Summary
Hier beschrijven we de setup, softwarenavigatie en gegevensanalyse voor een ruimte en tijd nauwkeurige werkwijze voor het meten tonische en fasische extracellulair glutamaat veranderingen in vivo middels enzymgekoppelde micro-elektrode arrays (MEA).
Abstract
Neurotransmitter verstoring is vaak een belangrijk onderdeel van ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), die een rol spelen bij de pathologie ten grondslag liggen aan de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, depressie en angst. Traditioneel is microdialyse de meest voorkomende (geprezen) techniek om neurotransmitter veranderingen die optreden in deze aandoeningen te onderzoeken geweest. Maar omdat microdialyse heeft de mogelijkheid om langzame 1-20 minuten wijzigingen in grote weefselgebieden meten, heeft het nadeel invasieve potentieel vernietigen intrinsieke verbindingen binnen de hersenen en een langzame sampling vermogen. Een relatief nieuwere techniek, de micro-elektrode array (MEA), heeft talrijke voordelen voor het meten van specifieke neurotransmitter veranderingen in discrete hersengebieden die zich voordoen, waardoor een ruimte en tijd nauwkeurige benadering. Voorts worden volgens MEA is minimaal invasief, waardoor het meten van veranderingen in vivo neurotransmitter. In ons laboratorium, we have specifiek geïnteresseerd in veranderingen in de neurotransmitter glutamaat, gerelateerd aan de ziekte van Alzheimer-pathologie geweest. Als zodanig heeft de hier beschreven werkwijze werd gebruikt om potentiële storingen in hippocampale glutamaat evalueren in een transgeen muismodel van de ziekte van Alzheimer. In het kort, de gebruikte methode omvat het bekleden van een multi-site micro-elektrode met een enzym zeer selectief voor de neurotransmitter van belang en het gebruik van zichzelf verwijzende sites om af te trekken uit achtergrondgeluiden en storende stoffen. Na plateren en kalibratie, kan de MEA worden geconstrueerd met een micropipet en neergelaten in het hersengebied van interesse met behulp van een stereotaxische inrichting. Hier beschreven werkwijze het verdoven RTG (TauP301L) 4510 muizen en gebruiken van een stereotaxische inrichting nauwkeurig richten deelgebieden (DG, CA1 en CA3) van de hippocampus.
Introduction
Meten neurotransmitter veranderingen in de hersenen is een belangrijk instrument voor het bestuderen neurologen ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) die vaak wordt gekenmerkt door ontregeling neurotransmitter. Hoewel microdialyse in combinatie met hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC / EG) de meest gebruikte methode om veranderingen in extracellulaire neurotransmitter niveaus 1, 2, meten is 3, 4, de ruimtelijke en temporele resolutie van microdialyse probes niet ideaal voor neurotransmitters zoals glutamaat, die nauw worden geregeld in de extracellulaire ruimte 5, 6. Als gevolg van de recente ontwikkelingen in de genetica en imaging, zijn er extra methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaat in kaart in vivo. Met behulp van genetisch gecodeerde glutamaat fluorescente reporters (iGluSnFR) eend twee-foton beeldvorming, kunnen onderzoekers glutamaatafgifte visualiseren neuronen en astrocyten zowel in vitro als in vivo 7, 8, 9. Met name maakt dit het opnemen van een groter gezichtsveld en niet de intrinsieke verbindingen van de hersenen verstoren. Terwijl deze nieuwe optische technieken maken visualisatie van glutamaat kinetiek en meting van sensorische reacties van de consument en neuronale activiteit, missen ze het vermogen om de hoeveelheid glutamaat in de extracellulaire ruimte in discrete hersengebieden kwantificeren.
Een alternatieve methode is het enzym-gebonden micro-elektrode array (MEA) die selectief kan meten extracellulaire neurotransmitter niveaus, zoals glutamaat, door middel van een zelf-verwezen opname systeem. De MEA techniek is gebruikt om veranderingen in de extracellulaire glutamaat na een traumatisch hersenletsel te bestuderenletsel 10, 11, 12, verouderen 13, 14, stress 15, 16, epilepsie 17, 18, de ziekte van Alzheimer 19, 20, en de injectie van een viraal nabootser 21 en vertegenwoordigt een verbetering van de ruimtelijke en temporele beperkingen die inherent zijn microdialyse. Dat microdialyse het vermogen te meten bij de synaps 22, 23 beperkt, MEA een hoge ruimtelijke resolutie waarmee selectieve maatregelen van extracellulair glutamaat spill buurt synapsen 24, 25. Ten tweede, de lage tijdsresolutie van microdialyse (1-20 min) beperkt de mogelijkheid om de onderzoekensnelle dynamiek van de afgifte van glutamaat en vrije ruimte die zich in de milliseconde naar de tweede reeks 26. Vanwege verschillen in de afgifte van glutamaat of klaring niet zichtbaar kunnen zijn maatregelen tonic, rusten glutamaat, kan het noodzakelijk zijn dat glutamaatafgifte en klaring direct worden gemeten. MEA toelaten dat dergelijke maatregelen vanwege hun hoge tijdsresolutie (2 Hz) en lage detectielimiet (<1 uM). Ten derde, MMO zorgen voor onderzoek van subregionale variaties in neurotransmitters binnen een bepaald hersengebied, zoals de rat of muis hippocampus. Bijvoorbeeld met behulp MEA kunnen we afzonderlijk richten de dentate gyrus (DG), cornu ammonis 3 (CA3) en cornu ammonis 1 (CA1) van de hippocampus, die via een trisynaptic schakeling 27 verbonden, subregionale verschillen in extracellulair glutamaat te onderzoeken. Vanwege de omvang van microdialyse probes (1-4 mm lang) en de schade veroorzaakt door implantatie 28 </ sup>, 29, subregionale verschillen zijn moeilijk aan te pakken. Bovendien is de optische systemen staan alleen stimulatie door middel van externe stimuli, zoals een whisker stimulatie of lichte trilling, die subregionale stimulatie 7 niet toelaat. Een laatste voordeel van MEA's ten opzichte van andere methoden is de mogelijkheid om deze subregio's in vivo te bestuderen zonder verstoring van hun extrinsieke en intrinsieke verbindingen.
Hier beschrijven we hoe een registratiesysteem (bijvoorbeeld FAST16mkIII) bij MEA, bestaande uit een keramiek gebaseerde multisite microelektrode, differentieel kunnen worden aangebracht op de opname plaatsen om voor storende stoffen te detecteren en uit het analytsignaal. We tonen ook aan deze arrays kunnen worden gebruikt voor amperometrie op basis van studies van in vivo glutamaat voorschrift in de DG, CA3 en CA1 hippocampus deelgebieden van verdoofde RTG (TauP301L) 4510 muizen, een veelgebruikte mOuse model van de ziekte van Alzheimer. Daarnaast bieden wij een bevestiging van de gevoeligheid van het MEA systeem om de snelle dynamiek van glutamaatafgifte en goedkeuring door behandeling van de muizen met riluzol een in vitro geneesmiddel glutamaatafgifte verminderen en glutamaat opname 30, 31, 32, 33, en demonstreren van deze respectieve veranderingen in vivo in de TauP301L muismodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het bekleden van de micro-elektrode Array met enzymen of Matrix Layer
- Bereiding van de proteïne matrixoplossing
- Weeg 10 mg runderserumalbumine (BSA) en plaats het 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 985 ul van DI water aan de microcentrifugebuis met BSA. Meng de oplossing door handmatig roeren (opnieuw pipetteren met behulp 1,000 ul pipet tot 3 maal, totdat het BSA opgelost).
OPMERKING: Gebruik geen vortex om de oplossing te mengen Hierdoor kunnen de lucht in de oplossing. Zet tevens de pipet tot een volume <1,000 pi (bijvoorbeeld pi 700) om te voorkomen dat er luchtbellen. De oplossing kan in een microcentrifuge geplaatst indien nodig. - Zodra de BSA-oplossing opgelost, voeg 5 ul van 25% glutaaraldehyde oplossing. Meng de oplossing door het omkeren van de gesloten buis 3-5 keer. De resulterende oplossing 1% BSA met 0,125% glutaaraldehyde.
- Vernietiging van het eiwit matrix oplostie gedurende 5 minuten. De oplossing zal lichtgeel van kleur verschijnen.
- Het bereiden van de gewenste enzymoplossing (bijvoorbeeld glutamaat oxidase)
- Bereid de glutamaat oxidase door toevoeging gefilterd DI water om het gevriesdroogde, gezuiverde enzym (bijvoorbeeld 50 pi DI water toegevoegd aan 25 eenheden glutamaat oxidase ter verkrijging van 0,5 E / ul).
OPMERKING: Aliquot voorraadoplossing (bijvoorbeeld 1 pi) en de monsters in geschikte afmeting containers (bijvoorbeeld 500 pl microcentrifugebuizen) bewaren bij -20 ° C. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden onder deze omstandigheden. - Voeg 4 pi van de BSA / glutaaraldehyde oplossing voor de microcentrifugebuis porties verdeeld buis met glutamaat oxidase. Meng de oplossing door handmatig roeren (opnieuw pipetteren met een pipet 10 pi. De pipet moet worden ingesteld volume <5 pi). De resulterende oplossing 1% BSA, 0,125% glutaaraldehyde en 0,1 U / ul glutamaat oxidase.Met de oplossing onmiddellijk coaten.
Opmerking: glutamaat oxidase bekledingsoplossing kan uitsluitend worden gebruikt binnen 15 minuten. Hoewel verschillende MEA worden bekleed met een bereide oplossing wordt aanbevolen de bruikbare tijdvenster voor glutamaat oxidase niet te overschrijden. Het aantal elektroden die binnen 15 minuten kan worden bekleed variëren. In het algemeen kunnen 4-6 elektroden bekleed tegelijk.
- Bereid de glutamaat oxidase door toevoeging gefilterd DI water om het gevriesdroogde, gezuiverde enzym (bijvoorbeeld 50 pi DI water toegevoegd aan 25 eenheden glutamaat oxidase ter verkrijging van 0,5 E / ul).
- Het bekleden van de MEA
- Typisch bekleden van een paar opnameplaats (s) op een MEA met het gewenste enzym (glutamaat oxidase) en een ander paar opnameplaats (s) ( 'sentinel' site (s)) wordt bekleed met het inactieve eiwit-matrix.
- Stompe-uiteinde Hamilton microspuitjes (bijvoorbeeld 10 pi) te bekleden MEA met L-glutamaat oxidase of inactief eiwit matrixoplossing (BSA + glutaaraldehyde). De voor enzym of inactief eiwit-matrix coatings zijn hetzelfde.
- Reinig de spuiten voor en na gebruik (3 spoelingen metDI water, 3 spoelingen met methanol, 5 spoelingen met DI-water).
OPMERKING: Dedicated spuiten worden gebruikt voor het aanbrengen van lagen enzym (glutamaat oxidase) of eiwit-matrix. Gebruik de spuit niet gebruiken voor een andere oplossing. Het wordt aanbevolen om eiwit-matrix coatings voeren voordat enzym coatings. - Opstellen glutamaat oxidase of proteïnematrix met een 10 pi Hamilton spuit. Druk de zuiger om een kleine druppel oplossing af op de spuit (gevisualiseerd onder toepassing van een dissectiemicroscoop).
- Met de dissectiemicroscoop te concentreren op de MEA opname sites, de oplossing van toepassing op de juiste registratie plaatsen door kort contact brengen van de opname sites met de oplossing druppel / kraal, die een laag voorstelt. Drie lagen zijn voldoende om zowel eiwit-matrix en het enzym vacht. Dikke lagen kan de gevoeligheid van de MEA te verminderen.
- Breng de oplossing druppel recht omhoog en van de opnames sites (dat wil zeggen de syringe tip niet schrapen over het oppervlak MEA).
- Een timer instellen gedurende 1 minuut. Dit is de minimale benodigde tijd tussen bekledingstoepassingen de opnameplaats (s). Allow-enzym beklede MEA harden bij 4 ° C gedurende 5-7 dagen.
- Noteer het aantal lagen toegepast, hoe lang het duurde voor de verf, de elektrode nummer en een naam en datum toe te passen in een laboratorium notebook.
2. Galvaniseren met m-fenyleendiamine voor betere Selectiviteit
- Bereiden m-fenyleendiamine dihydrochloride (MPD) -oplossing
OPMERKING: Plate uitsluiting laag MPD de oxidatie van dopamine en andere grote interfererende moleculen (bijvoorbeeld ascorbinezuur) te voorkomen, waardoor de selectiviteit van de sensor voor glutamaat / H2O 2 boven andere potentieel interfererende moleculen verbeteren.- Breng 50 ml van 0,05 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een volumetrische kolf en 50 ml 0,05M PBS tot een grotere (150 ml) Erlenmeyer kolf.
- Via de buis aangesloten op een stikstoftank (bijvoorbeeld via de buis aangesloten druk ejecteur), voeg een pipetpunt (bijvoorbeeld P200 tip) aan het open einde van de buis. Plaats de buis met de bijgevoegde pipetpunt in PBS oplossing en dek de oplossing losjes met parafilm. Schakel stikstof en voorzichtig bellenoplossing gedurende 20 min.
- Weeg 0,045 g MPD.
Let op: MPD is een potentieel kankerverwekkende stof. Wegen MPD worden uitgevoerd op een schaal binnen een zuurkast. Draag handschoenen en een masker bij het gebruik van MPD. Zorgen de kap en zorg ervoor dat het raam wordt getrokken om de juiste werkhoogte. Onmiddellijk reinigen oppervlakken die mogelijk zijn verontreinigd met MPD permanente kleuring te vermijden. - Na borrelen, overdracht van al het MPD de ontgast PBS-oplossing. Dek de kolf opening met parafilm en voorzichtig swirl oplossing MPD in oplossing op te lossen. Vermijd aggressive mengen of het gebruik van een vortex Hierdoor kunnen de gassen introduceren in de oplossing.
- Breng de oplossing in een 50 ml beker. Een roerstaaf niet nodig.
- Electroplating de elektrode
- Verkrijgen van een referentie-elektrode. Met referentie-elektroden gewijd aan MPD alleen plating. Met een andere referentie-elektrode voor kalibratie procedures.
- Plaats de plastic arm van de referentie-elektrode houder boven het bekerglas. Controleer luchtbellen in het glas referentie-elektrode (mogelijk niet te zien). Zachtjes flick het distale uiteinde van de referentie-elektrode om eventuele luchtbellen aan het uiteinde te verwijderen.
- Plaats de referentie-elektrode door de opening in de kunststof arm en de onderste in de beker met PBS. Waarborgen dat de referentie-elektrode niet raakt de bodem van de beker.
- Sluit de referentie elektrode naar de headstage (bijvoorbeeld 2 pA / mV) en verbinding (bijv DIP connector) het MEA te mpd plaat zijnd de headstage.
- Laat de MEA in de beker oplossing zodat alleen de MEA tip ondergedompeld in oplossing. Dompel de MEA tips in vloeibare voorbij de zwarte 'bubble' (de zwarte isolatie boven de MEA tip bevindt). Hierdoor kan de MEA beschadigen.
- Voer een 'test' kalibratie om de functionaliteit van de elektrodekanalen en aansluiting op het headstage controleren.
OPMERKING: Hoewel de hardware-instellingen van de apparatuur moet weerspiegelen wordt gebruikt, details met betrekking tot analyt / interfererende type en de concentratie niet hoeven te worden ingevoerd voor de 'test' kalibratie. Het hercoderen mode moet 'amperometrie' en 'V toegepast' moet -0,7 V. Controleer kenmerkend opname voor alle kanalen. - Annuleren door op 'Annuleren' als de connectiviteit van alle opname-sites wordt geverifieerd. Het is niet nodig om de kalibratie gegevens op te slaan.
- Selecteer het pictogram "Electroplating" op het bureaublad. De Electroplating Tool Menu zal verschijnen. Controleer of de juiste instellingen zijn ingevoerd:
PP amplitude: 0,25
Offset: -0.5
Frequentie: 0,05
Duur (min): 20 - Selecteer de 'pauze' knop om plating beginnen. De verstreken tijd dient te beginnen met aftellen.
- Na voltooiing (alle tijd die is verstreken), selecteert u 'een ander MEA' in het popped up menu om te beginnen met MPD plating een extra MEA. Vervang de geplateerde MEA met een MEA te MPD bedekt en herhaal de elektrolytische bij gebruik van het elektrolytische tool.
LET OP: Het is aanbevolen om de voorbereide MPD-oplossing niet meer dan 2 keer of binnen een 1 uur periode. Bereid een verse oplossing om meer dan 2 MEA te bereiden. - Selecteer 'exit software' te galvaniseren voltooien. Spoel MPD-plated electrodepunten met DI-water (in een zout reststoffen) en opslag (24 uur) voorafgaand kalibreren.
- Verwijder de referentie-elektrode uit de oplossing en spoelen met gedeïoniseerd water alvorens in de juiste storage oplossing (bijvoorbeeld 3 M NaCl). Zorgen de referentie-elektrode is ondergedompeld in oplossing. Langzaam onderglas referentie-elektrode in de oplossing om beschadiging van het glas.
- Gooi de mpd oplossing in een geschikt gemerkte container gevaarlijk afval.
3. Kalibreer de MEA voor glutamaat detectie en selectiviteit (figuur 1) 21
- De voorbereiding van de oplossingen die nodig zijn voor de kalibratie.
OPMERKING: zie tabel 1. - Kalibratie uitvoeren onder constant roeren (magnetische roerder batterijen) bij 37 ° C. Zet de verwarming pad of circulerend waterbad en het verkrijgen van een kleine roerstaaf. Roer langzaam maar snel genoeg dat als een toevoeging wordt gedaan (zie hieronder), de nieuwe plateau is snel bereikt.
- Sluit de headstage (2 pA / mV) om de opname controlesysteem en plaats de MEA tip in 40 ml geroerde 0,05 M PBS (gebruik een 50 ml bekerglas).
- Sluit de raslagwerk elektrode. Flick het einde om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen.
- Open het opnameprogramma en klik op "Calibration". Zorg ervoor dat de instellingen juist zijn (controleer of sentinel sites worden geselecteerd als dit kan veranderen met verschillende elektroden), kiest MEA nummer en druk op "Start".
- Toestaan 5-10 min evenwichtstoestand; beginnen zodra de basislijn is gestabiliseerd (<0,004 nA / min verandering).
- Selecteer "Baseline" en voeg 500 ul van 20 mM ascorbinezuur (storende; finale [250 pm]) en selecteer "Interferentie" (AA wordt gezien als brain-breed interfererende) zodra de huidige een nieuwe, stabiele plateau heeft bereikt, indien ieder. Toestaan 0,5-1 minuut tussen toevoegingen. Als de MEA goed is gegalvaniseerd, moet bijna geen verandering worden waargenomen.
- Voeg 40 ul van 20 mM L-glutamaat (final [20 uM]) en zodra de stroom een nieuw stationaire plateau, mark 1 st naast "Analyt" bereikt. Herhaal dit drie keer voor een totaal van 3 glutamate toevoegingen.
- Voeg 40 ul DA. Do "Analyt" niet te selecteren; Selecteer "Test Substance" - DA mag alleen een storende stof in gebieden met DA zijn.
- Voeg 40 ul Peroxide. Do "Analyt" niet te selecteren; Selecteer "Test Stof".
- Klik op de "Stop" knop zodra de kalibratie is voltooid.
- Om de functionaliteit van de MEA te bepalen, klikt u op het tabblad berekening en de volgende parameters in een lab notebook op te nemen.
- Voor het ontwerp MEA (3000 pm2) die in deze kalibraties, gebruikt een MEA met een helling van ≥ 0,004 nA / gM maar lagere hellingen kan worden gebruikt voor bepaalde experimenten. Als er minder dan 10% verschil in helling tussen gecoat en ongecoat enzym plaatsen, gebruik dan deze MMO voor opgewekte introductie alleen of schone / gooi de MEA.
- Met een detectiegrens (LOD) ≤ 1,5 uM. Als de LOD groter is dan 1,5 urn, gebruik dan deze MMO voor opgeroepen release en slechts opname. Laat deze elektroden niet gebruiken voor het opnemen tonic niveaus.
- Gebruik een selectiviteit voor de gewenste analyt (bijvoorbeeld glutamaat) via storende stof van> 20 arbitraire eenheden. Als selectiviteit minder dan 20, dan schoonmaken / gooi het MEA.
- Gebruik een lineariteit (R2) van de ijkcurve ≥ 0.90. Als lineariteit kleiner dan 0,90, daarna behandelen of verwijderen MEA.
- Sla het bestand met de # van de MEA, de datum en de initialen van de persoon kalibreren.
4. Monteer het Micropipet
OPMERKING: Micropipetten (capillaire glas) zou een tip heeft met een inwendige diameter van 10-15 urn.
- Plaats de micropipet centraal over de vier platina opname plaatsen en monteren 50-100 urn boven de MEA behulp kleefwas en boetseerklei.
- De micropipet laden, gebruikt een 1 ml spuit met glutamaat of KCl-oplossing, een 0,22 urn steriele spuit filter, en een 97 mm lang, 28 gauge pipetvuller, backfill de micropipet. Dat wil zeggen de naald aan de bovenkant van de micropipet en vul onderaan de micropipet (het einde naar het MEA), zorg ervoor dat er geen luchtbellen.
- Bevestig de micropipet om de druk uitwerpsysteem bij 2-20 psi gedurende ongeveer 1 s.
5. Plaat de Miniature referentie-elektrode voor gebruik in vivo
- Bereid de bekledingsoplossing (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCl in een 100 ml bekerglas (bekledingsbad)) en snijd het bad elektrode (~ 10 cm lengte van platina (Pt) draad (~ 0,02" diameter)).
- Snijd een 10-15 cm lang stuk teflon gecoate zilverdraad (0,008" onbelaste) en gebruik een scheermesje afschrapen ~ 1 cm Teflon coating van elk uiteinde van het einde van zilverdraad.
- Soldeer een gouden pen aan één uiteinde en plaats één uiteinde van belichte zilverhalogenide draad in het galvaniseerbad.
- Met behulp van een DC adapter (gebruiken alleen DC adapter met een vermogen van ~ 9 -. 15 opm),Klem de "red" (+) draad op de voorbereide zilverdraad (referentie-elektrode) op de gouden pin zijkant. Klem de "zwarte" (-) draad op Pt kathode bad.
- Sluit de DC-adapter. Kijk voor de juiste plating proces - bubbels moet op het bad elektrode verschijnen; referentie-elektrode maakt een zilver / grijze kleur.
LET OP: de kabels niet te schakelen [Black (-) versus Rood (+)] - plating bad zal worden geruïneerd als dit gebeurt en vers plating oplossing zal moeten worden gemaakt. Een slechte oplossing wordt geel van kleur: GEBRUIK GEEN!
Opmerking: Het plateren reactie vindt meestal 2-5 min: Ag 0 + Cl - → AgCl + e - - Test de referentie-elektrode.
- Zet een multimeter aan de 100-200 mV DC-instelling.
- Plaats een referentie (dat wil zeggen een eerder geteste elektrode bekend te werken) referentie elektrode 3 M NaCl en toetsing aan de nieuw uitgeplaat referentie-elektrode.
OPMERKING: Als onsing een nieuwe referentie-elektrode, weken in 3 M NaCl vóór gebruik (12 h aanbevolen). - Leg het "red" (+) draad op de gouden pin van de referentie-elektrode te testen. Plaats de "zwarte" (-) lood op benchmark-elektrode. Een aanvaardbaar uitlezing is ± 10 mV. 0 mV is ideaal in de referentie-elektroden 2.
6. Algemene Animal Chirurgie voor MEA Recordings
- Voorbereiding op een operatie
- Plaats de operatie-instrumenten in ontsmettingsmiddel de avond tevoren.
- Verwijder de gereedschappen uit het desinfectiemiddel en goed naspoelen en plaats de tools op een steriele operatie pad. Zorg voor een verwarming pad.
- Kalibreer twee elektroden en bevestig de micropipet zoals beschreven procedures 3 en 4.
- Maak de referentie-elektrode, zoals beschreven in hoofdstuk 5.
- Maak 200 uM glutamaat en 70 mM KCl. Zie Tabel 1.
- Het verkrijgen van het dier en zijn gewicht op te nemen op een operatie vellen.
- Bereid de verdoving en zet de verwarming pad.
- Voer MEA chirurgie
- Middels isofluraan (4% stroming in zuurstof), verdoven van het dier in een inductie kamer tot de ademhalingsfrequentie aanzienlijk is afgenomen en het dier niet reageert op teen of staart knijpen. Opnemen ademfrequentie en lichaamstemperatuur elke 15 min.
- Plaats het dier in de stereotaxische apparaat met behulp van het oor bars om het hoofd te stabiliseren. Zorg ervoor dat het dier is veilig en het hoofd niet beweegt. Verlaag de isofluraan stroom naar 1,5-3% zuurstof. Zodat verwarming pad juist onder het dier is gepositioneerd en ingesteld op 37 ° C om extra warmte. Het niet om extra warmte kan resulteren in een diepe hypothermie en vroegtijdige dood van het dier.
- Toepassing oogzalf met een steriel katoenen applicator en noteer de ademhalingsfrequentie enlichaamstemperatuur. Met behulp van een batterij-aangedreven trimmer, scheren de bovenkant van het hoofd. Gebruik de kleine chirurgische schaar om de vacht te verwijderen in de buurt van de oren.
- Op dit punt, op de steriele operatie handschoenen. Breng jodium en dan alcohol (drie keer) op de hoofdhuid.
- Met behulp van een scalpel, een insnijding recht naar beneden het midden van de hoofdhuid en de verspreiding van de huid met behulp van stierenhond klemmen. Neem een steriele katoenen tip om te genieten van geen bloed. Met waterstofperoxide om het uiterlijk van bregma en lambda vergemakkelijken.
- Controleer of het correct is geplaatst door het meten van de D / V en M / L coördinaten van bregma en lambda. Coördinaat wijzigingen moet nul zijn wanneer de kop op een plat vlak. Pas de kop en oor staven als nodig is om een plat vlak te garanderen.
- Vind bregma, en nul de coördinaten. Met de gewenste coördinaten, naar links en rechts en een markering met behulp van een permanente marker. Met behulp van een cauterizer / marker, maak een groot plein rond de streep met genoeg ruimte om het te bereikengewenste gebied.
- Met een steriele draaigereedschap, boor rond de vierkante markering. Genieten geen bloed met een steriele katoenen applicator. Grondig ontsmet de boor voor elk gebruik.
- Bevestig de MEA de headstage en opvulling van de pipet met het eerste gewenste oplossing. Zeker laat een gat in de pipet onopgelost zodat de oplossing wordt verdreven kan worden onderzocht. Bevestig de slang aan op de glazen micropipet.
- Zet de stikstoftank en de druk ejecteur (psi = 5, time = 0,6 s). Test (druk handmatig rode knop) om de pipet te verzekeren niet verstopt is voordat u begint.
- Kalibreer de micropipet. Begin bij 0 op het dradenkruis en plaats een stuk van de blauwe tape op de headstage naar het beginpunt aan te geven. Schakel de digitale lezer en deze op nul terugzetten. Ga naar beneden 1 mm (DV) en tel het aantal tikken de oplossing is verplaatst op het dradenkruis. 10 teken moet gelijk 1 mm (1 mm = 250 nL), dus 1 tick = 25 nL.
- Plaats de referentie-elektrode in eenafgelegen locatie van de MEA zodanig dat het nog in vloeistofcontact met de hersenen om het circuit te sluiten.
- Zoek bregma met de MEA aangesloten en nul de digitale reader. Verplaats de MEA naar de gewenste coördinaten. Langzaam lager de MEA totdat de punt van de hersenen raakt. Nul de DV coördineren en langzaam de MEA in de hersenen.
- Op de opname programma, klikt u op de gewenste gekalibreerde elektrode en klik op "Perform Experiment." Het systeem zal dan beginnen met het opnemen tonic niveaus voor de analyt van belang, terwijl het dier is verdoofd.
- Zoom om een as die zal helpen bij het observeren basislijn en laat de elektrode basislijn voor 20-45 min.
- Na de basislijn stabiel is, zet de druk ejector 0,6 s en 5 psi en de rode knop van de druk ejector te werpen. Noteer de tijd en druk en volume / teken verplaatst injectie vel (figuur 2). Maak notities die nodig zijn (dat wil zeggen,grotere pieken, verdunningseffecten, verstopte pipet noisy basislijn / o-scope).
- Voor glutamaat injecties Wacht 3-5 min tussen de injecties. Voor KCl injecties wacht 1-2 min tussen de injecties. Injecteren met dezelfde druk en tijd minstens 3 keer. Verander tijd en herhalen. Probeer niet om de druk te veranderen, tenzij de micropipet is verstopt.
- Indien de micropipet verstopt, verhoog de druk tot 30 psi.
- Opnemen van de gewenste hersengebieden, herhalen aan beide zijden van de hersenen met behulp van verschillende oplossingen. Neem een basislijn in elk nieuw gebied voor 20 min.
- Neem de MEA met micropipet bevestigd, spoelen met DI water en genieten in PBS 's nachts totdat al het bloed is verdwenen.
- Inslapen het dier en slaan de hersenen bij een gelabelde gelast en bewaard in de -80 ° C vriezer of houdt een zijde voor bevestiging. Het dier, overdosis met isofluraan (inhalatie) euthanize. Voer onthoofding met behulp van chirurgische schaar en ontleden de gewenste gebieden.
7. Reiniging Coated MEA na gebruik
- Doe niet schoon MEA als ongebruikt. Als er pluisjes of stof op het oppervlak schoon met methanol en laten drogen gedurende 24 uur voorafgaande aan bekleden.
- Zet het waterbad (80 ° C) en geniet het uiteinde van de MEA gedurende 30 min. Veeg de punt van de elektrode met een wattenstaafje om vuil die kan worden overgelaten aan de elektrode te verwijderen. Laat de zwarte "isolatie gedeelte" van de MEA niet nat worden.
- Met behulp van drie verschillende sonicators, geniet het uiteinde van de MEA in (1) Citrisolv, een commercieel oplosmiddel en klaringsmiddel (2) isopropyl, en (3) DI water gedurende 5 minuten. Veeg de punt van de elektrode met wattenstaafje om vuil die kan worden overgelaten aan de elektrode te verwijderen.
- Onderzoek de tips onder een dissectie microscoop om ervoor te zorgen de lagen zijn met succes verwijderd.
8. Analyse
- Om de gegevens te analyseren,eerst exporteren de gewenste experiment door te dubbelklikken op het afgewerkte experiment en het selecteren van "gegevens exporteren" uit het bestand drop-down menu.
- Sla deze gegevens om het gewenste bestand locatie en het openstellen van de analyse programma. Klik op "open" in de analyse programma en kies het laatst opgeslagen bestand.
- Geef het programma een paar momenten om het bestand te uploaden en controleer vervolgens experiment onder het tabblad eventmarkers. Onder uitgang, de vakjes van de gewenste parameters. Bijvoorbeeld basislijn amplitude piekgebied (oppervlak onder de curve), T stijgen en T 80.
- Klik op Vernieuwen en vervolgens te analyseren om de gegevens te exporteren naar een spreadsheet (dit kan een paar minuten duren). Het programma zal een prompt om het bestand op te slaan naar de gewenste locatie te geven. Eenmaal opgeslagen, kan het bestand worden bewerkt in een spreadsheet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoewel deze technologie kan worden gebruikt om veranderingen in de glutamaterge signalering in vele soorten van dierlijke modellen, zoals traumatisch hersenletsel, veroudering, stress, en epilepsie te meten, hier laten we zien hoe de MEA technologie kan worden gebruikt om glutamatergic veranderingen in transgene muismodel onderzoeken menselijke tauopathie 19, 20. De RTG (TauP301L) 4510 muizen drukt de P301L-mutatie in tau geassocieerd met frontotemporale dementie en parkinsonisme gekoppeld aan chromosoom 17, en wordt vaak gebruikt om tau pathologie geassocieerd met de ziekte van Alzheimer, neurodegeneratieve tauopathieën en frontotemporale dementie bestuderen. We tonen ook aan dat de glutamaterge signalering kan worden gewijzigd door farmacologische interventie. We behandelden TauP301L muizen met riluzol een FDA-goedgekeurde disease modifying drug amyotrofe laterale sclerose (ALS) dat glutamaterge signalering moduleert door het stabiliseren van deinactiveren stand van spanningsafhankelijke natriumkanalen, wat leidt tot een afname van glutamaatafgifte en een versterking van glutamaat opname via een verhoging glutamaattransporter expressie, wat leidt tot verhoogde glutamaat speling 30, 31, 32, 33.
We hebben deze bijzondere dataset voor demonstratieve doeleinden gekozen om vier redenen. Ten eerste, deze dataset toont de temporele resolutie van het systeem, zoals blijkt uit ons vermogen om de snelle dynamiek van de tijdelijke vrijstelling en de opname van glutamaat te meten. Daarnaast is deze preklinisch diermodel vertoont veranderingen in tonic glutamaat, glutamaat afgifte en glutamaat speling, waardoor een voorbeeld van de wijzigingen van elke maatregel. Ten tweede, het gebruik van deze dataset, de hoge ruimtelijke resolutie die het mogelijk maakt voor het meten van subregio verschillen in de DG, CA3, eennd CA1 van de hippocampus is aangetoond. Ten derde zijn deze gegevens zorgt voor demonstratie van hoe farmacologische interventie kan worden gebruikt om glutamatergic veranderingen waargenomen in preklinische diermodellen te beperken. Tot slot, omdat dit preklinisch model heeft veranderingen in de afgifte van glutamaat, de noodzaak van een zorgvuldige interpretatie van glutamaat speling in de aanwezigheid van gewijzigde afgifte van glutamaat kan worden verklaard.
Na het bereiken van een stabiele basislijn, zoals aangegeven door <0,004 nA / min verandering in de helling (10-20 min), we eerst gemeten tonic glutamaat (uM) door het middelen extracellulair glutamaat niveaus gedurende 10 s voorafgaand aan de toepassing van oplossingen. We observeerden toegenomen tonic glutamaatniveaus in CA3 en CA1 regio TauP301L muizen en riluzole herstelde tonic glutamaat niveaus aan die van controles (figuur 3A). Vervolgens werd KCl lokaal geleverd (via een micropipet) aan elk van de drie sub-gebieden van een hemisphere elke 2-3 min. Na 10 reproduceerbare signalen die indicatief is voor een intact glutamaat neuronale systeem 34, worden de resultaten gemiddeld voor elke groep en de gemiddelde amplitude vergeleken. Representatieve sporen (Figuur 3B) toonde verhoogde glutamaatafgifte in TauP301L muizen na toediening van KCl in drie subgebieden (alleen CA3 wordt getoond), een effect dat werd gered door riluzole behandeling (Figuur 3C).
De MEA werd vervolgens verplaatst naar de andere hemisfeer en liet een stabiele basislijn bereikt (10-20 min) voordat exogeen glutamaat werd op glutamaat klaring (figuur 4) te onderzoeken. Uiteenlopende hoeveelheden (50-250 nL) van 200 pM steriel gefiltreerde glutamaatoplossing werden toegepast in de extracellulaire ruimte om de 2-3 minuten, en het netto oppervlak onder de curve (AUC) werd gebruikt als maat voor glutamaat opname. Deze snelle toepassing van glutamaat in thij extracellulaire ruimte maakt voor het nabootsen van endogene afgifte van glutamaat en meting van glutamaat opname. Omdat glutamaat transporters vertonen Michaelis-Menten kinetiek 35 verschillende volumes - is (50 250 nL) exogeen glutamaat geïnjecteerd verschillen in opname bloot. Hiertoe elk dier krijgt 1-2 injecties 50 nL stappen binnen de 50-250 nL traject. Hoewel men altijd moet bevestigen dat de geïnjecteerde volume per groep per regio niet statistisch verschillend bij p ≤ 0,05 niveau, de beste manier om de netto AUC waarborgen heeft betrekking op opname, en niet de hoeveelheid glutamaat toegepast of diffusie, is dat zowel amplitude (figuur 4A) en T stijging (een maat voor diffusie vanuit de puntbron (micropipet) het MEA in Figuur 4B) verschillen niet 10, 11, 19, 20. dit allows voor "peak matching" de amplitudes (Figuur 4C) zodanig dat verschillen in de netto AUC wordt verondersteld dat als gevolg van verschillen in opname en niet de toegepaste hoeveelheid of diffusie. Extra matching is vooral belangrijk bij dieren bestaande verschillen in glutamaat afgifte. Vanwege verschillende volumes geïnjecteerd, de variantie zowel amplitude en T opstookbegrenzing vaak grote en toevoegen van extra dieren heeft de variantie van deze maatregelen niet afnemen, omdat ze inherent aan het ontwerp. Omdat de amplitude en T aanleiding waren vergelijkbaar tussen de groepen in elk deelgebied (Figuur 4A, 4B), nemen we aan dat verschillen in netto AUC (Figuur 4C, 4D) zijn te wijten aan verschillen in glutamaat opname. Riluzol verbeterde glutamaat klaring in vergelijking met controles bij alle drie deelgebieden (Figuur 4D). Tot slot wordt een MEA met een bijgevoegd micropipet gebruikt om lokaal toepassen van een kleurstof MEA plaatsing na een hersen- bevestigen snijden, Zoals aangetoond in Figuur 3D.
Deze gegevens aan dat de MEA-technologie kan meten neurotransmitters in kleine subregio's van de hippocampus 24, 25, in tegenstelling tot eerdere technieken (bijvoorbeeld microdialyse), die alleen geregistreerd door grote monstergebieden en vaak beschadigd neuronale circuits 28, 29. Daarnaast is de MMO's geven ons hoge tijdsresolutie de snelle kinetiek van de afgifte van glutamaat en de klaring 25 te meten.
Figuur 1: In vitro kalibratie van een Self-verwijzingen micro-elektrode meten van de verandering in Current (PA) op een glutamaat oxidase Site (GluOx; red) vs. een Sentinel Site (Sent; blauw). De storende ascorbinezuur (AA 250 uM) en dopamine (DA: 2 uM) hadden de stroom bij zowel glutamaat oxidase of sentinel plaatsen niet wijzigen. Toevoeging van glutamaat (Glu: 20, 40, 60 uM) produceerde een stapsgewijze stroomtoename op glutamaat oxidase plaats, maar geen verandering van de schildwacht terrein. Waterstofperoxide (H 2 O 2: 8,8 uM) veroorzaakte een stijging stroom op beide sites. Gevoeligheid, helling, detectiegrens en R2-waarden werden berekend na kalibratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Een voorbeeld Elektrochemie werkblad. Dit werkblad kolommen met tijdstip van injectie of injectie nummer (TIME / TTL), hersenen coördinaten (AP, ml, DV),de hoeveelheid druk die wordt uitgeoefend (stikstof), de lengte van de druk (tijd) en het volume geïnjecteerd door de druk ejecteur. Notities, zoals oneven signalen of verstopping van de micropipet moeten worden geregistreerd in de kolom toelichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Extracellulaire tonicum en kaliumchloride (KCl) -evoked Afgifte van glutamaat in de DG, CA3 en CA1 regio van de hippocampus. (A) In de CA3 en CA1 regio van de hippocampus, tonic glutamaat niveaus waren significant verhoogd in met vehikel behandelde muizen TauP301L (Veh-TauP301L), een effect verzwakt door riluzole behandeling. (B) Baseline-aangepaste representatieve opnamen van KCl-opgewekte afgifte van glutamaat in het CA3 toonde r iluzole behandeling (Ril-TauP301L) verzwakte de sterke toename van de amplitude van glutamaat afgifte waargenomen bij Veh-TauP301L muizen. Lokale toepassing van KCl (↑) produceerde een sterke toename van extracellulair glutamaat die snel weer in tonische concentraties. (C) De sterk toegenomen KCl opgewekte glutamaat afgifte waargenomen bij Veh-TauP301L muizen in de DG, CA3 en CA1 na lokale toepassing van KCl werd verzwakt met riluzol behandeling. (D) Cresyl violet gekleurde 20 urn deel van hippocampus locatieactualisering toont van MEA tracks in CA3 en CA1 (gemiddelde ± SEM; ** p <0,01 versus controle-Veh Veh-TauP301L, # p <0,05 Ril-tau P301L vs. Veh-TauP301L, ## p <0,01 vs. Ril-TauP301L Veh-TauP301L; n = 14-19 / groep). Dit cijfer afgedrukt met toestemming van John Wiley and Sons 19, 20.rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. glutamaat opname aanleiding van exogeen glutamaat Toepassing in de DG, CA3 en CA1 regio van de hippocampus. (A) De amplitude van de plaatselijk aangebrachte glutamaat signaal vergelijkbaar in groepen in elk gebied. (B) T opkomst, een indicator van glutamaat diffusie vanuit de micropipet, vergelijkbaar in de groepen in elke regio. (C) Vertegenwoordiger glutamaat signalen in het CA3 van lokale afgifte van glutamaat in Veh-Controls, Veh-TauP301L en Ril-TauP301L muizen. (D) riluzole behandeling het aanzienlijke stijging van de netto oppervlak onder de curve (AUC) waargenomen bij Veh-TauP301L muizen in alle 3 gebieden van de hippocampus, wat aangeeft verbeterde glutamaat opname in riluzole behandelde TauP301L muizen (gemiddelde ± SEM, * p <0,05 versus controle-Veh Veh-TauP301L, ** p <0,01 versus controle-Veh Veh-TauP301L, # p <0,05 vs. Ril-TauP301L Veh- TauP301L, ## p <0,01 vs. Ril-TauP301L Veh-TauP301L; n = 13-15 / groep). Dit cijfer werd herdrukt met toestemming van John Wiley and Sons 20. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| 0,05 M PBS | 2 L DI water: |
| Store in glazen beker omwikkeld met aluminiumfolie. Breng pH tot 7,4 met KOH indien nodig. | NaH 2 PO 4 · H2O: 2,8 g Na2 HPO 4: 11,34 g natriumchloride: 11,68 g |
| 20 mM ascorbinezuur 50 ml DI water: | |
| Maak dagelijks vers. | Ascorbinezuur: 0,18 g |
| 20 mM L-glutamaat | 50 ml DI water: |
| Maak verse wekelijks. | L-glutamaat mononatriumzout hydraat: 0,15 g |
| 2 mM Dopamine | Dopamine hydrochloride: 0,038 g |
| Maak verse maandelijks. | 0,1 M perchloorzuur: Breng 10 ml volume op 100 ml met gedeïoniseerd water |
| 8,8 mM waterstofperoxide | 50 ml DI water: |
| Maak verse wekelijks. | Waterstofperoxide: 500 pL |
| 70 mM kaliumchloride | 100 ml DI water: |
| Maak verse dag van het experiment. | Kaliumchloride: 0,08 g Natriumchloride: 0,07 g calciumchloride: 0,004 g |
| 200 μ; M Glutamaat | 20 mM glutamaat: 100 gl |
| Maak verse dag van het experiment. | Steriele zoutoplossing: 10 mL |
Tabel 1: Calibration Solutions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De MEA techniek maakt het mogelijk voor het meten van een snelle kinetiek van neurotransmitters en opname in vitro en in vivo. Vandaar dat de technologie produceert een breed scala aan data-uitgang waaronder tonisch neurotransmitter niveaus, opgeroepen afgifte van neurotransmitters en neurotransmitter klaring. Echter, omdat het gebruik van MEA is een relatief complexe procedure, zijn er tal van factoren die mogelijk moeten worden geoptimaliseerd voor succesvol gebruik. Bijvoorbeeld, tijdens het ijken kan men op dat er geen signaal golfvormen (oscilloscoopscherm) of die respons op stimulatie minimaal of afwezig. Waarschijnlijk als gevolg van een storing in het systeem, het opnieuw opstarten van het opnamesysteem, of computer, kan het probleem op te lossen. Bovendien zou het probleem een verbinding fout. Vóór kalibreren is het relevant aan te controleren dat de MEA en de referentie-elektrode aansluitingen goed zijn aangesloten. De vervanging van de DIP-aansluiting op de headstage kunnen MEA-verbinding problemen op te lossen.Indien het MEA niet volledig in oplossing of slecht onderhouden referentie-elektrode wordt gebruikt, kunnen deze ook interfereren met de opname tijdens kalibratie. Vertraagde signaalreacties tijdens kalibratie ander veel voorkomend probleem, die kunnen voortvloeien uit een dikker dan nodig BSA / glutaaraldehyde mengsel of een langzaam draaiende roerder. Indien interfererende signaal geven tijdens kalibratie, is het mogelijk dat er een fout in galvanisch (bijvoorbeeld niet lang genoeg galvanisch) MPD uitsluiting laag. In dat geval herhalen de galvanische procedure noodzakelijk.
Tijdens de operatie, kan men verdoving niveau niet voldoende voor alle muizen; sommige muizen kan een hoger niveau van verdoving nodig hebben om "te gaan onder" en een aantal muizen kunnen minder zouden moeten betalen. Het is essentieel om te beginnen op een laag niveau van anesthesie en langzaam te verhogen totdat de muis is onder lichte narcose. Diepe anesthesie worden getest nadat de muis in het stereotaxische apparaat door eenstaart of teen knijpen. Bij het kiezen coördinaten voor het implanteren van de MEA is het ook belangrijk op te merken en te corrigeren voor mogelijke atrofie die kan optreden bij verschillende neurodegeneratieve diermodellen 36, 37, 38. Bovendien is het noodzakelijk dat tijdens de operatie bloed niet ophopen op de MEA, want dit kan invloed hebben op de opname eigenschappen van de MEA en levert nauwelijks tijdresolutie of sterk geminimaliseerd signaalreacties. Als bloedstolsels rond de elektrode, verwijder de MEA en spoel met zoutoplossing.
Tijdens het opnemen, een van de meest voorkomende problemen die kunnen optreden, is dat van een ruissignaal. Interferentie van andere elektronische apparaten, zoals hulpverlichting aanvullende instrumenten en boren zijn de meest waarschijnlijke daders, dus is het het beste om te voorkomen dat deze aan te brengen op dezelfde elektrische schakeling en / of uitlaat als registratiestelsel. Bovendien, als de opname sysTEM is niet goed geaard is, zal men observeren oscillaties op de oscilloscoop van het opnamesysteem evenals lawaai als gevolg van alle sites, en niet alleen de opname sites. De aanbevolen aardingsmat onder het registratiesysteem moet worden aangesloten op een geaarde leiding om deze problemen te voorkomen. Indien wordt vastgesteld dat geen van deze zijn de fout, kan de fout in de referentie-elektrode of de MEA zelf liggen. Indien u ze tegenkomt lawaai, met behulp van een nieuwe, ongebruikte MEA om de werking van het systeem te controleren kan een nuttige aanpak oplossen van problemen. Als het loskoppelen of de referentie-elektrode resultaten vervanging in weinig tot geen verandering, kan de referentie-elektrode of halfcel defect zijn. Veranderen van de referentie-elektrode kan de enige manier om het probleem op te lossen. Als de opname is voltooid, wordt een laatste voordeel van de MEA is de mogelijkheid om het reinigen en opnieuw hen. MMO's kunnen worden hergebruikt ongeveer drie keer zo lang als het MEA blijft adequaat uit te voeren tijdens de kalibratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GG is de enige eigenaar van Quanteon, LLC dat de FAST-16 registratiesysteem voor glutamaat metingen in dit onderzoek maakt. JEQ is een betaalde consultant voor Quanteon.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Alzheimer's Association (MNR; NIRG-12-242187), WVU Faculty Research Senaat Grant (MNR), en WVU PSCOR Grant (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
