Summary
هنا، نحن تصف الإعداد والملاحة البرمجيات، وتحليل البيانات لطريقة مكانيا وزمانيا دقيقة لقياس منشط وطوري التغييرات الغلوتامات خارج الخلية في الجسم الحي باستخدام صفائف مسرى مكروي انزيم مرتبط (MEA).
Abstract
اضطراب النواقل العصبية وغالبا ما يكون عنصرا أساسيا في أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ولعب دورا في علم الأمراض الكامنة وراء مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والاكتئاب، والقلق. تقليديا، كانت microdialysis الأكثر شيوعا (أشاد) تقنية لدراسة التغيرات العصبي التي تحدث في هذه الاضطرابات. ولكن بسبب microdialysis لديه القدرة على قياس التغيرات بطيئة 1-20 دقيقة عبر مناطق واسعة من الأنسجة، فمن لديه عيب الغازية، يحتمل تدمير اتصالات الجوهرية في الدماغ وقدرة أخذ العينات بطيئة. وهناك تقنية جديدة نسبيا، ومجموعة مسرى مكروي (MEA)، له مزايا عديدة لقياس التغيرات العصبي محددة في مناطق الدماغ منفصلة وقوعها، مما يجعل لنهج دقيق مكانيا وزمانيا. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هو الغازية الحد الأدنى، مما يسمح لقياس التغيرات العصبي في الجسم الحي. في المختبر لدينا، ونحن هالقد كان مهتما على وجه التحديد في التغيرات في الناقل العصبي، الغلوتامات، المتعلقة علم الأمراض مرض الزهايمر. على هذا النحو، وقد استخدم الطريقة الموصوفة هنا لتقييم اضطرابات الحصين المحتملة في الغلوتامات في نموذج الفأر وراثيا لمرض الزهايمر. لفترة وجيزة، استخدام أسلوب ينطوي على طلاء ومسرى مكروي مواقع متعددة مع انزيم انتقائية للغاية بالنسبة للناقل عصبي من الاهتمام وباستخدام مواقع المرجعية الذاتية لطرح الضوضاء الخلفية وinterferents. بعد الطلاء والمعايرة، وMEA يمكن بناؤها مع micropipette وإنزالها في منطقة الدماغ ذات الاهتمام باستخدام جهاز التجسيمي. هنا، وصف الطريقة تنطوي التخدير RTG (TauP301L) 4510 الفئران وباستخدام جهاز التجسيمي لاستهداف بدقة المناطق الفرعية (DG، CA1، وCA3) من الحصين.
Introduction
قياس التغيرات العصبي في الدماغ هو أداة أساسية لعلماء الأعصاب دراسة أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) التي غالبا ما تتميز التقلبات العصبي. على الرغم من microdialysis في تركيبة مع ارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC / EC) كانت الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس التغيرات في مستويات النواقل العصبية خارج الخلية 1، 2، 3، 4، القرار المكاني والزماني للتحقيقات microdialysis قد لا تكون مثالية لالناقلات العصبية مثل الجلوتامات، التي تنظم بإحكام في الفضاء خارج الخلية 5 و 6. بسبب التطورات الحديثة في مجال علم الوراثة والتصوير، وهناك طرق إضافية التي يمكن استخدامها لرسم خريطة الغلوتامات في الجسم الحي. باستخدام المشفرة وراثيا للصحفيين الغلوتامات الفلورسنت (iGluSnFR) لد ثنائي الفوتون التصوير والباحثين قادرين على تصور الافراج عن الغلوتامات من الخلايا العصبية والخلايا النجمية على حد سواء في المختبر والمجراة 7 و 8 و 9. والجدير بالذكر أن هذا يسمح لتسجيل من أكبر مجال الرؤية ولا يعطل الاتصالات الجوهرية من الدماغ. في حين أن هذه التقنيات البصرية الجديدة تسمح لرؤية حركية الغلوتامات وقياس ردود أثار الحسية ونشاط الخلايا العصبية، فإنها تفتقر إلى القدرة على تحديد كمية الصوديوم في الفضاء خارج الخلية في مناطق الدماغ منفصلة.
طريقة بديلة هو انزيم مرتبط مسرى مكروي مجموعة (MEA) التي يمكن قياس مستويات الناقل العصبي بشكل انتقائي خارج الخلية، مثل الجلوتامات، من خلال استخدام نظام تسجيل المرجعية الذاتية. وقد استخدمت هذه التقنية MEA لدراسة التعديلات في الغلوتامات خارج الخلية التالية الدماغ الصدمةإصابة 10، 11، 12، الشيخوخة 13 و 14، والإجهاد 15 و 16 و الصرع 17 و 18 و مرض الزهايمر 19 و 20، وحقن تقليد 21 الفيروسي ويمثل تحسنا عن القيود المكانية والزمانية الكامنة في microdialysis. في حين microdialysis يحد من القدرة على قياس قرب المشبك 22 و 23 و الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لديها القرار المكانية العالية التي تسمح للتدابير انتقائية من امتداد الغلوتامات خارج الخلية نقاط الاشتباك العصبي قرب 24 و 25. ثانيا، القرار الزماني انخفاض microdialysis (1-20 دقيقة) يحد من القدرة على التحقيق فيديناميكية سريعة للإفراج الغلوتامات والتخليص التي تحدث في ميلي ثانية واحدة إلى مجموعة الثانية 26. بسبب الاختلافات في الإفراج عنهم أو إزالة الغلوتامات قد لا يكون واضحا في تدابير منشط، ويستريح مستويات الغلوتامات، قد يكون من الضروري أن الإفراج عن الغلوتامات وإزالة قياسها مباشرة. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسمح لمثل هذه التدابير بسبب قرارهم عالية الزماني (2 هرتز) وحدود منخفضة من كشف (<1 ميكرومتر). ثالثا، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسمح للفحص من الاختلافات دون الإقليمية في الناقلات العصبية في منطقة الدماغ معينة، مثل الفئران أو الماوس الحصين. على سبيل المثال، وذلك باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكننا استهداف حدة التلفيف المسنن (DG)، قرن آمون 3 (CA3) وقرن آمون 1 (CA1) من الحصين، والتي ترتبط عبر دائرة trisynaptic 27، لدراسة الاختلافات دون الإقليمية في الغلوتامات خارج الخلية. ونظرا لحجم تحقيقات microdialysis (1 - طول 4 ملم) والأضرار الناجمة عن زرع 28 </ سوب>، 29، والاختلافات دون الإقليمية يصعب معالجتها. وعلاوة على ذلك، فإن النظم البصرية تسمح فقط التحفيز من خلال مؤثرات الخارجية، مثل التحفيز الطولي أو وميض ضوء، والتي لا تسمح التحفيز دون 7. هناك فائدة النهائي من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف على أساليب أخرى هي القدرة على دراسة هذه المناطق الفرعية في الجسم الحي دون تعطيل صلاتهم خارجي والجوهرية.
هنا، نحن تصف كيف يمكن لنظام التسجيل (على سبيل المثال، FAST16mkIII) بالاشتراك مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، ويتألف من مسرى مكروي متعددة المواقع القائمة على السيراميك، ويمكن أن تكون مغلفة بشكل مختلف على مواقع تسجيل للسماح للتدخل وكلاء ليتم الكشف عن وإزالتها من إشارة تحليلها. كما تبين لنا هذه المصفوفات يمكن استخدامها للدراسات القائم على أمبيرية في الجسم الحي تنظيم الغلوتامات داخل DG، CA3، والمناطق الفرعية CA1 الحصين للتخدير RTG (TauP301L) 4510 الفئران، وهي تستخدم عادة منموذج [أوس] من مرض الزهايمر. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم تأكيدا على حساسية نظام MEA لديناميات بسرعة الإفراج الغلوتامات وإزالتها عن طريق التعامل مع الفئران مع ريلوزول، وهو دواء هو مبين في المختبر لتقليل إطلاق الغلوتامات وزيادة الغلوتامات امتصاص 30، 31، 32، 33، ومما يدل على هذه التغييرات منها في الجسم الحي في نموذج الفأر TauP301L.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. طلاء صفيف مسرى مكروي مع إنزيمات أو طبقة مصفوفة
- إعداد الحل البروتين مصفوفة
- تزن من 10 ملغ من ألبومين المصل البقري (BSA) ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- إضافة 985 ميليلتر من الماء DI إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي BSA. مزيج الحل بواسطة دليل التحريض (إعادة pipetting لباستخدام 1000 ميكرولتر ماصة ~ 3 مرات، حتى يذوب BSA).
ملاحظة: لا تستخدم دوامة خلط الحل لأن ذلك قد يعرض الهواء إلى الحل. أيضا، تعيين ماصة لحجم <1000 ميكرولتر (على سبيل المثال 700 ميكرولتر) لتجنب إدخال فقاعات الهواء. ويمكن وضع الحل في microcentrifuge إذا لزم الأمر. - حالما يتم حل الحل BSA، إضافة 5 ميكرولتر من 25٪ محلول غلوتارالدهيد. مزيج الحل عن طريق أنبوب للقلب مغلق 3-5 مرات. الحل الناتج هو 1٪ BSA مع 0.125٪ غلوتارالدهيد.
- نقض المحاليل البروتين مصفوفةنشوئها لمدة 5 دقائق. ستظهر الحل أصفر فاتح اللون.
- تستعد الحل انزيم المطلوبة (على سبيل المثال، الغلوتامات أوكسيديز)
- ، انزيم النقي (على سبيل المثال، بإضافة 50 ميكرولتر DI المياه إلى 25 وحدة من أوكسيديز الغلوتامات لانتاج 0.5 U / ميكرولتر) إعداد الحل الغلوتامات أوكسيديز وذلك بإضافة الماء DI تصفيتها إلى مجفف بالتجميد.
ملاحظة: قسامة حل سهم (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر) وتخزين أجزاء مأخوذة في حاويات بحجم مناسب (على سبيل المثال، 500 أنابيب ميكرولتر microcentrifuge ل) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. قد يتم تخزين أجزاء مأخوذة لمدة تصل إلى 6 أشهر في ظل هذه الظروف. - إضافة 4 ميكرولتر من الحل BSA / غلوتارالدهيد إلى أنبوب aliquoted microcentrifuge تحتوي الغلوتامات أوكسيديز. مزيج الحل بواسطة دليل التحريض (إعادة pipetting لمع ماصة 10 ميكرولتر. يجب تعيين ماصة لحجم <5 ميكرولتر). الحل الناتج هو 1٪ BSA، 0.125٪ غلوتارالدهيد و 0.1 U / ميكرولتر الغلوتامات أوكسيديز.استخدام الحل لطلاء على الفور.
ملاحظة: الغلوتامات حل أوكسيديز طلاء يمكن أن تستخدم فقط في 15 دقيقة. على الرغم من أن العديد من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف قد تكون مغلفة مع حل استعداد واحد، فمن المستحسن أن لا تتجاوز نافذة الوقت صالحة للاستعمال لأوكسيديز الغلوتامات. عدد من الأقطاب الكهربائية التي يمكن أن تكون مغلفة ضمن 15 دقيقة تختلف. عموما، 4-6 أقطاب يمكن أن تطلى في وقت واحد.
- ، انزيم النقي (على سبيل المثال، بإضافة 50 ميكرولتر DI المياه إلى 25 وحدة من أوكسيديز الغلوتامات لانتاج 0.5 U / ميكرولتر) إعداد الحل الغلوتامات أوكسيديز وذلك بإضافة الماء DI تصفيتها إلى مجفف بالتجميد.
- طلاء MEA
- عادة، ومعطف وهي مغلفة زوج من موقع التسجيل (ق) على MEA مع انزيم المطلوبة (الغلوتامات أوكسيديز) وزوج مختلف من موقع التسجيل (ق) (موقع 'الحارس' (ق)) مع الخاملة البروتين مصفوفة.
- استخدام حادة طرف هاميلتون microsyringes (على سبيل المثال 10 ميكرولتر) إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف معطف مع أوكسيديز L-الغلوتامات أو حل مصفوفة البروتين غير نشط (BSA + غلوتارالدهيد). الإجراءات المستخدمة لطلاء البروتين مصفوفة انزيم أو الخاملة هي نفسها.
- تنظيف الحقن قبل وبعد الاستعمال (3 يشطف معDI المياه، 3 يشطف مع الميثانول، 5 يشطف بالماء DI).
وتستخدم مخصصة الحقن لتطبيق المعاطف انزيم (الغلوتامات أوكسيديز) أو البروتين مصفوفة: ملاحظة. لا تستخدم نفس السرنجة عن حل آخر. فمن المستحسن لأداء الطلاء البروتين مصفوفة قبل الطلاء الانزيم. - وضع أوكسيديز الغلوتامات أو مصفوفة البروتين باستخدام حقنة 10 ميكرولتر هاميلتون. اضغط بلطف على المكبس إلى الاستغناء عن حبة صغيرة من حل على طرف الحقنة (تصور باستخدام مجهر تشريح).
- باستخدام المجهر تشريح لاستهداف مواقع تسجيل MEA، وتطبيق حل للمواقع تسجيل المناسبة عن طريق الاتصال لفترة وجيزة المواقع تسجيل مع الحل قطرة / حبة، وهو ما يمثل طبقة واحدة. ثلاث طبقات كافية لكل من البروتين مصفوفة ومعطف الانزيم. يمكن طبقات سميكة تقلل من حساسية من الشرق الأوسط وأفريقيا.
- رفع الحبرية حل على التوالي وخارج مواقع التسجيلات (أي syrinيجب جنرال الكتريك طرف لا كشط عبر السطح MEA).
- تعيين مؤقت لمدة 1 دقيقة. هذا هو الحد الأدنى لمتطلبات الوقت بين التطبيقات طلاء إلى الموقع تسجيل (ق). تسمح الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المغلفة الإنزيم لعلاج عند 4 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام.
- تسجيل عدد من المعاطف تطبيقها، كم من الوقت استغرق لتطبيق الطلاء، وعدد الكهربائي، واسم وتاريخ في دفتر المختبر.
2. الكهربائي مع م-Phenylenediamine عن الانتقائية تحسين
- إعداد م-Phenylenediamine هيدروكلوريد (إم بي دي) الحل
ملاحظة: لوحة لطبقة الإقصاء، MPD، لمنع الأكسدة الدوبامين وغيرها من كبيرة، جزيئات interferent (على سبيل المثال، حمض الاسكوربيك)، وبالتالي تحسين الانتقائية للاستشعار عن الغلوتامات / H 2 O 2 عبر جزيئات يحتمل أن interferent أخرى.- قياس 50 مل من 0.05 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في قارورة حجمية ونقل 50 مل من 0.05M PBS إلى أكبر (150 مل) دورق مخروطي.
- عن طريق أنابيب متصلة خزان النتروجين (على سبيل المثال، وذلك باستخدام أنابيب توصيل القاذف الضغط)، ونعلق طرف ماصة (على سبيل المثال P200 طرف) إلى نهاية مفتوحة للأنابيب. وضع أنابيب مع طرف ماصة تعلق في حل PBS وتغطية الحل فضفاضة مع بارافيلم. بدوره على النيتروجين وبلطف حل فقاعة لمدة 20 دقيقة.
- تزن 0.045 غرام من MPD.
تحذير: MPD هو عبارة عن مادة مسرطنة. وزنها من MPD يجب أن يتم تنفيذ ذلك باستخدام مقياس الواردة في غطاء الدخان. ارتداء قفازات وقناع عند استخدام شرطة مانيلا. ضمان غطاء محرك السيارة وظيفية وأن وشاح يتم سحبها إلى مستوى العمل المناسب. الأسطح نظيفة على الفور التي قد تكون ملوثة MPD لتجنب تلطيخ دائم. - بعد محتدما، ونقل كل من MPD إلى PBS حل بالغاز دي. تغطية افتتاح قارورة مع بارافيلم وبلطف حل دوامة حل MPD في الحل. تجنب عدوانيهالبريد خلط أو استخدام دوامة لأن ذلك قد يعرض الغازات إلى الحل.
- نقل الحل إلى دورق 50 مل. شريط ضجة ليست ضرورية.
- القطب الكهربائي
- الحصول على القطب المرجع. استخدام أقطاب المرجعية مخصصة لMPD الطلاء فقط. استخدام القطب إشارة مختلفة عن إجراءات المعايرة.
- وضع الذراع البلاستيك صاحب المرجعية القطب على الكأس. التحقق من وجود فقاعات الهواء في القطب إشارة الزجاج (قد لا تكون قادرا على رؤية). نفض الغبار بلطف النهاية البعيدة من القطب إشارة إلى إزالة أي فقاعات الهواء على الحافة.
- وضع القطب المرجعية من خلال فتحة في الذراع البلاستيك وانخفاض في دورق يحتوي على برنامج تلفزيوني. تأكد من أن القطب إشارة لا اتصال الجزء السفلي من الكأس.
- ربط الكهربائي إشارة إلى headstage (على سبيل المثال 2 PA / بالسيارات) والاتصال (على سبيل المثال موصل DIP) شركة طيران الشرق الأوسط لتكون لوحة MPDد إلى headstage.
- خفض MEA في حل الكأس بحيث سوى غيض الشرق الأوسط وأفريقيا غارقة في الحل. لا تغمره النصائح MEA في السائل خارج "فقاعة" السوداء (العزل الأسود تقع فوق قمة MEA). القيام بذلك قد يؤدي إلى تلف MEA.
- تشغيل 'اختبار' معايرة للتحقق من وظائف قنوات القطب واتصال headstage.
ملاحظة: على الرغم من أن تعكس إعدادات الأجهزة والمعدات المستخدمة، تفاصيل تتعلق تحليلها نوع / interferent وتركيز لا يجب أن تكون دخلت لمعايرة 'اختبار'. يجب أن يكون وضع إعادة ترميز "أمبيرية" و "تطبيق V 'يجب أن يكون -0.7 V. تحقق تسجيل نموذجية لجميع القنوات. - إلغاء عن طريق اختيار "إلغاء" عندما يتم التحقق التواصل بين جميع المواقع تسجيل. وليس من الضروري لحفظ البيانات المعايرة.
- حدد رمز "الطلي" على سطح المكتب. والطلي لستظهر القائمة رأ. تحقق من إدخال الإعدادات الصحيحة:
PP السعة: 0.25
الأوفست: -0.5
تردد: 0.05
مدة (دقيقة): 20 - حدد زر "وقفة" لبدء الطلاء. وينبغي أن يبدأ حقل الوقت المنقضي في العد التنازلي.
- عند الانتهاء (كل الوقت المنقضي)، حدد "MEA آخر 'في القائمة برزت لبدء MPD الطلاء على MEA إضافية. استبدال MEA مطلي مع MEA أن MPD مطلي وكرر الإجراء الكهربائي باستخدام أداة الكهربائي.
ملاحظة: من المستحسن استخدام الحل MPD استعداد لا يزيد عن 2 مرات أو خلال فترة زمنية 1 ساعة. يعد حل جديد لإعداد أكثر من 2 الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. - اختر "البرامج الخروج" لإنهاء الكهربائي. شطف نصائح القطب MPD مطلي بماء DI (لتجنب بقايا الملح) ومتجر (24 ساعة) قبل معايرة.
- إزالة القطب إشارة من الحل وشطف مع الماء DI قبل وضع في الصورة المناسبةtorage حل (على سبيل المثال 3 M كلوريد الصوديوم). ضمان غمرت الطرف إشارة الكهربائي في المحلول. انخفاض ببطء الزجاج الكهربائي إشارة إلى الحل لتجنب إتلاف الزجاج.
- التخلص من الحل MPD في حاوية النفايات الخطرة وصفت بشكل مناسب.
3. معايرة MEA لكشف الغلوتامات والانتقائية (الشكل 1) 21
- إعداد الحلول اللازمة للمعايرة.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1. - أداء المعايرة تحت التحريك المستمر (بطارية المغناطيسية تعمل النمام) عند 37 درجة مئوية. بدوره على وسادة التدفئة أو حمام مائي تعميم والحصول على بقضيب صغير. يحرك ببطء ولكن بسرعة كافية أنه عندما يتم إضافة (أدناه)، يتم الوصول إلى مستوى جديد بسرعة.
- ربط headstage (2 PA / بالسيارات) إلى نظام التحكم تسجيل وإدراج غيض MEA إلى 40 مل من أثار 0.05 M PBS (استخدم دورق 50 مل).
- ربط صالقطب eference. نفض الغبار نهاية لضمان عدم وجود فقاعات الهواء.
- فتح برنامج تسجيل وانقر على "معايرة". تأكد من أن الإعدادات صحيحة (الاختيار يتم اختيار أن مواقع الرصد لأن هذا قد يتغير مع أقطاب مختلفة)، واختيار عدد MEA، ثم اضغط على "ابدأ".
- اسمحوا 5-10 دقيقة للموازنة. تبدأ بمجرد أن الأساس قد استقر (<0.004 غ / تغيير دقيقة).
- حدد "الأساس" وإضافة 500 ميكرولتر من 20 ملي حمض الاسكوربيك (interferent، نهائي [250 ميكرومتر]) وحدد "Interferent" (ويعتقد AA من حيث interferent على نطاق الدماغ) مرة واحدة وصلت الحالية لذلك، هضبة ثابتة جديدة، إذا أي. السماح 0،5-1 دقيقة بين الإضافات. إذا تم مطلي الشرق الأوسط وأفريقيا بشكل صحيح، تقريبا أي تغيير ينبغي مراعاتها.
- إضافة 40 ميكرولتر من 20 ملي L-الغلوتامات (النهائي [20 ميكرومتر]) ومرة واحدة الحالية قد وصلت إلى الجديدة، هضبة ثابتة، علامة 1 الحادي إضافة "تحليلها". كرر ثلاث مرات ليصبح المجموع 3 glutamatالإضافات ه.
- إضافة 40 ميكرولتر DA. لم تقم بتحديد "تحليلها". حدد "اختبار العقاقير" - DA قد يكون مجرد interferent في المناطق التي تحتوي على DA.
- إضافة 40 ميكرولتر بيروكسيد. لم تقم بتحديد "تحليلها". حدد "اختبار المواد".
- انقر على زر "توقف" بمجرد الانتهاء من المعايرة.
- لتحديد وظائف MEA، انقر فوق علامة التبويب حساب وتسجيل المعلمات التالية في دفتر المختبر.
- لتصميم MEA (3000 ميكرون 2) المستخدمة في هذه المعايرة، واستخدام MEA مع منحدر من ≥ 0.004 غ / ميكرومتر لكن المنحدرات السفلى يمكن استخدامها لبعض التجارب. إذا كان هناك أقل من الفرق 10٪ في منحدر بين انزيم المغلفة وغير المغلفة المواقع، ثم استخدام هذه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف من أجل إطلاق أثار فقط أو نظيفة / تجاهل MEA.
- استخدام الحد من الكشف (اللد) ≤ 1.5 ميكرومتر. إذا كانت اللد أكبر من 1.5 ميكرومتر، ثم استخدام هذه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لاطلاق سراحهم أثاره وامتصاص فقط. لا تستخدم هذه الأقطاب لتسجيل مستويات منشط.
- استخدام الانتقائية لتحليلها المطلوب (أي الغلوتامات) على interferent من> 20 وحدات التعسفي. إذا الانتقائية هي أقل من 20، ثم نظيفة / تجاهل MEA.
- استخدام الخطي (R 2) من منحنى معايرة ≥ 0.90. إذا الخطي أقل من 0.90، ثم نظيفة أو تجاهل MEA.
- حفظ الملف مع # من الشرق الأوسط وأفريقيا، والتاريخ، والأحرف الأولى من الشخص معايرة.
4. تجميع Micropipette
ملاحظة: بال micropipettes (الزجاج الشعرية) ينبغي أن يكون لها طرف مع القطر الداخلي من 10-15 ميكرون.
- وضع micropipette مركزيا بين جميع المواقع تسجيل أربعة البلاتين وجبل 50-100 ميكرون فوق MEA باستخدام الشمع لزجة والصلصال.
- لتحميل micropipette، استخدم حقنة 1 مل مليئة الغلوتامات أو حل بوكل، 0.22 ميكرومتر محقنة معقمة filteص، و97 مم لونغ، 28 عيار ماصة حشو، إعادة تعبئة micropipette. وهذا هو، أدخل الإبرة في الجزء العلوي من micropipette وملء في الجزء السفلي من micropipette (النهاية نحو MEA)، والتأكد من عدم وجود فقاعات.
- إرفاق micropipette لنظام إخراج الضغط في 2-20 رطل لمدة 1 ثانية.
5. لوحة لمصغرة المرجعي الكهربائي لفي فيفو استخدام
- إعداد الحل الطلاء (50 غرام كلوريد الصوديوم / 90 مل 1 M حمض الهيدروكلوريك في حمام 100 مل دورق (طلي)) وقطع القطب حمام (~ 10 سم طول من البلاتين (حزب العمال) سلك (~ 0.02 "القطر)).
- قطع 10-15 سم قطعة طويلة من تفلون المغلفة سلك الفضة (0.008 "العارية) واستخدام شفرة حلاقة لكشط ~ 1 سم من طلاء تفلون من كل طرف من نهاية سلك الفضة.
- جندى دبوس من الذهب في نهاية واحدة ووضع نهاية واحدة من الأسلاك الفضة تتعرض في حمام الطلاء.
- باستخدام محول DC (تستخدم سوى محول DC جود مخرجات ~ 9 - 15 VDC كحد أقصى)،المشبك "حمراء" (+) سلك إلى سلك استعداد الفضة (القطب المرجعية) على الجانب الذهب دبوس. المشبك "الأسود" (-) سلك لحزب العمال حمام الكاثود.
- سد العجز في محول DC. ابحث عن عملية الطلاء الصحيحة - يجب أن تظهر فقاعات في القطب حمام. القطب المرجع يتحول الفضة / اللون الرمادي.
تنبيه: لا تستخدم الخيوط [أسود (-) مقابل الأحمر (+)] - طلاء حمام ستدمر اذا حدث هذا وسوف تحتاج إلى أن تكون الحل الطلاء الطازجة. وهناك حل سيئة تتحول أصفر اللون: لا تستخدم!
ملاحظة: رد فعل الطلاء يأخذ 2-5 دقيقة عموما: حج 0 + الكلور - → أجكل + ه - - اختبار القطب المرجعية.
- تعيين المتعدد إلى 100 - إعداد بالسيارات DC 200.
- ضع المؤشر (أي، القطب اختبارها سابقا المعروف أن العمل) القطب المرجع في 3 M كلوريد الصوديوم واختبار ضد القطب إشارة مطلية حديثا.
ملاحظة: إذا كان لناجي الإلكترود المرجعي الجديد، نقع عليه في 3 M كلوريد الصوديوم قبل الاستعمال (12 ساعة مستحسن). - وضع "حمراء" (+) الرصاص على دبوس من الذهب من القطب إشارة لفحصها. وضع "الأسود" (-) الرصاص على القطب القياسي. مجموعة قراءات مقبول هو ± 10 فولت. 0 بالسيارات مثالية عبر أقطاب المرجعية 2.
جراحة 6. الحيوان العامة للMEA تسجيلات
- استعدادا لعملية جراحية
- وضع معدات لجراحة في مطهر في الليلة السابقة.
- إزالة الأدوات من مطهر ويشطف جيدا ووضع الأدوات على وسادة عملية جراحية معقمة. الحصول على وسادة التدفئة.
- معايرة قطبين وإرفاق micropipette كما هو موضح في الإجراءات 3 و 4.
- جعل القطب إشارة كما هو موضح في القسم 5.
- جعل 200 الغلوتامات ميكرومتر و 70 ملي بوكل. الرجوع إلى الجدول رقم 1.
- الحصول على الحيوانات وتسجيل وزنه على أوراق الجراحة.
- إعداد التخدير وتشغيل لوحة التدفئة.
- إجراء عمليات جراحية MEA
- باستخدام الأيزوفلورين (تدفق 4٪ في الأكسجين)، تخدير الحيوان في غرفة الاستقراء حتى معدل التنفس قد انخفض بشكل ملحوظ والحيوان لا يستجيب إلى أخمص القدمين أو قرصة الذيل. معدل التنفس قياسي ودرجة حرارة الجسم كل 15 دقيقة.
- وضع الحيوان في جهاز التجسيمي باستخدام قضبان الأذن لتحقيق الاستقرار في الرأس. تأكد من أن الحيوان هو آمن ولا يتحرك الرأس. انخفاض تدفق الأيزوفلورين إلى 1،5-3٪ في الأكسجين. تأكد من أن لوحة التدفئة بشكل سليم تحت الحيوان وتعيين إلى 37 درجة مئوية لتوفير الحرارة تكميلية. قد يؤدي عدم توفير الحرارة تكميلية يؤدي إلى انخفاض حرارة الجسم عميق والوفاة المبكرة للحيوان.
- تطبيق مرهم العين باستخدام قضيب من القطن المعقم وسجل معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم. باستخدام الانتهازي بطارية تعمل بالطاقة، حلاقة الجزء العلوي من الرأس. استخدام مقص جراحي صغيرة لإزالة الفراء قرب الأذنين.
- في هذه المرحلة، وضعت على قفازات جراحية معقمة. تطبيق اليود ثم الكحول (ثلاث مرات) على فروة الرأس.
- باستخدام مشرط، وجعل شق مباشرة أسفل منتصف فروة الرأس ونشر الجلد باستخدام المشابك الثور الكلب. خذ نصيحة القطن المعقم لامتصاص أي دم. استخدام بيروكسيد الهيدروجين لتسهيل ظهور bregma وامدا.
- تأكد من أن الرأس بشكل سليم عن طريق قياس D / V والإحداثيات M / L من bregma وامدا. يجب أن يكون تنسيق التغييرات الصفر إذا كان الرأس على متن طائرة مسطحة. ضبط الرأس والأذن القضبان عند الضرورة لضمان وجود منبسط.
- البحث bregma، والصفر الإحداثيات. باستخدام الإحداثيات المطلوبة، والانتقال إلى اليسار واليمين، وجعل علامة باستخدام علامة دائمة. باستخدام cauterizer / علامة، وجعل ساحة كبيرة حول علامة مع مساحة كافية للوصول إلىالمنطقة المطلوب.
- باستخدام أداة دوارة العقيمة، وحفر حول علامة مربع. امتصاص أي الدم باستخدام قضيب من القطن المعقم. تماما تطهير قبل قمة الحفر إلى كل استخدام.
- إرفاق MEA إلى headstage والردم ماصة مع الحل المنشود الأول. تأكد من ترك فجوة في ماصة دون حل بحيث يمكن فحص الحل طرده. إرفاق أنابيب إلى micropipette الزجاج.
- تشغيل خزان النتروجين وقاذف ضغط (رطل = 5، الوقت = 0.6 ق). اختبار (اضغط الزر الأحمر اليدوي) لضمان ماصة لم يتم انسداد قبل بداية.
- معايرة micropipette. تبدأ في 0 على الشبيكة ووضع قطعة من الشريط الأزرق على headstage للإشارة إلى نقطة البداية. بدوره على القارئ الرقمي وإعادة تعيينها إلى الصفر. اذهب الى الأسفل 1 ملم (DV)، وحساب عدد من القراد انتقلت الحل على الشبيكة. يجب أن 10 القراد يساوي 1 مم (1 مم = 250 NL)، حتى 1 القراد = 25 NL.
- وضع القطب الإشارة فيموقع بعيد من MEA مثل أنه لا يزال على اتصال مع السائل في الدماغ لاستكمال الدائرة.
- البحث bregma مع MEA المرفقة والصفر القارئ الرقمي. نقل MEA إلى الإحداثيات المطلوبة. انخفاض ببطء MEA حتى يلمس طرف الدماغ. صفر DV تنسيق وخفض ببطء الشرق الأوسط وأفريقيا في الدماغ.
- على تسجيل البرنامج، انقر فوق القطب معايرة المطلوب ومن ثم انقر فوق "تنفيذ تجربة". سيقوم النظام ثم بدء تسجيل مستويات منشط لتحليلها من الفائدة بينما هو تخدير الحيوان.
- التكبير لمحور من شأنها أن تساعد في مراقبة خط الأساس والسماح القطب إلى خط الأساس ل20 - 45 دقيقة.
- بعد خط الأساس مستقرة، تعيين قاذف ضغط على 0.6 الصورة و5 رطل واضغط على الزر الأحمر على القاذف الضغط لإخراج. تسجل الوقت والضغط وكذلك حجم / القراد انتقلت على ورقة حقن (الشكل 2). جعل أي ملاحظات والتي هي ضرورية (أي،قمم أكبر، والآثار التخفيف، ماصة انسداد، صاخبة الأساسية / س النطاق).
- لحقن الغلوتامات، الانتظار 3-5 دقائق بين الحقن. لبوكل حقن الانتظار 1-2 دقائق بين الحقن. حقن باستخدام نفس الضغط والوقت على الأقل 3 مرات. تغيير الوقت وتكرار. ليس محاولة لتغيير الضغط إلا إذا تم انسداد micropipette.
- إذا كان انسداد micropipette، وزيادة ضغط يصل إلى 30 رطل.
- سجل من مناطق الدماغ المطلوب، وتكرار على كلا الجانبين من المخ باستخدام حلول مختلفة. تسجيل الأساس في كل منطقة جديدة لمدة 20 دقيقة.
- خذ MEA مع micropipette المرفقة، يشطف بالماء DI ونقع في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها حتى يزول كل الدم.
- الموت ببطء الحيوان وحفظ المخ في أنبوب المسمى مسبقا وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية أو الاحتفاظ جانب واحد لتثبيت. إلى الموت ببطء الحيوان، وجرعة زائدة مع isoflurane (استنشاق). أداء قطع الرأس باستخدام مقص جراحي وتشريح خارج المناطق المرغوبة.
7. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تنظيف المغلفة بعد استخدام
- هل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ليست نظيفة إذا غير المستخدمة. إذا كان هناك الوبر أو الغبار على سطح ونظيفة مع الميثانول واسمحوا الجافة لمدة 24 ساعة قبل الطلاء.
- بدوره على حمام ماء (80 ° C) ونقع غيض من الشرق الأوسط وأفريقيا لمدة 30 دقيقة. مسح بعناية غيض من القطب مع القطن يميل قضيب لإزالة أي حطام قد تركت على طرف القطب. لا تحصل السوداء "جزء العزل" في الشرق الأوسط وأفريقيا الرطب.
- باستخدام ثلاثة sonicators مختلفة، نقع غيض من الشرق الأوسط وأفريقيا في (1) Citrisolv، المذيبات والمقاصة التجارية وكيل (2) الآيزوبروبيل، و (3) الماء DI لمدة 5 دقائق. مسح بعناية غيض من القطب مع القطن يميل قضيب لإزالة أي حطام قد تركت على طرف القطب.
- دراسة نصائح تشريح تحت المجهر للتأكد من إزالة طبقات بنجاح.
8. تحليل
- لتحليل البيانات،أولا تصدير التجربة المطلوبة عن طريق النقر المزدوج التجربة النهائية واختيار "تصدير البيانات" من القائمة المنسدلة ملف.
- حفظ هذه البيانات إلى الموقع الملف المطلوب وفتح برنامج التحليل. انقر على "فتح" في برنامج تحليل واختيار الملف المحفوظ مؤخرا.
- منح برنامج لحظات قليلة لتحميل الملف ثم تحقق التجربة تحت علامة التبويب علامات الحدث. تحت الإخراج، حدد المربعات للمعلمات المرجوة. على سبيل المثال، خط الأساس، السعة، منطقة الذروة (منطقة تحت المنحنى)، T الارتفاع، وT 80.
- انقر فوق تحديث ومن ثم تحليل لتصدير البيانات إلى جدول بيانات (وهذا قد يستغرق بضع دقائق). سيقدم البرنامج موجه لحفظ الملف إلى الموقع المطلوب. بمجرد حفظ الملف يمكن تحريرها في جدول بيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في حين هذه التكنولوجيا يمكن استخدامها لقياس التغيرات في glutamatergic يشير في العديد من أنواع النماذج الحيوانية، مثل الإصابات الدماغ، والشيخوخة، والإجهاد، والصرع، وهنا علينا أن نظهر كيف أن التكنولوجيا MEA يمكن استخدامها لدراسة التعديلات glutamatergic في نموذج الفأر وراثيا من tauopathy البشري 19 و 20. وRTG (TauP301L) 4510 الماوس يعبر عن طفرة P301L في تاو المرتبطة الخرف الجبهي الصدغي والشلل الرعاش مرتبطة الكروموسوم 17، ويستخدم عادة لدراسة علم الأمراض تاو المرتبطة بمرض الزهايمر، tauopathies الاعصاب والخرف الجبهي الصدغي. علينا أن نبرهن أيضا أن glutamatergic إشارات يمكن تعديلها عن طريق التدخل الدوائي. كنا نعامل والفئران TauP301L مع ريلوزول، وهو دواء المعدلة للمرض وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لمرض التصلب الجانبي الضموري (ALS) أن ينظم glutamatergic الإشارات عن طريق تثبيتتعطيل الدولة من قنوات الصوديوم الجهد بوابات، مما يؤدي إلى نقص في الافراج عن الغلوتامات، والتقوية من امتصاص الصوديوم عن طريق زيادة في التعبير الغلوتامات نقل، مما يؤدي إلى زيادة إزالة الغلوتامات 30 و 31 و 32 و 33.
لقد اخترنا هذه البينات معينين لأغراض بيانية لأربعة أسباب. أولا، هذه البينات يوضح القرار الزمني للنظام، كما يتضح من قدرتنا على قياس ديناميكية سريعة للإفراج عابرة وامتصاص الغلوتامات. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا نموذج حيواني قبل السريرية يسلك التعديلات في الغلوتامات منشط، والإفراج عن الغلوتامات، وإزالة الغلوتامات، والسماح للحصول على مثال من التعديلات في كل قياس. ثانيا، استخدام هذه البينات، والقرار المكانية العالية التي تسمح لقياس الاختلافات الفرعية في DG، CA3، والثانية يتجلى CA1 من الحصين. ثالثا، يسمح هذه البيانات لمظاهرة لكيفية التدخل الدوائي يمكن استخدامها للتخفيف من التعديلات glutamatergic لوحظ في النماذج الحيوانية قبل السريرية. وأخيرا، لأن هذا النموذج قبل السريرية لديها تغيرات في الافراج عن الغلوتامات، والحاجة إلى تفسير دقيق لإزالة الغلوتامات في حضور إطلاق الغلوتامات تغيير يمكن تفسيره.
بعد أن وصل إلى خط الأساس مستقرة، كما يتضح من <0.004 غ / تغيير دقيقة في منحدر (10-20 دقيقة)، قمنا بقياس مستويات أول منشط الغلوتامات (ميكرومتر) عن طريق حساب متوسط مستويات الصوديوم خارج الخلية خلال 10 ثانية قبل أي تطبيق الحلول. لاحظنا زيادة مستويات منشط الغلوتامات في المناطق CA3 وCA1 من الفئران TauP301L، وريلوزول استعادة مستويات الغلوتامات منشط لذلك من الضوابط (الشكل 3A). بعد ذلك، تم تسليمها بوكل محليا (عن طريق micropipette) لكل من المناطق الفرعية الثلاثة من hemisph واحديحرث كل 2-3 دقائق. بعد 10 إشارات قابلة للتكرار، مما يدل على نظام الخلايا العصبية الغلوتامات سليمة 34، وبلغ متوسط نتائج كل مجموعة ومتوسط السعة مقارنة. آثار تمثيلية (الشكل 3B) كشفت زاد الإفراج الغلوتامات في الفئران TauP301L التالية تطبيق بوكل في جميع المناطق الفرعية الثلاث (فقط يظهر CA3)، وهو التأثير الذي تم إنقاذه عن طريق العلاج ريلوزول (الشكل 3C).
كان MEA ثم انتقل إلى نصف الكرة الآخر، وسمح للوصول إلى خط الأساس مستقرة (10-20 دقيقة) قبل تطبيق الغلوتامات الخارجية لبحث إزالة الغلوتامات (الشكل 4). طبقت - (250 NL 50) من 200 ميكرومتر العقيمة التي تمت تصفيتها حل الغلوتامات في الفضاء خارج الخلية كل 2 - 3 مجلدات مختلفة كانت تستخدم كمقياس لامتصاص الصوديوم دقيقة، وصافي المساحة تحت المنحنى (AUC). هذا التطبيق السريع للالغلوتامات في ركان الفضاء خارج الخلية يسمح لمحاكاة الإفراج الغلوتامات الذاتية وقياس امتصاص الصوديوم. لأن النقل الغلوتامات معرض ميخائيل-مينتن حركية 35، ومجموعة من وحدات التخزين - يتم حقن (50 250 NL) الغلوتامات الخارجية لكشف الاختلافات في امتصاص. للقيام بذلك، يتلقى كل حيوان 1-2 حقن في 50 الزيادات NL ضمن 50 - مجموعة NL 250. على الرغم من أن واحدة دائما التأكد من أن حجم حقن لكل مجموعة في المنطقة لا يختلف إحصائية عند P ≤ مستوى 0.05، وأفضل طريقة لضمان صافي AUC يرتبط امتصاص، وليس كمية الصوديوم تطبيق أو نشرها، هو التأكد من أن كل من السعة (الشكل 4A) وارتفاع T (مقياس نشر من مصدر نقطة (micropipette) إلى الشرق الأوسط وأفريقيا في الشكل 4B) لا تختلف 10 و 11 و 19 و 20. هذا ألووفاء سلطان ل "ذروة مطابقة" سعة (الشكل 4C) مثل التي يفترض الاختلافات في صافي AUC أن ذلك يعود إلى الاختلافات في امتصاص وليس كمية تطبيقها أو نشرها. مطابقة ذروة مهم بشكل خاص عندما تكون الحيوانات الخلافات القائمة في الافراج عن الغلوتامات. لأن يتم حقن مجموعة من وحدات التخزين، والتباين لكل من اتساع وارتفاع T غالبا ما تكون كبيرة وإضافة الحيوانات إضافية لا يقلل من التباين لهذه التدابير، لأنها متأصلة في التصميم. لأن اتساع وارتفاع T كانت متشابهة بين المجموعات في كل المنطقة دون الإقليمية (الشكل 4A، 4B)، ونحن نفترض أن الاختلافات في صافي AUC (الشكل 4C، 4D) هي نتيجة لاختلافات في امتصاص الصوديوم. تحسين ريلوزول إزالة الغلوتامات مقارنة مع الضوابط في جميع المناطق الفرعية الثلاث (الشكل 4D). وأخيرا، يتم استخدام MEA مع micropipette المرفقة لتطبيق محليا صبغة لتأكيد وضع MEA بعد الدماغ باجتزاء، كما هو موضح في الشكل 3D.
وتشير هذه البيانات إلى أن تكنولوجيا MEA قادرة على قياس الافراج عن العصبي في مناطق فرعية صغيرة من الحصين 24 و 25، على عكس التقنيات السابقة (على سبيل المثال، microdialysis)، والتي سجلت فقط من المناطق عينة كبيرة وتلف في كثير من الأحيان الدوائر العصبية 28 و 29. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف توفر لنا مع القرار الزماني عالية لقياس حركية سريعة للإفراج الغلوتامات وإزالة 25.
الشكل 1: في المختبر المعايرة من مسرى مكروي المرجعية الذاتي قياس التغير في الحالي (PA) على أوكسيديز الموقع الغلوتامات (GluOx، الحمراء) مقابل أحد مواقع الحارس (المرسلة. أزرق). وinterferents حمض الاسكوربيك (AA: 250 ميكرومتر) والدوبامين (DA: 2 ميكرومتر) لم يغير التيار في أي أوكسيديز الغلوتامات أو مواقع الرصد. أنتجت الزيادة الحالية تدريجية على موقع أوكسيديز الغلوتامات، ولكن لا تغيير في موقع الحارس: إضافة الغلوتامات (20، 40، 60 ميكرومتر غلو). بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2: 8.8 ميكرومتر) تنتج زيادة في التيار في كلا الموقعين. حسبت حساسية، والانحدار، والحد من الكشف، وR 2 القيم بعد المعايرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. عينة الكيمياء الكهربائية ورقة عمل. وتتضمن ورقة العمل هذه الأعمدة لوقت الحقن أو عدد الحقن (TIME / TTL)، الإحداثيات الدماغ (AP، مل، DV)،كمية الضغوط التي مورست (النيتروجين)، وطول ضغط (الوقت)، وحجم حقن من قبل القاذف الضغط. أي ملاحظات، مثل إشارات غريبة أو انسداد من micropipette يجب أن تسجل في عمود الملاحظات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. خارج الخلية تونيك وكلوريد البوتاسيوم (بوكل) بيان -evoked من الغلوتامات في المناطق DG، CA3، وCA1 من الحصين. (A) في المناطق CA3 وCA1 من الحصين، ومستويات الغلوتامات منشط وزادت بشكل ملحوظ في المعالجة المركبة الفئران TauP301L (للمركبة، TauP301L)، وهو التأثير الموهن عن طريق العلاج ريلوزول. (B) أظهرت التسجيلات التمثيلية المطابقة الأساس الإفراج الغلوتامات أثار بوكل في CA3 ص العلاج iluzole (ريلاينس اندستريز-TauP301L) الموهن الزيادة الكبيرة في السعة الإفراج الغلوتامات التي لوحظت في الفئران للمركبة، TauP301L. التطبيق المحلي من بوكل (↑) تنتج زيادة قوية في الغلوتامات خارج الخلية التي عادت بسرعة إلى مستويات منشط. (C) وزيادة كبيرة أثار بوكل الإفراج الغلوتامات التي لوحظت في الفئران للمركبة، TauP301L في DG، CA3، وCA1 بعد الموهن التطبيق المحلي من بوكل مع العلاج ريلوزول. (D) الكريزيل البنفسجي الملون 20 ميكرون قسم من الحصين يظهر موقع المسارات MEA في CA3 وCA1 (يعني ± SEM. ** ف <0.01 للمركبة-تحكم مقابل للمركبة، TauP301L، # ف <0.05 ريلاينس اندستريز-Tau- P301L مقابل للمركبة، TauP301L، ## ف <0.01 ريلاينس اندستريز-TauP301L مقابل للمركبة، TauP301L، ن = 14-19 / مجموعة). هذا الرقم طبع بإذن من جون وايلي وأولاده 19 و 20.r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الغلوتامات امتصاص عقب مصادر خارجية تطبيق الغلوتامات في المناطق DG، CA3، وCA1 من الحصين. (A) وكانت السعة للإشارة الغلوتامات تطبيقها محليا مماثلة بين الجماعات في كل منطقة. كان (B) ارتفاع T، وهو مؤشر على نشر الغلوتامات من micropipette، على غرار بين المجموعات في كل منطقة. (C) إشارات الغلوتامات التمثيلية في CA3 من التطبيق المحلي الغلوتامات في للمركبة، عناصر التحكم، للمركبة، TauP301L، والفئران ريلاينس اندستريز-TauP301L. العلاج (D) ريلوزول خفضت زيادات كبيرة في صافي المساحة تحت المنحنى (AUC) لوحظ في الفئران للمركبة، TauP301L في جميع المناطق 3 من قرن آمون، مما يشير إلى تحسن امتصاص الصوديوم في المعالجة ريلوزول Tالفئران auP301L (يعني ± SEM؛ * ف <0.05 للمركبة-تحكم مقابل للمركبة، TauP301L **، ف <0.01 للمركبة-تحكم مقابل للمركبة، TauP301L، # ف <0.05 ريلاينس اندستريز-TauP301L مقابل Veh- TauP301L، ## ف <0.01 ريلاينس اندستريز-TauP301L مقابل للمركبة، TauP301L، ن = 13-15 / مجموعة). وقد طبع هذا الرقم بإذن من جون وايلي وأولاده 20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 0.05 M PBS | 2 L DI المياه: |
| مخزن في كوب زجاجي ملفوفة بورق القصدير. جلب الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع KOH إذا لزم الأمر. | ناه 2 PO 4 · H 2 O: 2.8 ز نا 2 هبو 4: 11.34 جم كلوريد الصوديوم: 11.68 ز |
| 20 ملم حمض الأسكوربيك 50 مل DI المياه: | |
| جعل الطازجة يوميا. | حمض الاسكوربيك: 0.18 ز |
| 20 ملي L-جلوتاماتي | 50 مل DI المياه: |
| جعل أسبوعية جديدة. | L-الغلوتامات أحادية الصوديوم والملح هيدرات: 0.15 ز |
| 2 مم الدوبامين | الدوبامين هيدروكلوريد: 0.038 ز |
| جعل شهرية جديدة. | 0.1 M البيركلوريك حمض: 10 مل ليصل حجم 100 مل مع الماء DI |
| 8.8 ملي بيروكسيد الهيدروجين | 50 مل DI المياه: |
| جعل أسبوعية جديدة. | بيروكسيد الهيدروجين: 500 ميكرولتر |
| 70 ملي كلوريد البوتاسيوم | 100 مل DI المياه: |
| جعل يوم جديد من التجربة. | كلوريد البوتاسيوم: 0.08 جم كلوريد الصوديوم: 0.07 جم كلوريد الكالسيوم: 0.004 ز |
| 200 μ؛ M جلوتاماتي | 20 ملم الغلوتامات: 100 ميليلتر |
| جعل يوم جديد من التجربة. | ملحي معقم: 10 مل |
الجدول 1: حلول المعايرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية MEA تسمح لقياس حركية سريعة للإفراج العصبي وامتصاص في المختبر والمجراة. وبالتالي، فإن التكنولوجيا وتنتج مجموعة واسعة من إخراج البيانات بما في ذلك مستويات الناقل العصبي منشط، أثار الافراج عن العصبي، وإزالة العصبي. ومع ذلك، لأن استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هو إجراء معقد نسبيا، وهناك العديد من العوامل التي قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل للاستخدام الناجح. على سبيل المثال، أثناء المعايرة، واحد قد لاحظ أنه لا توجد إشارة الطول الموجي (شاشة الذبذبات) أو أن الردود على التحفيز هي الحد الأدنى، أو غائبة. على الأرجح بسبب عطل النظام، إعادة تشغيل نظام التسجيل، أو الكمبيوتر، قد حل المشكلة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون المشكلة خطأ اتصال. قبل معايرة، ومن المناسب لإعادة التحقق من أن اتصالات القطب MEA وإشارة ترتبط بشكل صحيح. استبدال المقبس DIP على headstage قد حل مشكلات الاتصال MEA.إذا كان MEA ليس تماما في حل أو يتم استخدام القطب المرجع سوء صيانتها، وهذه قد تتداخل أيضا مع التسجيل أثناء المعايرة. ردود إشارة تباطأ خلال المعايرة هي قضية مشتركة أخرى، والتي قد تنجم عن سمكا مما يجب خليط BSA / غلوتارالدهيد، أو الغزل ببطء بقضيب. في حال interferents بإعطاء إشارة أثناء المعايرة، فمن الممكن أن هناك خطأ في الكهربائي (على سبيل المثال لم بالكهرباء لفترة طويلة بما فيه الكفاية) طبقة استبعاد MPD. في مثل هذه الحالة، وتكرار الإجراء الكهربائي أمر ضروري.
أثناء الجراحة، قد لا يكون مستوى مخدر واحدة كافية لجميع الفئران. قد تتطلب بعض الفئران مستويات أعلى من التخدير "اذهب تحت عنوان" وقد تتطلب بعض الفئران أقل. ومن الضروري أن تبدأ على مستوى منخفض من التخدير وببطء رفعه حتى الفأر هو تحت تخدير خفيف. ويمكن اختبار التخدير العميق مرة واحدة على الماوس في جهاز التجسيمي من قبلالذيل أو قرصة أخمص قدميه. عند اختيار الإحداثيات لغرس MEA، من المهم أن نلاحظ والصحيح لاحتمال ضمور في الدماغ التي يمكن أن تحدث في العديد من النماذج الحيوانية الاعصاب 36 و 37 و 38 أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري أثناء الجراحة أن الدم لا تتراكم في الشرق الأوسط وأفريقيا، وهذا يمكن أن تؤثر على خصائص تسجيل الشرق الأوسط وأفريقيا وينتج في القرار الزماني بطيئة أو ردود إشارة التقليل إلى حد كبير. إذا جلطات الدم في جميع أنحاء القطب، ببساطة إزالة MEA وشطف مع المياه المالحة.
أثناء التسجيل، واحدة من أكثر المشاكل شيوعا التي يمكن أن تحدث هو أن إشارة صاخبة. تدخل من الأجهزة الإلكترونية الأخرى، مثل مساعد الإضاءة وأدوات إضافية، والتدريبات هي السبب في الغالب المحتملة، لذلك فمن الأفضل لتجنب توصيل لهم في نفس الدائرة الكهربائية و / أو منفذ كنظام تسجيل. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان تسجيل SYS لا يرتكز تيم بشكل صحيح، واحد سوف نلاحظ التذبذبات على الذبذبات من نظام تسجيل وكذلك الضوضاء الناجمة عن جميع المواقع، وليس فقط مواقع التسجيل. حصيرة أسس الموصى بها في إطار نظام تسجيل يجب أن تكون متصلا الأنابيب على الارض لتجنب هذه القضايا. وإذا تبين أن أيا من هذه هي خطأ، قد يكمن الخطأ مع القطب إشارة، أو MEA نفسها. عند مواجهة القضايا الضوضاء، وذلك باستخدام، MEA غير مستخدمة جديدة للتحقق من تشغيل هذا النظام يمكن أن يكون نهجا مفيدا استكشاف الأخطاء وإصلاحها. إذا فصل أو استبدال نتائج إشارة الكهربائي في قليل من دون تغيير، القطب إشارة أو نصف الخلية قد تعرضت لمشاكل فنية. تغيير القطب المرجعية قد يكون السبيل الوحيد لحل المشكلة. وبمجرد تسجيل كاملة، فائدة النهائية للMEA هي القدرة على تنظيف وإعادة استخدامها. يمكن إعادة استخدامها الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ما يقرب من ثلاث مرات طالما استمر MEA لأداء كاف أثناء المعايرة.
SS = "jove_content"> وفي الختام، على الرغم من المشاكل أحيانا قد تكون هناك حاجة، واستخدام تقنية MEA هو مفيد لدراسة الإفراج السريع وإزالة العصبي داخل المطلوب المناطق الفرعية من الدماغ. الدراسات الحالية تركز على استخدام التكنولوجيا MEA في الفئران TauP301L تخدير للاستفادة من منهجية MEA لبحث الافراج عن الغلوتامات وامتصاص في المناطق الفرعية للمسار trisynaptic الحصين. والدراسات المستقبلية معالجة القضايا منشط وتمر بمراحل إضافية في الفئران مستيقظا، كما كان هذا مفيد جدا لربط الأحداث السلوكية للتدابير الديناميكية للمنشط والغلوتامات طوري في الفئران مستيقظا ومؤخرا، الرئيسيات غير البشرية مستيقظا. في حين تم تطوير هذه التكنولوجيا لدراسات العلوم الأساسية، والمستقبل يبشر بالخير لتنفيذ تقنية التسجيل للبحوث السريرية ومراقبة كيميائي عصبي أثناء العملية للعلاج وتقييم اضطرابات الدماغ مثل مرض باركنسونالصرع الثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GG هو المالك الوحيد للQuanteon، LLC التي تجعل من 16 FAST نظام تسجيل يستخدم لقياس الغلوتامات في هذه الدراسة. JEQ هو استشاري دفعت لQuanteon.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (MNR، U54GM104942)، NIA (MNR، R15AG045812)، جمعية الزهايمر (MNR، NIRG-12-242187)، وفو كلية البحوث في مجلس الشيوخ غرانت (MNR)، ووفو PSCOR غرانت (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
