazenar o cérebro. Coloque dois pratos de Petri vazia para coletar o tecido em um bloco de arrefecimento na área de trabalho.
2. Preparação e fatiar com uma Vibratome
- uso cérebros de ratos de 7-9 dias de idade ou 4 a 5 dias velhos ratos para a preparação de OHSC de acordo com Stoppini et al. 4 após a decapitação de animais, retire a pele do crânio com uma tesoura.
- Introduzir a lâmina de uma tesoura bem o buraco occipital e abrir o crânio por corte ao longo do eixo (dianteiro) (volta) rostral caudal. Fazer dois cortes perpendiculares ao primeiro, para que a tesoura aponta para a orelha esquerda e direita, respectivamente (" T-incisão ").
- Abrir o crânio cuidadosamente com a pinça fina, prestando atenção para não machucar o cérebro. Usar um bisturi (tamanho da lâmina 11) para cortar a parte mais rostral do polo frontal e o cerebelo.
- Por meio de uma espátula, retire o cérebro e coloque-o cuidadosamente na caixa de Petri preenchida com meio de preparação ( Figura 2). Posicione o cérebro sobre o suporte de amostra e corrigi-lo com cola de cianoacrilato médica. Usar as peças do ágar para assegurar a estabilização mecânica.
- Dissecar o tecido horizontalmente em 350 µm espessura OHSC usando um deslizamento vibratome.
- Avaliar as fatias opticamente, usando um microscópio binocular. OHSC de baixa qualidade descarte imediatamente. É importante tomar somente aquelas fatias com cytoarchitecture intacto, isolado da parte média do hipocampo (ver figuras 3 e 4) entre a dorsal e ventral hipocampo.
- Separar a região do hipocampo e córtex entorhinal usando um bisturi (redondo, tamanho da lâmina 15; a Figura 3). Deve ser preservado o córtex de percurso e entorhinal perforant.
- OHSC de seis a oito são obtidos de cada cérebro. 2-3 fatias de transferência para inserção de cultura de uma célula (poros tamanho 0.4 µm) e colocá-lo em um poço de um prato de cultura 6-poços contendo 1 mL de meio de cultura por alvéolo.
- Incubar os pratos 6-poços em 35 ° C em uma atmosfera totalmente umidificada com 5% (v/v) de CO 2 e mudar o meio de cultura celular cada segundo dia.
Nota: Realizar suas experiências no dia 6 em vitro (div). Reações inflamatórias associadas com o fatiamento procedimento desaparecem por dia 6. Nesta fase, as células de microglial apresentam uma morfologia ramificam novamente e conexões sinápticas amadureceram.
3. Avaliação da qualidade do tecido
- fixação, rotulagem e visualização de neurônios degeneram em OHSC
- após a realização dos experimentos, incubar o OHSC com iodeto de propidium 5 µ g/mL (PI) por 2 h antes da fixação, em ordem para manchar os núcleos dos neurônios degeneram.
Atenção: O PI é um suspeito cancerígeno, use sempre equipamentos de proteção individual (EPI) tais como luvas. - Lavar o OHSC com tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4) e corrigi-los com uma solução de 4% (v/v) de paraformaldeído (PFA) por 24 h.
Cuidado: PFA é um carcinógeno tóxico e suspeito. Trabalhar sob a coifa e usar EPI. - Lavar o OHSC em inserções com 1 mL de PBS e use um pincel de rigger para separar as fatias da membrana.
- Rotular o OHSC com tintura de IB 4 em uma placa de 24 ( Figura 5).
- após a realização dos experimentos, incubar o OHSC com iodeto de propidium 5 µ g/mL (PI) por 2 h antes da fixação, em ordem para manchar os núcleos dos neurônios degeneram.
- Condução de experimentos de invasão do tumor usando fluorescente etiquetado células únicas
- 24 h antes do início do experimento, rotular as células do tumor, usando o tintura fluorescente Carboxyfluorescein diacetato grufo éster (SE CFDA).
- Desanexar e contar as células de tumor utilizando uma câmara de Neubauer.
- Ressuspender as células em meio, tal que 10 µ l de suspensão contém o número de celular desejado (normalmente 50.000 ou 100.000 células).
- Aplicar 10 µ l de suspensão de célula para a cultura de fatia e permitir que as células para invadir por 3 dias.
- No final do experimento, corrigir as culturas fatia usando 4% (v/v) PFA para 24h e rotular as culturas co com PI para outro 24h para visualizar o cytoarchitecture.
Cuidado: PFA é um carcinógeno tóxico e suspeito. Trabalhar sob a coifa e usar EPI. - Montar as culturas co em uma lamela para posterior análise utilizando o meio de montagem.
4. Avaliação das experiências de OHSC
analisar o OHSC com um laser confocal microscópio (CLSM). Para a deteção de PI rotulado, degenerando neurônios ou o PI rotulado cytoarchitecture usar a luz monocromática do comprimento de onda λ = 543 nm e uma banda de emissão passam filtro para comprimentos de onda λ = 585-615 nm. Para o CFDA rotulado de células tumorais ou IB 4 micróglia, usar um comprimento de onda de excitação de λ = 488 nm. Para ambos os tipos experimentais, gravar uma z-pilha com µm 2 fatias grossas de óptica e usado para a avaliação.
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Representative Results
Estudos de neuroproteção: Para determinar o dano neuronal, o número de núcleos positivos de PI e IB4 positivo microglia em cada terceira secção óptica da camada de células grânulo (GCL) de giro do pectínea (DG) foi contado. Para experiências de invasão do tumor, o z-projeção de intensidade máxima da pilha foi usado para calcular a área coberta por células tumorais, como uma medida de invasão e Visualizar padrões diferentes de invasão (Figura 6).
No controle não tratado OHSC (CTL), os neurônios permaneceram bem preservados. No GCL da DG, observaram-se quase nenhum PI positivo neuronais núcleos (Figura 5A). Na camada molecular, a maioria das pilhas microglial foram ramificada. No GCL da DG, apenas muito poucos IB4 positivo microglial células (Figura 5A) foram detectadas. Após a incubação com 50 µM N-metil-D ácido aspártico (NMDA) um forte aumento do número de núcleos de neuronal positivos de PI (Figura 5B) e IB4 positivo microglial células (Figura 5B) foi detectado quando comparado com o controle OHSC. OHSC pre-danificado de qualidade inferior pode ser identificado por um número maior de micróglia ameboide e células positivas de PI no DG (Figura 5), sob condições de controle. Tratamento de fatias previamente danificadas com NMDA levou à destruição da DG cytoarchitecture e um número muito elevado de células de PI positivo morte se espalhando para o Hilo e a região CA3 (Figura 5).
Estudos de invasão do tumor: As fatias foram tratadas com 50.000 células das duas linhas de célula glioblastoma U138 (figura 6A) e LN229 (Figura 6B) por três dias. Em ambos os casos a cytoarchitecture das culturas fatia permaneceu intacta e o DG e o cornu ammonis foram preservados. Além disso, ambos células linhas mostrou comportamento distinto da invasão. Enquanto as células U138 formaram redondos, claramente distintos tumores (figura 6A), células de LN229 construíram uma rede de tumor dentro de esferoides tumor único e eram muitas vezes difícil de distinguir. Quando se olha para a quantidade de massa tumoral em culturas de fatia, uma maior capacidade de invasão para células LN229 foi encontrada quando comparado com as células U138.
Figura 1: materiais e ferramentas de dissecação. Para a preparação das culturas de fatia, um conjunto adequado de materiais e ferramentas de dissecação é necessário como mostrado. O conjunto inclui três bisturis com pequenas lâminas intercambiáveis, uma espátula, tesoura bem duas, três pinças, uma pipeta de Pasteur normal, uma pipeta Pasteur, sem ponta, ágar, pratos de Petri, papel de filtro, um bloco de arrefecimento, médio de preparação e medical cola de cianoacrilato. As ferramentas de dissecação devem ser esterilizadas antes do uso e colocado numa embalagem plástica para mantê-lo em um ambiente estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: localização da formação hipocampo no cérebro de ratos. A formação hippocampal, mostrada pela linha pontilhada preta é uma estrutura bilateral fechada por córtex cerebral e o tálamo. As protuberâncias do hipocampo para o corno temporal do ventrículo lateral. O hipocampo é bilaminar, consistindo o cornu ammonis (hipocampo adequado) e o pectínea giro (ou fáscia pectínea), com uma lâmina enrolada dentro do outro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: visualização de rato OHSC. Uma fatia do cérebro inteiro contendo OHSC é visualizada por um binóculo para avaliar a qualidade do tecido. As fatias são mantidas em uma placa de Petri preenchida com médio de preparação de refrigeração (A, B). Ampliação da fatia cerebral. O hipocampo intacto (HC) e o córtex entorhinal são visíveis à esquerda e à direita da imagem (C). OHSC é separada do resto do cérebro. A camada de células grânulo (GCL) da DG, os subcampos de ammonis cornu CA1 e CA3, a região de Hilo (HI), o córtex entorhinal (CE) e a camada molecular (ML) são claramente distinguíveis (D). C, D: barra de escala = 4 mm.
Figura 4: Alterações dependentes de tempo em OHSC.
Diretamente após o preparo, microglia e astrócitos começam a formar uma cicatriz glial. De 1-3 dias em vitro (div) gliose e edema formação são observados. Estratificação da formação do hipocampo e DG não é mais visível. A nível celular, OHSC na div 5 exibir uma redução no número de células ativadas. Em 6 div, quase nenhum edema está presente, a fatia é mais fina e as áreas incluídas nos circuitos neuronais intrínsecos sobreviveram. OHSC agora pode ser usado para os experimentos. Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: avaliação da qualidade do tecido por CLSM. Como revelado por CLSM, observa-se uma boa preservação neuronal no OHSC (CTL), controle de não-lesionado. Praticamente nenhum PI positivo neuronais núcleos (vermelhos) e apenas alguns IB4 positivo microglial células (verdes) são encontradas na camada de célula grânulo (GCL) da DG (A). Em contraste com OHSC não-lesionado, um forte aumento do número de células positivas4 PI e IB é visível no GCL de NMDA-lesado OHSC (B). Por favor, note a morfologia da DG, pilhas microglial registrados e um grande número de núcleos positivos de PI em pre-danificado OHSC (C, D). Bares = 50 µM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: visualização de invasão do tumor por CLSM. PI (em vermelho) aplicada após os rótulos de fixação do cytoarchitecture do OHSC, enquanto CFDA (em verde) ilustra as células do tumor invadindo a fatia. O processo de invasão de células U138 é visualizado após três dias de tempo de invasão. Esferoides tumor únicosão claramente distinguíveis (A). Em contraste, a linhagem de células de glioblastoma LN229 formou uma rede de tumor (B). Bares = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo descreve a preparação de OHSC. Esse modelo permite que o teste de recursos intrínsecos e reações do tecido cerebral após a aplicação de estímulos fisiológicos e patológicos. Além de análises de parâmetros eletrofisiológicos, OHSC pode ser lesado e os efeitos de dano em todos os tipos de células podem ser determinados. Tratamento com substâncias diferentes e a descrição detalhada dos processos de maciços ou na ausência de macrófagos e linfócitos de cura é possível.
The Most passos críticos para uma bem sucedida preparação e cultivo são para: 1) trabalham em condições estéreis, 2) preparar a mídia corretamente, considerando temperatura e pH e 3) desenvolver a destreza manual necessária durante a manipulação de OHSC.
Características da OHSC
Por causa da morfologia inalterada de células neuronais e seus na vivo-como organização, as fatias são chamadas organotypic. O OHSC consistem o estrato pyramidale e estrato granuloso, composto por células granulares DG e piramidal cornu ammonis (CA1, CA2, CA3). Partes do hipocampo são altamente ordenadas e as projeções de fibra aferente encerrar em camadas distintas, de forma não-sobreposição. Os efferences entre o córtex entorhinal (via perforant), DG, CA3 e CA1 neurônios permanecem intactos após o preparo e comportar-se funcionalmente semelhantes a esses em vivo. Como mostrado anteriormente, o desenvolvimento das árvores dendríticas, actividades de formação e rede sinapse as células granulares em OHSC são comparáveis às fatias agudas, obtidas a partir de controles de tempo correspondido a14,15,16.
Oligodendrócitos e astrócitos têm sido estudados em OHSC pela luz e microscopia eletrônica. Oligodendrócitos exibem uma distribuição espacial de organotypic, incluindo diferentes subtipos morfológicos17,18. Além disso, os axônios se tornar mielinizados durante a primeira de duas semanas em vitro. Alguns autores postularam que a localização específica da camada de astrócitos é ausente em culturas de fatia e acreditar que os astrócitos não atingem a plena maturação em vitro. Este aspecto não pode ser respondido totalmente, desde que os marcadores específicos para todas as etapas de ativação de astrócitos ainda estão faltando1,19,20.
Nos primeiros 3 dias após o preparo, microglial células respondem com proliferação e migração em se acumulam na superfície da fatia, onde formam a cicatriz glial juntamente com astrócitos. Todas as células parecem estar em um estado altamente ativado. No entanto, em camadas interiores de OHSC e entre 3 e 6 div, pilhas microglial alterar sua morfologia ameboide para uma forma ramificada, caracterizada por pequenos corpos celulares e longa ramificação saliências citoplasmáticas bem estendidas em todas as direções21 ,22.
Expressão e distribuição dos receptores de glutamato semelhantes têm sido relatados em tecido adulto e OHSC2,23. A frequência das correntes sinápticas, as correntes sinápticas em miniatura e a frequência de gabaérgica correntes no OHSC (div 7, 14 e 21) não são significativamente diferentes em comparação com preparações agudas pós-natal dias 14 ou 15 respectivamente. Em contraste, a frequência dos sinais glutamatérgico é maior em OHSC do que em fatias aguda15.
Comparação dos métodos de preparação diferentes
A preparação do tecido pós-natal embrionário e no início é muito fácil, por causa da célula boa sobrevivência taxas em vitro. É preciso considerar que, nesta fase inicial, as células neuronais são ainda migratórias e ativo conduz a uma perda de organotypic organização de fatias1. Depois de 7-9 dias pós-natal, são estabelecidas algumas conexões sinápticas em ratos. Durante os próximos 2-3 semanas em vitro as sinapses maduras13. Uma das vantagens do modelo apresentado é sua resistência ao trauma mecânico durante a preparação e a sua plasticidade elevada devido à idade dos animais (7-9 dias)1,14,24. Deve ser mencionado que as fatias são altamente sensíveis à manipulações mecânicas por instrumentos. Nem o ângulo errado de corte pode causar corte de inclinação das fibras neuronais responsáveis pela anterógrada ou retrógrada morte neuronal. A preparação das culturas de fatia de animais adultos para efeitos a longo prazo é um desafio e ainda não estabelecida. Tal OHSC mostrar uma degeneração maciça logo após a preparação, presumivelmente devido à perda de plasticidade1. No entanto, há uma forte necessidade para um método de preparação, permitindo trabalhar com fatias de adultas.
Para vários métodos de preparação, o tecido fresco excisado é cortado a uma espessura de 300-400 µm, usando um helicóptero de tecido para cortar o hipocampo isolado. Este método rápido com frequência pode resultar em dano tecidual generalizada. Fatores críticos para a qualidade de OHSC são sua espessura final e o tempo que são mantidos em vitro. Foram obtidos os melhores resultados com as maiores taxas de sobrevivência para 300-400 µm de espessura. Em fatias mais grossas as camadas superiores degeneram-se durante o tempo de cultura devido a limitações de difusão1. Dependendo as científicas perguntas, OHSC são usados diretamente após o preparo ou depois de vários dias em cultura. Portanto, ao longo dos anos várias técnicas de cultivo foram estabelecidas, como o rolo-tubo técnica1,13 ou estático fatia técnicas4.
De métodos de preparação diferentes estamos convencidos de que usando a interface técnica juntamente com um vibratome é o procedimento mais preciso e menos prejudicial para a preparação de OHSC até à data. Este método é melhorado com o uso de membranas porosas. OHSC manter sua estrutura 3D, ficar meses morfologicamente e funcionalmente intacto e visualmente pode ser avaliada durante o período de cultivo25.
Aplicações
OHSC pode ser preparado do tipo selvagem e animais transgénicos14,26. Eles sobrevivem por meses e oferecem opções para longo prazo experimentos12,13. OHSC são usados para abordar questões fisiológicas, farmacológicas, morfológicas e de desenvolvimento de14,27 sob altamente padrãoized condições tais como aplicação crônica do neurotherapeutics ou células estaminais terapia26,,27,28. A investigação dos aspectos do desenvolvimento da conectividade neuronal ou processos relacionados com a transmissão sináptica, plasticidade sináptica, efeitos de epilepsia crônica de espinhas dendríticas das células piramidais, ou neurogênese todos representam campos adicionais 2930,de,31,32.
Glutamato, o principal neurotransmissor excitatório e receptores de glutamato geleificação desempenham um papel central na excitotoxicidade. Excitotoxic lesões ocorrem durante doenças neurológicas como o acidente vascular cerebral, doença Alzheimer, neurotoxicidade HIV, traumatismo crânio-encefálico e mecanismos de reparação14,24. Aplicação dos agonistas dos receptores de glutamato NMDA, ácido α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic (Leandro) ou ácido kainic OHSC imita seletiva e região célula neuronal específica morte26,28,33 ,34. Além disso, resposta da célula glial para lesão neuronal , por exemplo, migração microglial e fagocitose em OHSC anteriormente foram analisados3,35. A influência da microglia durante a lesão pode ser prevista por depleção farmacológica dessas células pelo bifosfonato clodronato36.
Uma aplicação mais importante surge imitando na vivo condições para investigações de invasão do tumor usando OHSC. Esferoides formadas por linhas de células de glioma eram capazes de invadir as culturas de fatia, um fenômeno que foi a espécie de sobreposição de37. O padrão de infiltração difusa das linhas celulares usados assemelhava-se o padrão observado na vivo37. Além disso, glioblastoma primário esferoides implantadas no OHSC manteve sua invasão potencial e células-tronco de personagens ao longo de vários dias em vitro38. Assim, o modelo permite a observação de padrões de invasão e interações entre o tecido neuronal e células tumorais que correspondem àqueles observados na vivo37,38. Em comparação com colágeno ou gel baseado em modelos (por exemplo)39, o uso de OHSC parece mais benéfico para análises sobre a invasão de metástase e tumor no cérebro. O meio fisiológico, incluindo tipos de células gliais e neuronais e matriz extracelular, permanece intacto.
Além disso, OHSC permitem estudar interações diretas entre as células do tumor único e tecido cerebral em condições controladas. Por exemplo, pilhas microglial foram encontradas para aumentar a capacidade das células do tumor para entrar no cérebro, formando estruturas orientadores para invasão35.
Além disso, o efeito de alterações celulares transitórias e permanentes sobre os processos de invasão pode ser analisado. Um expressao do gene de câncer de cólon metástase associado 1 (MACC1) em células de glioma foi associado com um aumento de proliferação e invasão subsequente40. A alteração transitória da rigidez da célula em linhas de células de glioblastoma correlacionou-se directamente com as propriedades invasivas da célula linhas41. Culturas celulares co OHSC e tumor, portanto, potencialmente podem ser usadas para testes, reprodução de observações clínicas e a invasão de tumor modelo e imagem sob condições padronizadas e altamente controladas de drogas.
Após estudos em culturas de células primárias, OHSC são a escolha lógica próxima para a realização de experiências em um sistema mais complexo para aproximar as condições na vivo . Outro campo de interesse em fatias do cérebro é a triagem de drogas terapêuticas potenciais antes de testar em vivo. Fatias de cérebro permitem monitoramento e imitando dos ferimentos sob controle do observador e sem cirurgia animal. Até 8 OHSC pode ser obtida e o número de animais necessários é significativamente reduzido. É possível obter resultados no mesmo animal sob configurações semelhantes, mas com diferentes ou várias condições. Assim, a OHSC é uma ferramenta poderosa para observar, entre outros, alterações morfológicas, moleculares e celulares durante o período de lesão, desenvolvimento de danos secundários e espalhar o tumor.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Christine Auste o seu apoio com a gravação de vídeo e Chalid Ghadban por sua excelente assistência técnica. Urszula Grabiec foi apoiada pelo Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
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