방법 논문

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

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DOI:

10.3791/55412

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2017년 3월 30일

 ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory for Artificial Microstructures and Mesoscopic Physics, School of Physics, Peking University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences at Center for Quantitative Biology, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

이 논문에서

요약

이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.

초록

싹트는 효모 Saccharomyces cerevisiae는 노화 연구에서 중요한 모델 유기체입니다. 유전학 연구는 여러 종에 걸쳐 수명에 보존된 효과를 가진 많은 유전자를 밝혀냈습니다. 그러나 노화와 죽음의 분자적 원인은 여전히 파악하기 어렵습니다. 효모 노화의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 체계적인 이해를 얻기 위해서는 수명을 측정하고 단일 세포에서 다양한 세포 및 분자 표현형을 정량화할 수 있는 고처리량 방법이 필요합니다. 이전에는 신생아 딸 세포를 씻어내는 동시에 수명 동안 싹이 트는 효모 모세포를 추적하는 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 기사에서는 미세유체 칩을 준비하고 미세유체 실험을 설정하는 방법을 제시합니다. 여러 채널을 사용하여 서로 다른 조건 또는 다른 효모 균주에서 세포를 동시에 추적할 수 있습니다. 일반적인 설정은 채널당 수백 개의 세포를 추적할 수 있으며 세포의 수명 전반에 걸쳐 고해상도 현미경 이미징을 가능하게 합니다. 우리의 방법은 또한 단일 세포의 수명, 분자 마커, 세포 형태 및 세포주기 역학에 대한 상세한 특성화를 가능하게 합니다. 또한 당사의 미세유체 장치는 다운스트림 이미지 분석으로 식별할 수 있는 상당한 양의 신선한 모세포를 포착할 수 있어 더 높은 정확도로 수명을 측정할 수 있습니다.

서론

효모 신진 것은 노화 연구에서 강력한 모델 생물이다. 그러나 효모에서 기존의 수명 분석뿐만 아니라 노동 집약적뿐만 아니라 낮은 처리량 1, 2 인 미세 절제에 의존한다. 그들은 나이 또한, 기존의 미세 절제 방식은 하나의 어머니 세포에서 다양한 세포 및 분자 기능의 상세보기를 제공하지 않습니다. 미세 유체 장치의 개발은 효모 수명을 측정 할뿐만 아니라, 마더 셀 3, 4, 5, 6, 7, 8의 수명에 걸쳐 분자 마커 및 다양한 세포 표현형을 수행하는 자동화 된 방법을 사용할 수있다. 효모 세포는 미세 유동 장치에로드 된 후, 이들은 자동 시간 바퀴를 사용하여 현미경으로 추적 될 수있다전자 영상. 프로세싱 툴을 묘화의 도움으로, 다양한 세포 및 분자 표현형은 3 추출 할 수있다 (6)하여 얻는 것이 곤란 또는 불가능 이는 많은 등 수명, 크기, 형광 리포터 세포 형태학, 세포주기 역학 포함 8 기존의 미세 절제 방법. 미세 유체 장치는 몇 년 전 3, 4, 6, 7 성공적인 개발 이후 효모 노화 연구에 명성을 얻고있다. 몇몇 그룹은 이후에 이전 디자인 (5)의 변동에 게시 한 많은 효모 연구소는 연구를 위해 마이크로 유체 장치를 채택했다.

기하 급수적 인 성장을받은 세포 배양에서 관찰에 사용할 수있는 세 어머니 세포의 수는 miniscu입니다르. 따라서, 수명 측정을위한 마이크로 유체 장치의 일반적인 디자인 원칙은 어머니 세포를 유지하고 딸 세포를 제거하는 것입니다. 하나는 이러한 디자인은 효모는 비대칭 세포 분열을 겪는다는 사실을 사용한다. 다음은 장치 의지 트랩 큰 어머니 세포의 구조와 허용 작은 딸 세포가 씻겨합니다. 이 문서에서 설명하는 미세 유체 칩은 트랩 모 세포 연질 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 패드 (매달린 수직 열) (도 1)를 사용한다. 비슷한 디자인의 장치는 이전에 3, 4, 6, 7보고되었다. 이 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 저속 촬상 실험 최적화되어 직접적인 셀 로딩 방법을 제조하는 간단한 방법을 사용한다. 미세 유동 장치의 주요 매개 변수의 하나는 트랩 모 세포에 사용되는 PDMS 패드의 폭이다. 우리의 Device는 수명 전반에 걸쳐 추적 할 수 있습니다 신선한 어머니 세포의 상당 부분을 포함하여 각 패드에서 더 어머니 세포를 유지할 수 있습니다 넓은 패드를 사용합니다. 세포는 여러 세대하거나 전체 수명에 걸쳐 관찰이 필요 대해 추적 될 필요가있을 때 수명 측정에 더하여,이 프로토콜은 단일 세포 타임 랩스 영상 실험에 유용하다.

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프로토콜

1. 실리콘 웨이퍼 금형 제작

참고 : 포토 마스크 AutoCAD 소프트웨어 설계 및 상업 회사에 의해 제조된다. 이 디자인은 다른 패턴 (세 층을 포함 보충 파일 1 ). 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 층의 높이가 각각 약 4 ㎛의 10㎛, 및 50㎛의이다. 실리콘 웨이퍼 몰드 소프트 리소그래피 9, 10을 이용하여 포토 마스크에서 만들어졌다.

  1. 10 분 수증기를 증발시켜 200 ℃에서 실리콘 웨이퍼를 구워. 스핀 코팅 네가티브 포토 레지스트 SU-8을 실리콘 웨이퍼 상.
    참고 : 스핀 코트 SU-8 3005 (30)의 첫 번째 레이어를 생성하기 위해 5,000 rpm에서, SU-8 2010 년 3,000 rpm에서 30 초는 두 번째 레이어를 생성하기 위해, 그리고 SU-8 3025 2000 rpm에서 30 초는을 생성하는 셋째 층.
  2. t 전에 코팅 된 웨이퍼를 소프트 베이크패턴 전사를 그. 정렬하고, 마스크 얼 라이너를 사용하는 "직접 접촉"모드에서 웨이퍼를 노출.
    주 : 소프트 베이크 제 층 95 ℃에서 2 분, 두 번째 층의 95 ° C에서 3 분간, 및 제 3 층, 95 ° C에서 15 분간 웨이퍼. 하여 100mJ / 제 2 층 cm, 130 mJ의 / 제 2 층 cm, 200 mJ의 / 제 3 층에 대한 cm 2의 노광량을 사용한다.
  3. 노출 후, 웨이퍼를 후 구워 SU-8 개발을 사용하여 개발한다. 는 N 총 2 하드 베이크 30 분 동안 200 ℃에서 웨이퍼를 이용하여 웨이퍼를 건조.
    주 : 실리콘 웨이퍼가 몰드 패턴면이 위로 향하게하여, 스카치 테이프를 이용하여 15cm 직경의 플라스틱 페트리 접시에 고정된다. 일반적으로, 우리는 다수의 미세 유체 칩은 동시에 제조 될 수있는 동일한 금형 여러 동일한 칩 구조물을 넣어. 각 주형은 미세 유체 칩을 제조하기 위해 여러 번 재사용 될 수있다.

2. 미세 유체칩 제조

  1. 균형에 깨끗한 무게 보트를 놓고 균형을 용기를. 체중 배에 PDMS 기반의 50g을 부어.
  2. 체중 보트 PDMS 경화제 5 g을 넣고 (w /를 PDMS 기재 1:10의 비율 w).
    주 :이 양 몰드와 15cm 직경의 배양 접시에 기초한다. 다른 크기의 페트리 접시를 사용하는 경우, 시약의 양을 조정한다.
  3. PDMS의 기재하고 일회용 피펫 경화제 교반한다. 계량 보트의 가장자리에서 시작하고 서서히 안쪽으로 이동합니다. 작은 기포가 혼합물에 걸쳐 형성 할 때까지 몇 분 동안 철저하게 저어; 철저하게 혼합 PDMS 중합 필수적이다.
  4. 천천히 페트리 접시에 붓고, 혼합물; 혼합물을 완전히 실리콘 웨이퍼 금형을 포함한다.
  5. 10 분은 PDMS 혼합물로부터 모든 공기 방울을 제거하기 위해 진공 페트리 접시를 배치했다. 기포가 혼합물의 표면에 남아 있으면, 그들을 밖으로 날려 피펫을 사용합니다.
  6. 실리콘을 품어약 2 시간 동안 75 ° C의 오븐에서 PDMS 몰드와 웨이퍼.
  7. 부드럽게 웨이퍼 금형의 구조에 손상을 피하고, 실리콘 웨이퍼 금형 오프 중합 PDMS 층을 박리. 대안 적으로, 단일 에지 산업 면도날을 사용하여, 패턴의 주위에 최소 5 mm 마진으로 실리콘 웨이퍼를 금형에서 직접 PDMS 컷; 부드럽게 웨이퍼 몰드 오프 PDMS 층을 박리.
  8. 패턴면이 위로 향하게하여 작업대에 PDMS 층을 놓는다. 조심 구조 손상을 피하기 위해 각각의 단일 칩의 에지에서 충분한 마진을 유지하는, 단일 에지 산업 면도날 개별 칩을 잘라.
  9. 위로 향하는 패턴면, 각각의 채널 측에 곧장 입구 및 출구를 통해 원형 펀치 구멍 펀치 펜 (0.75 mm ID)를 사용한다.
    참고 :이 구멍이 매체의 흐름에 대한 경로를 만듭니다. 따라서, 원을 통과하고, PDMS 층을 통해 모든 방법을 펀치 중요하다. 에 있는지 확인구멍에서 PDMS 열을 제거합니다.
  10. 구멍에 다시 펀치 펜 바늘을 삽입하여 모든 펀치 구멍을 확인하십시오. 바늘이 막힘이 없음을 나타내는 다른 측면에서 나올 수 있는지 확인합니다. 패턴 표면에 테이프를 적용 부드럽게 먼지를 청소 테이프를 벗겨. 이 단계에서 적어도 세 번 반복합니다. 살균을 유지하기 위해 PDMS에 스카치 테이프의 깨끗한 조각을 남겨주세요.
  11. PDMS의 반대편에서이 절차를 반복뿐만 아니라 테이프의 마지막 조각을 둡니다.
  12. 0.13-0.17 mm의 두께, 24 mm X 30mm의 커버 유리를 준비한다. 표면 소독, 먼지 제거하여 유리에 70 % 에탄올을 분무 건조; 또한, 멸균 된 유리를 물로 세정하고, 먼지 제거 장치에 의해 건조 될 수있다.
  13. 플라스틱 판에 커버 글라스와 PDMS로 이동. PDMS의에서 스카치 테이프를 제거하고 위를 향하도록 패턴면을 넣습니다. 전송 중에 패턴 표면과의 접촉을 피하십시오.
  14. 플라즈마 시스템의 플라스틱 판을 놓는다. PDMS의 산소 플라즈마 처리를 다음과 같은 동작 파라미터 친수성 표면 렌더링 커버 유리 적용 노광 (75 개)들; 가스 안정화, 20 CC / 분; 압력, 200; 전력, 100 W.
  15. 조심스럽게 모두 친수성 표면 (플라즈마 처리 중에 직면하는면)을 연결하는 커버 유리 위에 PDMS를 배치했다. PDMS의 커버 유리 사이에 기포가 없는지 확인합니다.
  16. 적어도 2 시간 동안 75 ° C의 오븐에서 PDMS 칩 인큐베이션.
    참고 : 불충분 한 미세 유체 실험시 현미경에 액체 누출의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 핀셋 가장자리에서 PDMS를 올려 PDMS와 커버 글라스 사이의 결합을 확인하는 것이 중요하다. 부드럽게 성공적인 결합을 나타내는 커버 유리에서 분리되지 않아야 PDMS 리프팅.

3. 실험 준비

  1. 튜브 제조.
    1. 70 % 에탄올 용액을 별도로 PDMS 칩 제조 전에 1 일 입출력 튜브 담근다.
    2. 튜브를 세척 멸균 물 5 mL를 주사기를 채우기. 주사기에 튜브를 연결하고 물에 튜브를 세척하여 각 튜브를 씻으십시오.
    3. 에탄올 잔기 청소 세정 공정을 3 회 이상 반복한다.
  2. 반드시 구조가 일관되고 그대로 만들기 위해 10X 목표와 광학 현미경으로 PDMS 채널을 검사합니다. 스카치 테이프를 사용하여 현미경 플랫폼 상에 PDMS 칩을 안정.
    참고 : 장치를 처음 만드는 특히, 백업 칩이 있다는 것을 확인하기 위해 2 단계에서 한 번에 여러 개의 칩을합니다.
  3. 멸균 물을 5 ML의 주사기를 채우십시오. 주사기 펌프와 주사기를 고정하고, 해당 입력 및 출력 튜브를 삽입한다. 약 10 분 동안 칩을 씻어 750 μL / h의 세정 속도를 설정한다. 분기 채널의 기포이 기간 중에 씻겨한다; 남아있는 거품이있는 경우, 수동으로 거품을 제거하기 위해 속도를 조정합니다.
  4. 효모 샘플 준비.
    1. 3,000 × g으로 5 분간 두 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 용액 제조 효모 샘플 (OD 600 0.6-0.8)의 양도 1 원심 분리기.
    2. 각 튜브에서 뜨는의 대부분을 제거하고 0.5 mL의 샘플을 형성하기 위해 나머지를 결합합니다.
  5. 주사기 펌프를 일시 중지하고 PDMS 칩으로부터 입력 튜브를 제거한다.
  6. 수동 각 입력 튜브 (길이 1~2 cm)의 작은 기포를 흡입하도록 주사기 펌프를 역방향. 효모 샘플에서 빨아로 이동합니다; 기포는 샘플 경계를 표시하고 그려 얼마나 많은 샘플을 나타냅니다.
    참고 : 주사기에 샘플을 흡입하지 마십시오.
  7. 다시 PDMS 칩에 입력 튜브를 삽입하고 750 μL / h의 속도로 셀로드를 다시 펌프.
  8. 10 분 동안 펌프 주사기를 남겨n 및하면 현미경으로 세포 로딩 진행을 검토; 기둥을 중지의 60 % 이상에서 성공적으로 로딩 것이다 트랩 세포.
  9. 영양 용액으로 전환 세포 배양 400 μL / h의 속도를 조절한다.
  10. 현미경 선택 관측 위치.
    주 : 수명 측정의 경우, 이미지는 40X 대물 광학 현미경에 의해 15 분마다 한번 촬영 하였다. 형광 리포터 분석을 위해, 이미지는 60X 대물 오일과 형광 현미경에 의해 15 분마다 한번 촬영 하였다.

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결과

실험 후, 균체 많은 세포와 분자 표현형의 수명은 녹화 시간 경과 화상으로부터 추출 할 수있다. 각 셀로부터 추출 될 수있는 다른 다양한 기능이 있기 때문에, 분석의 제 1 단계는, 위치 및 셀 경계 추적되고 각종 이벤트의 타이밍을 포함하는 세포 및 이벤트를 주석 등이다 신진 이벤트와 같은. 이러한 주석은 쉽게 미래에 다양한 기능을 세포의 동일한 세트로 복귀하고 분석 할 수 있도록합니다. 이러한 ImageJ에 (11) 및 연관된 플러그인으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 표현형의리스트는 셀의 기록 통계를 이용하여 이미지 데이터로부터 추출 될 수있다.

상기 미세 유체 소자로 측정 표현형의 몇몇 예이다. 효모의 수명 표현형각각의 포획 된 모세포에 의해 생성 된 싹의 수를 카운트하고 카플란 - 마이어 추정기로 추정하...

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토론

PDMS의 장치는 갓해야합니다. 그렇지 않으면, 장치에 관을 삽입함으로써 발생되는 기포를 제거하는 것이 어려울 것이다. 단계 3.4 세포를 집중하여 셀 로딩 효율을 개선하는 것이 중요하다. 실험의 처리량을 증가시키기 위해 동일한 PDMS 칩 4~6 모듈을 독립적으로 작동하는 펌프는 전형적으로 동시에 4~6 다른 실험 (상이한 균주 또는 미디어 조성물)을 수행하는 데 사용하기 위해 연결된다.

(미세 절제를 사용하여) 종래 효모 복제 성 노화 시험에 비해, 여기에서 제시된 방법은 마이크로 유체 이하 힘들고 시간 소모적이다. 또한, 상기 미세 유동 장치는 세포 크기, 세포주기 역학, 세포 형태, 다양한 분자량 마커를 포함하는 다양한 셀룰러 또는 분자 파라미터의 상세한 정량을 허용한다. 이 마이크로 유체 방법은 유지하여 고해상도 현미경으로 추적 장기 세포를 달성딸 세포로 PDMS 마이크로 패드에서 어머니 세포는 자동으로 플러시됩니다.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 NIH Grant AG043080와 중국 국립 자연 과학 재단(NSFC), No. 11434001의 지원을 받았습니다. 원고를 교정해 준 루카스 발트버거(Lucas Waldburger)에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3 ''< 111> 실리콘 웨이퍼Addison Engineering
SU-8 2000 및 3000 시리즈MicroChem
Sylgard® reg; 184 실리콘 엘라스토머 키트ellsworth2065622Sylgard ® 실리콘 엘라스토머 베이스 및 경화제
포함 페트리 접시VWR391-1502
Harris Uni-core™ 펀치 (I.D. 0.75 mm)Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® 커버 글라스Thermo Fisher Scientific102440
3M 스카치 테이프ULINES-10223
VWR® 면도날VWR55411-050
순수 에탄올, KoptecVWR64-17-5
후시-더스터&트레이드;VWR16650-027
5 mL BD 주사기 (Luer-Lock™ 팁)Becton, Dickinson and Company309646
PTFE 표준 벽 튜빙 (100 ft, AWG 크기: 22, 공칭 ID: 0.028)Component Supply CompanySWTT-22
바늘 구색Component Supply CompanyNEKIT-1
DesiccatorHACH2238300
Lab OvenFisher Scientific13246516GAQ
40X 및 60X 대물렌즈가 있는 Nikon TE2000 현미경 40XNikon
Zeiss Axio Observer Z1Zeiss
주사기 펌프LongerpumpTS-1B
29002513 및 60X 대물렌즈가 있는

참고문헌

  1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
  3. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
  4. Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
  5. Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  7. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143(2013).
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  10. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  12. Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
  13. Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
  14. Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).

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