Summary
여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.
Abstract
신경 전달 물질 중단은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 우울증, 불안의 기초가되는 병리의 역할을 주로 중추 신경계 (CNS) 질환의 주요 구성 요소입니다. 전통적으로, 미세 투석은이 질환에서 발생하는 신경 전달 물질의 변화를 검사하는 가장 일반적인 (찬양) 기술하고있다. 미세 투석은 조직의 넓은 영역에 걸쳐 천천히 1-20분 변화를 측정 할 수있는 능력을 가지고 있기 때문에, 그것은 잠재적으로 뇌와 느린 샘플링 기능 내에서 고유 연결을 파괴, 침입의 단점이있다. 비교적 새로운 기술은 미세 전극 배열 (MEA)가 그들이 발생하는 공간적 및 시간적 정확한 접근하게 이산 뇌 영역 내의 특정한 신경 전달 물질의 변화를 측정하기위한 많은 장점을 갖는다. 또한, MEA의를 사용하여 생체 내에서 신경 전달 물질의 변화의 측정을 허용 최소 침습적이다. 저희 연구실에서는, 우리는 헥타르알츠하이머 병의 병리와 관련된 신경 전달 물질 인 글루타메이트의 변화에 특별히 관심을했습니다. 따라서, 여기에 설명 된 방법은 알츠하이머 병의 유전자 변형 마우스 모델에서의 글루타메이트의 잠재적 인 해마 중단을 평가하기 위해 사용되었다. 간단히, 방법은 관심과 배경 잡음 및 간섭 물질을 뺄 자체 참조 사이트를 사용하는 신경 전달 물질에 매우 선택적 효소와 다중 사이트 미세 전극을 코팅 포함 사용. 도금 및 교정 한 후, MEA는 마이크로 피펫으로 구성 될 수 있고, 정위 장치를 이용하여 관심있는 뇌 영역으로 낮췄다. 여기서, 상기 방법은 RTG (TauP301L) 4510 마우스를 마취하고 정확하게 해마의 서브 영역 (DG, CA1 및 CA3)를 대상으로하는 정위 장치를 사용하는 것 설명.
Introduction
뇌의 신경 전달 물질의 변화를 측정하는 것은 종종 신경 전달 물질 조절 곤란을 특징으로 중추 신경계 (CNS) 질환을 연구 신경 과학자을위한 필수적인 도구입니다. 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC / EC)와 함께 미세 투석은 세포의 신경 전달 물질의 레벨 1, 2의 변화를 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 하였지만 3, 4, 미세 투석 프로브의 공간 및 시간 해상도는 신경 전달에 적합하지 않을 수도 이러한 단단히 외 공간 (5, 6)에 규정되는 글루타메이트 등. 때문에 유전 촬상 최근의 진보, 생체 내에서의 글루타메이트를 매핑하는 데 사용할 수있는 추가의 방법이있다. 유 전적으로 인코딩 된 글루타메이트 형광성 리포터를 사용하여 (iGluSnFR)를D 이광자 촬상 연구자들은 시험 관내 및 생체 7, 8, 9 모두 뉴런 및 성상으로의 글루타메이트 방출을 시각화 할 수있다. 특히,이보다 넓은 시야에서 기록이 가능하며 뇌의 고유 연결을 방해하지 않습니다. 이러한 새로운 광학 기술의 글루타메이트 반응 속도와 감각 유발 반응과 신경 활동의 측정 시각화 할 수 있지만, 그들은 분리 된 뇌 영역의 세포 외 공간에서의 글루타메이트의 양을 정량화 할 수있는 능력이 부족하다.
다른 방법은 선택적으로 자기 - 참조 기록 방식의 사용을 통해 이러한 세포 외 글루타메이트 신경 전달 물질의 수준을 측정 할 수있는 효소 - 결합 된 미세 배열 (MEA)이다. MEA를 기술은 외상성 뇌 다음 세포의 글루타메이트의 변화를 연구하는 데 사용되었습니다노화 부상 10, 11, 12, 13, 14, 스트레스 (15, 16), 간질 (17), (18), 알츠하이머 병 (19), (20), 및 바이러스 성 미믹 (21)의 주입은 미세 투석에 내재하는 공간 및 시간 제한에 비해 개선을 나타낸다. 미세 투석은 시냅스 (22,23) 근처에 측정 할 수있는 능력을 제한하는 반면, MEA의 세포 외 글루타메이트의 선택적 유출 대책 근처 24, 25 시냅스 허용하는 높은 공간 해상도를 가지고있다. 둘째, 미세 투석 낮은 시간 해상도 (1 - 20 분)을 조사 할 수있는 능력을 제한범위 제 26 밀리 초에서 발생 글루타메이트 방출 및 클리어런스의 신속한 역학. 글루타메이트의 방출 또는 간극의 차이 글루타메이트 농도 쉬고 토닉의 측정에서 분명하지 않을 수도 있기 때문에 글루타메이트 방출 및 클리어런스를 직접 측정하는 것이 필수적 일 수있다. MEA를 인해 높은 시간 분해능 (Hz의 2)의 검출 하한 (<1 μM)에 조치 허용한다. 셋째, MEA를는 래트 나 마우스 해마 같은 특정 뇌 영역 내에서 신경 전달 물질의 소 변형 검사 허용한다. 예를 들어, 세포 외 글루타메이트의 소 차이를 조사하기 위해, 우리는 별도로 치아 이랑 (DG)와, trisynaptic 회로 (27)를 통해 연결되어 해마의 cornu의 ammonis 3 (CA3)와 cornu ammonis 1 (CA1)를 타겟팅 할 수있는 MEA를을 사용. 주입 28 <기인 - (4 mm 길이 1) 및 손상으로 인해 미세 투석 프로브의 크기/ SUP>, 29, 소 지역적 차이는 해결하기 어렵다. 또한, 광학 시스템은 예컨대 자극 소 7을 허용하지 않는 수염 자극 또는 광 플리커 등의 외부 자극을 통해 자극을 허용한다. 다른 방법을 통해 다자간 환경의 최종 이익은 외적인 연결을 방해하지 않고 생체 내에서 이러한 하위 영역을 연구 할 수있는 기능입니다.
여기서는 세라믹 기반 다중 미세 이루어지는 MEA를 함께 결합하는 기록 시스템 (예 FAST16mkIII)는, 차분 검출 및 분석 신호로부터 제거 될 에이전트의 간섭을 허용하는 기록 위치에 도포 할 수있는 방법을 설명한다. 우리는 이러한 배열을 기초 amperometry-DG, CA3 내의 생체 글루타메이트 규제 연구 및 마취 RTG의 해마 CA1의 하위 영역에 사용할 수있는 증명 (TauP301L) 4510 마우스, 일반적으로 사용되는 m알츠하이머 병의 여러개 모델. 또, 릴루 졸과 쥐를 치료함으로써 글루타메이트 방출 및 클리어런스의 빠른 동역학에 MEA 시스템의 감도의 확인을 제공 시험관에 나타내는 약물 글루타메이트 방출을 감소시키고 글루타메이트 흡수 30, 31, 32, 33을 증가시키기 그리고 TauP301L 마우스 모델에서 생체 내에서 이러한 각각의 변화를 보여주는.
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Protocol
1. 효소 또는 매트릭스 층과 미세 전극 배열을 코팅
- 단백질 기질 용액을 제조
- 소 혈청 알부민 (BSA) 10 ㎎을 칭량하여 1.5 mL로의 마이크로 원심 튜브로 옮긴다.
- BSA를 포함하는 microcentrifuge 관에 DI 물 985 μL를 추가합니다. (BSA에 용해 될 때까지 1000 μL 피펫 ~ 3 회 피펫 팅하여 재) 수동 교반 용액을 혼합한다.
참고 : 용액에 공기를 도입 할 수있다 이렇게 같은 솔루션을 혼합하는 소용돌이를 사용하지 마십시오. 또한, 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 양 <1000 μL (예를 들어, 700 μL)에 피펫을 설정. 필요한 경우, 용액을 미세 원심 분리에 배치 될 수있다. - BSA에 용액이 용해되면, 25 % 글루 타르 알데히드 용액 5 μL를 추가한다. 5 번 - 밀폐 튜브 3을 반전시켜 용액을 혼합한다. 생성 된 용액을 0.125 % 글루 타르 알데히드로 1 % BSA이다.
- 단백질 매트릭스 SOLU을 따로5 분 기. 이 솔루션은 색상에 밝은 노란색으로 표시됩니다.
- 원하는 효소 용액을 제조하는 (예를 들어, 글루타메이트 산화 효소)
- 동결 건조 여과 DI 물을 추가하여 글루타메이트 산화 효소 용액을 제조, 정제 된 효소 (예, 50 μL DI 물, 0.5 U / μL를 수득 글루타메이트 산화 효소 25 개 단위 첨가).
참고 나누어 원액 (예를 들면, 1 μL) 및 -20 ° C에서 적절한 크기의 용기 (예를 들어, 500 μL의 마이크로 원심 튜브)의 분취 량을 저장한다. 분액 이러한 조건에서 최대 6 개월 동안 저장 될 수있다. - 글루타메이트 산화 효소를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 분취 BSA / 글루 타르 알데히드 용액 4 μL를 추가한다. 수동 교반하여 혼합 용액 (10 μL 피펫을 피펫 재. 피펫 체적 <5 μL로 설정한다). 생성 된 용액을 1 % BSA, 0.125 % 글루 타르 알데히드, 0.1 U / μL 글루타메이트 산화 효소이다.바로 코팅의 솔루션을 사용합니다.
참고 글루타메이트 산화 효소 코팅 용액을 15 분 내에서 사용될 수있다. 몇몇 MEA의 제조가 하나의 용액으로 코팅 될 수 있지만, 글루타메이트 산화 효소에 대한 가능한 시간 윈도우를 초과하지 않을 것을 권장. 15 분 이내에 코팅 될 수있다 전극의 수는 다양하다. 일반적으로, 4-6 전극 동시에 코팅 될 수있다.
- 동결 건조 여과 DI 물을 추가하여 글루타메이트 산화 효소 용액을 제조, 정제 된 효소 (예, 50 μL DI 물, 0.5 U / μL를 수득 글루타메이트 산화 효소 25 개 단위 첨가).
- MEA를 코팅
- 일반적으로, 피막 기록 원하는 효소 (글루타민산 옥시다아제)와 MEA의 사이트 (들)의 기록 위치 (들) ( '센티넬'사이트 (S))의 다른 쌍의 쌍은 비활성 단백질 매트릭스로 피복된다.
- L 글루타민산 옥시다아제 또는 비활성 단백질 기질 용액 (BSA + 글루 타르 알데히드)과 MEA를 코트에 무딘 팁 microsyringes 해밀턴 (예를 들어, 10 μL)를 사용한다. 효소 또는 비 단백질 기질 코팅에 사용되는 절차는 동일하다.
- 사용 전후에 주사기를 청소 (3 헹굼과DI 물 린스 (3) 메탄올, DI 물 린스 (5)).
주 : 전용 주사기 효소 (글루타메이트 산화 효소) 또는 단백질 기질의 코팅 적용에 사용된다. 다른 솔루션을 같은 주사기를 사용하지 마십시오. 효소 코팅 전에 단백질 매트릭스 코팅을 수행하는 것이 좋습니다. - 10 μL 해밀턴 주사기를 이용하여 글루타메이트 산화 효소 또는 단백질 매트릭스를 그린다. 천천히 (해부 현미경을 사용하여 시각) 주사기 팁에서 용액의 작은 비드를 분배하도록 상기 플런저를 누른다.
- 해부 현미경을 사용하여 상기 MEA 기록 표적 부위 간단히 하나 개의 층을 나타내는 용액 방울 / 비드와 기록 위치를 접촉시킴으로써 적절한 기록 부위에 용액을 적용한다. 세 개의 층들은 매트릭스 단백질 및 효소 코팅 모두 충분하다. 두꺼운 층은 MEA의 감도를 줄일 수 있습니다.
- 똑바로 솔루션 방울을 올리고 녹음 사이트 오프 (즉, syrinGE의 팁)는 MEA의 표면을 가로 질러 긁어해서는 안됩니다.
- 1 분 타이머를 설정합니다. 이것은 기록 사이트 (들) 코팅 응용 프로그램 사이의 최소 시간 요구 사항입니다. 효소 코팅 MEA를 5-7 일 동안 39 ° C에서 경화 할 수있다.
- 이 실험실 노트북에 코팅, 전극 번호, 이름과 날짜를 적용하는 데 걸린 시간을 적용 코트의 수를 기록한다.
향상된 선택성 m- 페닐 렌 2. 전기 도금
- 준비 m 페닐 렌 디아민 디 히드로 클로라이드 (MPD) 용액
참고하여, 다른 잠재적으로 간섭 물질 분자를 통해 글루타메이트 / H 2 O 2에 대한 센서의 선택성을 향상 도파민 및 다른 대형, 간섭 물질의 분자 (예, 아스코르브 산)의 산화를 방지하기 위해 배제 층 MPD를 접시.- 부피 플라스크에 0.05 M 인산 완충 용액 50 ㎖ (PBS)를 측정하여 0.05 ~ 50 ㎖를 전송할더 큰 (150 mL)을 삼각 플라스크에 M PBS.
- 질소 탱크 (예를 들면, 튜빙을 사용하여 압력 이젝터 연결됨)에 접속 된 튜브를 사용하여 튜브의 개방 단부에 피펫 팁 (예 : P200 팁)을 부착. PBS 용액에서 연결된 피펫 팁 튜브를 삽입하고 파라 필름으로 느슨하게 용액을 커버. 20 분 동안 질소 버블 부드럽게 용액 켜기.
- MPD의 0.045 g의 무게를.
주의 : MPD는 잠재적으로 발암 물질이다. MPD의 계량하여 흄 후드 내에 포함 된 스케일을 사용하여 수행되어야한다. MPD를 사용할 때 장갑과 마스크를 착용하십시오. 후드가 작동 확인하고 띠는 적절한 작업 수준으로 끌어된다. MPD 오염되었을 수 즉시 깨끗한 표면 영구 오염을 방지한다. - 버블 링 한 후, 탈 가스를 발산 PBS 용액에 MPD를 모두 전송할 수 있습니다. 파라 필름 및 솔루션에 MPD를 해산하기 위해 부드럽게 소용돌이 솔루션 플라스크 개방을 커버. aggressiv 피전자 혼합 또는 용액에 가스를 도입 할 수있다 이렇게 같은 소용돌이의 사용.
- 50ml의 비이커에 용액을 옮긴다. 저어 줄 필요가 없습니다.
- 전극을 전기 도금
- 기준 전극을 구하는. MPD는 도금 전용 참조 전극을 사용합니다. 교정 절차에 대한 다른 기준 전극을 사용한다.
- 비커 위에 기준 전극 홀더의 플라스틱의 위치를 아암. 유리 기준 전극 기포 확인 (볼 수 없을 수도있다). 부드럽게 선단에 공기 방울을 제거하기 위해 상기 기준 전극의 선단을 가볍게.
- PBS를 함유하는 비이커에 플라스틱 아암 및 하부 개구를 통해 상기 기준 전극을 배치. 기준 전극은 비커의 바닥에 접촉하지 않도록하십시오.
- 접합체는 MPD 판으로 (예를 들면 DIP 커넥터)를 headstage (예 2 PA / mV의)에 기준 전극을 연결 및 연결headstage에 D.
- 오직 MEA 팁이 용액에 침지되도록 비이커의 용액에 MEA를 낮춘다. 검은 '거품'(MEA를 끝 위에있는 검은 색 절연) 이상 액체의 MEA 팁 잠수함하지 마십시오. 이렇게하면 MEA가 손상 될 수 있습니다.
- 전극 채널과 headstage 연결 기능을 확인하기 위해 '검사'교정을 실행.
참고 : 하드웨어 설정, 사용되는 장비를 반영해야하지만 분석 / 간섭 물질 종류와 농도에 관한 자세한 사항은 '시험'교정 입력 할 필요가 없습니다. 레코딩 모드 'Amperometry'이어야하고는 'V-인가'-0.7 V. 모든 채널에 대한 일반 녹화를 확인해야한다. - 모든 기록 사이트의 연결이 확인 될 때 '취소'를 선택 취소합니다. 이 교정 데이터를 저장 할 필요가 없습니다.
- 바탕 화면에있는 "전기 도금"아이콘을 선택합니다. 전기 도금으로OL 메뉴가 나타납니다. 올바른 설정이 입력되어 있는지 확인 :
PP 진폭 : 0.25
오프셋 : -0.5
주파수 : 0.05
시간 (분) 20 - 도금을 시작하기 위해 '일시 정지'버튼을 선택합니다. 경과 시간 필드는 카운트 다운을 시작해야한다.
- 완료 (모든 시간이 경과)시, 선택 팝업 메뉴에서 '다른 MEA는'MPD가 추가 MEA 도금 시작합니다. MEA를 가진 도금 된 MEA는 MPD 도금되는 교체하고 전기 도구를 사용하여 전기 도금 절차를 반복합니다.
참고 : 더 이상 2 배 이하 또는 1 시간의 시간 내에 준비된 MPD 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 2 개 이상의 다자간 환경을 준비하는 신선한 솔루션을 준비합니다. - 전기 도금을 완료하는 '출구 소프트웨어'를 선택합니다. 교정 전에 DI 물 (염 찌꺼기를 방지하기 위해) 및 저장소 (24 시간)과 MPD 도금 전극 팁을 헹군다.
- 용액으로부터 기준 전극을 제거하고 적절한들에 배치하기 전에 DI 물 린스torage 용액 (예, 3 M 염화나트륨). 기준 전극 팁이 액 침수 확인. 용액에 천천히 하부 유리 기준 전극은 유리의 손상을 방지한다.
- 적절하게 레이블 유해 폐기물 용기의 MPD 솔루션을 폐기하십시오.
3. 글루타메이트 검색 및 선택도에 대한 보정 MEA (도 1) 21
- 교정에 필요한 솔루션을 준비.
참고 : 표 1을 참조하십시오. - 일정한 교반 보정을 37 ° C에서 (자성 배터리 교반기를 작동). 상기 가열 패드를 켜거나 수조 순환 작은 교반 막대를 얻었다. 천천히 그러나 또한 (아래) 만들어 질 때, 새로운 고원 빠르게 도달 할 것을 충분히 빨리 저어.
- 기록 제어 시스템에 headstage (2 PA / mV의)을 연결하고 교반 0.05 M PBS 40 ㎖ (50 비이커를 사용)으로 MEA 팁을 삽입한다.
- 는 R 연결설 명 전극. 기포가 없는지 확인하기 위해 끝을 톡.
- 녹화 프로그램을 열고 "교정"을 클릭합니다. 설정이 (확인이 감시 사이트가 다른 전극을 변경할 수도로 선택된다), MEA 번호를 눌러 "시작"을 선택 올바른지 확인하십시오.
- ; 평형 10 분 - 5 허용 기준은 (<0.004 북미 / 분으로 변경) 안정화 된 후에 시작된다.
- "기준"을 선택하고 500 μL 20 mM의 아스코르브 산 (간섭 물질을, 최종 [250 μM])에 추가 전류가 새로운 정상 고원 도달하면 및 "간섭 물질"을 선택하는 경우, (AA은 뇌 전체 간섭 물질로 간주된다) 어떤. 추가간에 1 분 - 0.5 허용. MEA를가 제대로 전기 도금하는 경우, 거의 변화가 관찰 될 수 없습니다.
- 20 밀리미터 L 글루타메이트 (최종 [20 μM])의 40 μL를 추가하고 현재 일단 새로운 정상 고원 마크 1 차 또한 "분석 물"에 도달하고있다. 3 glutamat 총 세 번 반복전자 추가.
- 40 μL DA를 추가합니다. "분석 물"을 선택하지 마십시오; "피검 물질"을 선택 - DA 만 DA를 포함하는 영역에서의 간섭 물질 일 수있다.
- 40 μL 과산화수소를 추가합니다. "분석 물"을 선택하지 마십시오; "시험 물질"을 선택합니다.
- 교정이 완료되면 "정지"버튼을 클릭합니다.
- 접합체의 기능을 확인하려면 계산 탭을 클릭하고 실험실 노트북에서 다음 매개 변수를 기록합니다.
- 이러한 보정에 사용 된 MEA 디자인 (3000 μm의 2)의 경우, ≥ 0.004 북미 / μM의 기울기와 MEA를 사용하지만 낮은 슬로프 특정 실험에 사용될 수있다. 효소 코팅 및 코팅되지 않은 부위 사이의 기울기가 10 %의 차이가보다 작은 경우, 또는 단지 깨끗 /를 MEA 폐기 유발이 MEA의 릴리스를 사용한다.
- 1.5 μM ≤ 탐지 (LOD)의 한계를 사용합니다. LOD를 1.5 μM보다 큰 경우, 다음 유발 업데이트 버전에 대한 이러한 다자간 환경을 사용하여전자 만 통풍 관. 토닉 수준을 기록 이러한 전극을 사용하지 마십시오.
- > 20 개 임의 단위의 간섭 물질 위에 원하는 분석 물 (예, 글루탐산)에 대한 선택성을 사용한다. 선택 후 깨끗하고, 20 미만이면 / MEA를 폐기합니다.
- ≥ 0.90 검량선의 직선 성 (R 2)를 사용한다. 선형성 미만 0.90, 다음 청소하거나 MEA를 폐기 인 경우.
- MEA를, 날짜의 #을 사용하여 파일을 저장하고 사람 교정의 이니셜.
4. 마이크로 피펫을 조립
주 : 마이크로 피펫 (모세관 유리) (10)의 내경과 선단을 가져야한다 - 15 μm의.
- 네 백금 기록 위치 사이 중앙에 마이크로 피펫을두고 접착 왁스를 사용하여 점토 모델링 상기 MEA 50-100 μm의 마운트.
- 마이크로 피펫을로드하기 위해, 또는 글루타메이트의 KCl 용액, 0.22 ㎛의 멸균 주사기 filte로 채워진 1 mL를 주사기를 사용하여R 및 97 맹 롱, 28 게이지 피펫 필러, 마이크로 피펫 백필. 즉, 기포가 없는지 확인하고, 마이크로 피펫의 상단에 바늘을 삽입하고 마이크로 피펫 (MEA를 향해 말)의 하단에 입력합니다.
- 약 1 초 동안 20 psi의 - (2)에서의 압력 토출 시스템에 마이크로 피펫을 첨부.
5. 접시에 생체 내 사용을위한 소형 참조 전극
- 욕 전극 ()을 100 ㎖의 비커 (도금 욕에서 50g의 NaCl / 90 mL의 1 M 염산) 도금액을 준비하고 절단 (~ 백금 10cm 길이 (PT) 와이어 (~ 0.02 "직경)).
- (0.008 "베어) 테프론 코팅은 와이어의 길이 15cm 조각은 와이어의 단부의 각각의 단부로부터 테플론 코팅 ~ 1cm를 긁어 면도날을 사용하여 - 10를 자른다.
- 일단에 골드 핀을 땜납 도금 욕에 노출은 와이어의 일단을 배치했다.
- (~ 9의 출력을 갖는 만 DC 어댑터를 사용한다. - 15 VDC 최대)는 DC 어댑터를 사용하여,금 핀 측 준비된 은선 (기준 전극)까지 "레드"(+) 와이어 클램프. (-) 백금 목욕 캐소드 와이어 "블랙"을 조인다.
- 직류 어댑터를 연결합니다. 올바른 도금 공정을 찾아 - 거품 목욕 전극에 나타납니다; 참조 전극은은 / 회색 변.
주의 : 리드를 전환하지 마십시오 [블랙 (-) 적색 (+) 대] -이 발생하고 신선한 도금액은 할 필요가있는 경우 목욕을 도금하는 것은 엉망이 될 것입니다. 나쁜 솔루션은 컬러로 노란색으로 바뀝니다 : 사용하지 마십시오!
주 : 도금 반응은 일반적으로 2-5 분 소요 : 0의 Ag + CL은 - → AgCl을 + E - - 기준 전극을 테스트한다.
- 200 mV의 DC 설정 - 100에 멀티 미터를 설정합니다.
- 새롭게 도금 기준 전극에 대하여 참조 3 M 염화나트륨의 전극 및 테스트 (즉, 작동하는 이전 검사 전극 인) 벤치 마크를 놓는다.
참고 : 우리의 경우새로운 기준 전극을 보내고, (12 시간 권장) 사용하기 전에 3 M NaCl을 담근다. - 상기 기준 전극의 금 핀의 "레드"(+) 리드를 놓고 테스트 할. (-) 기준 전극에 우세 "블랙"을 놓습니다. 허용 가능한 판독 범위는 ± 10mV로된다. 0 mV의 2 개는 기준 전극에 걸쳐 이상적이다.
MEA 녹음 6. 일반 동물 수술
- 수술 준비
- 전날 밤 살균제 수술 도구를 놓습니다.
- 살균제에서 도구를 제거하고 완전히 씻어 멸균 수술 패드에 도구를 배치합니다. 가열 패드를 구합니다.
- 두 전극 보정 절차 3 및 4에 기재된 바와 같이 마이크로 피펫을 첨부.
- 제 5 항에 기재된 바와 같이 기준 전극을 만든다.
- 200 μM 글루타메이트 70 밀리미터의 KCl을 확인합니다. 표 1을 참조.
- 동물을 얻기 및 수술 시트에 무게를 기록한다.
- 마취를 준비하고, 가열 패드를 켜.
- MEA 수술을 수행
- 호흡 속도가 현저하게 감소하고 동물 발가락 또는 테일 핀치에 응답하지 않을 때까지 이소 플루 란 (4 %의 산소 흐름)를 사용하여 유도 챔버에 동물을 마취. 기록 호흡 속도 및 체온을 15 분마다.
- 머리를 안정 귀 막대를 사용하여 정위 장치에서 동물을 놓습니다. 동물이 안전하고 머리가 움직이지 않도록하십시오. 산소 3 % - 1.5로 이소 플루 란 흐름을 낮춘다. 상기 가열 패드가 제대로 동물 아래에 위치와 보조 열을 제공하기 위해 37 ℃로 설정되어 있는지 확인. 추가 열을 제공하지 않으면 심각한 저체온증과 동물의 조기 사망을 초래할 수 있습니다.
- 멸균면 주걱을 사용하여 눈 연고를 적용하고 호흡 수를 기록하고체온. 배터리 구동 트리머를 사용하여 머리의 정상을 면도. 귀 근처에 털을 제거하는 작은 수술 가위를 사용합니다.
- 이 시점에서, 멸균 수술 장갑을 넣어. 두피에 알코올 다음 요오드 (세 번)를 적용합니다.
- 메스를 사용하여, 바로 두피의 중간 아래 절개를하고 황소 개 클램프를 사용하여 피부를 확산. 어떤 피를 흡수하기 위해 멸균면 팁을 가져 가라. 브레 그마 및 람다의 모양을 촉진하기 위해 과산화수소를 사용합니다.
- 헤드 적절히 D / V 및 브레 그마 및 람다의 M / L의 좌표를 측정하여 위치하는 것을 확인한다. 머리가 평면에있는 경우 좌표 변화는 0이어야합니다. 평평한면을 보장하기 위해 필요에 따라 머리와 귀 막대를 조정합니다.
- 브레 그마을 찾아 좌표를 제로. 원하는 좌표를 이용하여 좌우로 이동 영구 마커를 이용하여 표시를 만든다. cauterizer / 마커를 사용하여의에 도달 할 수있는 충분한 공간과 마크 주위에 큰 사각형을원하는 영역.
- 멸균 회전 도구를 사용하여 사각형 마크 주위에 드릴. 멸균면 주걱을 사용하는 모든 혈액을 만끽. 철저하게 각 사용에 드릴 비트 전에 소독.
- headstage에 MEA를 장착하고 제 1 희망 용액을 피펫 백필. 추방되는 솔루션을 검토 할 수 있도록 솔루션없이 피펫의 간격을두고해야합니다. 유리 마이크로 피펫에 튜브를 연결합니다.
- 질소 탱크 압력 이젝터 (PSI = 5 시간 = 0.6 S)를 켜고. 피펫을 보장하기 위해 테스트 (보도 수동 빨간색 버튼)을 시작하기 전에 막힌되지 않습니다.
- 마이크로 피펫을 보정합니다. 레티클에 0에서 시작하고 시작 지점을 표시하기 위해 headstage에 파란색 테이프의 조각을 놓습니다. 디지털 독자를 켜고 0으로 재설정합니다. 아래 1mm (DV)으로 이동하고, 용액 레티클상의 이동 틱 수를 카운트. 10 틱 1mm (1mm = 250 거리 nL)이므로 1 틱 거리 nL = 25와 동일해야한다.
- A의 기준 전극을 배치그 회로를 완성하는 뇌와 기액 접촉 여전히되도록 MEA로부터 원격지.
- 첨부 된 MEA와 브레 그마 찾기 및 디지털 리더를 제로. 원하는 좌표에 MEA를 이동합니다. 끝이 뇌에 닿을 때까지 천천히 MEA를 내립니다. 제로 DV 좌표 천천히 뇌에 MEA를 내립니다.
- 녹화 프로그램에서 원하는 보정 전극을 클릭 한 다음 "실험을 수행합니다." 동물을 마취하는 동안 시스템은 관심의 분석을위한 토닉 수준을 기록하기 시작합니다.
- 45 분 - 기준선을 관찰하는데 도움 20의 기준에 전극을 허용 축에 확대.
- 기준선이 안정되면, 0.6의 5 psi의 압력에 이젝터를 설정하는 토출 압력 이젝터 적색 버튼을 누른다. 사출 시트 (도 2)의 이동 시간 및 압력뿐만 아니라 볼륨 / 눈금을 기록한다. 즉, (필요한 메모를 작성,큰 피크, 희석 효과 막힌 피펫, 잡음베이스 라인 / O 범위 내).
- 주사 사이에서 5 분 - 글루타메이트 주사제 3 기다린다. 주사 사이의 2 분 - KCl을 주사제 1 기다린다. 동일한 압력 및 시간을 3 배 이상을 사용하여 주입한다. 시간을 변경하고 반복합니다. 마이크로 피펫가 막힌 않는 압력을 변경하지 않도록하십시오.
- 마이크로 피펫가 막힌 경우 30 PSI에 압력을 증가시킨다.
- 바람직한 뇌 영역에서 기록 상이한 용액을 사용하여 뇌의 양측에 반복. 20 분 동안 각각의 새로운 영역에 기준을 기록한다.
- 첨부 마이크로 피펫과 MEA를 타고 DI의 물로 씻어 모든 혈액이 사라 때까지 하룻밤 PBS에 담가.
- 동물을 안락사와 -80 ° C의 냉동고에 미리 표시 튜브 및 저장소에 뇌를 저장하거나 고정을 위해 한쪽을 유지한다. 이소 플루 란 (흡입)와 동물, 과다 복용을 안락사합니다. 수술 가위를 사용하여 참수를 수행하고 원하는 지역을 해부.
7. 청소 코팅 MEA의 후 사용
- 청소하지 MEA를 사용하지 않는 경우 마십시오. 보풀이나 먼지 표면 메탄올로 깨끗하고 코팅하기 전에 24 시간 동안 건조하자가있는 경우.
- 수조 (80 ° C)를 켜고 30 분 동안 MEA의 팁 소크. 정중면과 전극 팁은 전극 팁에 남아있을 수있는 임의의 부스러기를 제거하기 위해 도포 스쳐 와이프. 젖은 MEA의 블랙 "절연 부분을"하지 마세요.
- 세 가지 sonicators을 사용하여, 5 분간 (1) Citrisolv 상업 용매 제거 및 제 (2) 이소 프로필의 MEA의 팁 (3) DI 물 소크. 조심면과 전극 팁은 전극 팁에 남아있을 수있는 임의의 부스러기를 제거하기 위해 도포 스쳐 와이프.
- 레이어가 성공적으로 제거 된 보장하기 위해 해부 현미경 팁을 검사합니다.
8. 분석
- 데이터를 분석하려면,먼저 완성 된 실험을 두 번 클릭하고 파일 드롭 다운 메뉴에서 "데이터 내보내기"를 선택하여 원하는 실험을 내보낼 수 있습니다.
- 원하는 파일 위치에 데이터를 저장하고 분석 프로그램을 엽니 다. 분석 프로그램에서 "열기"를 클릭하고 최근에 저장된 파일을 선택합니다.
- 프로그램에게 파일을 업로드 한 후 이벤트 마커 탭에서 실험을 확인하기 위해 약간의 시간을주십시오. 출력에서 원하는 매개 변수의 확인란을 선택합니다. 예를 들어, 기준 진폭 (곡선 아래 영역)의 피크 면적 T 상승 및 T 80.
- 새로 고침을 클릭 한 다음 (몇 분 정도 걸릴 수 있습니다) 스프레드 시트로 데이터를 내보낼 분석합니다. 이 프로그램은 원하는 위치에 파일을 저장하라는 메시지 줄 것이다. 저장되면, 파일은 스프레드 시트에서 편집 할 수 있습니다.
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Representative Results
이 기술은 같은 외상성 뇌 손상, 노화, 스트레스, 그리고 간질 동물 모델의 많은 종류의 신호 글루타메이트의 변화를 측정 할 수 있지만, 여기에 우리는 MEA 기술은 유전자 변형 마우스 모델에서 글루타메이트의 변화를 검사하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다 인간 타우 병증 (19), (20). RTG를 (TauP301L)는 4510 마우스 염색체 17에 연결 측두엽 치매 및 파킨슨 병에 관련된 타우에서 P301L 돌연변이를 표현하고, 일반적으로 알츠하이머 병, 퇴행성 신경 퇴행성 신경과 측두엽 치매와 관련된 타우 병리학을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 또한 글루타메이트 신호는 약리 개입에 의해 수정 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 릴루 졸과 TauP301L 마우스를 처리, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)에 대한 FDA의 승인을 질병 변경 약물의 안정화에 의해 글루타메이트 신호를 변조하는증가 글루타메이트 클리어런스 30, 31, 32, 33로 이어지는 글루타메이트 방출의 감소 및 글루타메이트 수송 발현의 증가를 통한 글루타메이트 흡수를 증강 선도, 전압 게이트 된 나트륨 채널의 상태를 비활성화.
우리는 네 가지 이유 실증 목적이 특정 데이터 세트를 선택했습니다. 첫째,이 데이터 집합은 과도 릴리스와의 글루타메이트의 흡수의 빠른 역학을 측정 할 수있는 우리의 능력에 의해 도시 된 바와 같이, 시스템의 시간 분해능을 보여줍니다. 또한,이 전임상 동물 모델은 각 측정치의 변화의 일례를 허용 토닉 글루타메이트, 글루타메이트 방출 및 글루타메이트 클리어런스에 변화를 나타낸다. 둘째,이 데이터 세트는 DG, CA3, A의 하위 영역의 차이를 측정 가능하게 높은 공간 해상도를 이용하는ND 해마 CA1이 설명된다. 셋째,이 데이터는 전임상 동물 모델에서 관찰 글루타메이트 변화를 완화하는 방법을 약리학 적 개입의 데모 수 있습니다. 이 전임상 모델은 글루타민산 릴리스의 변경이 있기 때문에 마지막으로, 변경의 글루타메이트 방출의 존재 글루타민산 통관주의 해석의 필요성을 설명 할 수있다.
<0.004 북미 / 경사의 최소 변화에 의해 나타낸 바와 같이, 안정된 기준에 도달 한 후, (10 - 20 분), 우리는 제 10의 이전에 용액의 모든 애플리케이션을 통해 세포 외 글루타메이트의 농도를 평균함으로써 토닉 글루타메이트 농도 (μM)를 측정. 우리 TauP301L 마우스의 CA1과 CA3 영역에 토닉 글루타메이트 농도를 증가 관찰 및 릴루 졸 컨트롤 (도 3A)의 그것 토닉 글루타메이트 농도를 회복. 다음에, 하나의 KCl 로컬 hemisph의 세 개의 하위 영역의 각 행 (마이크로 피펫을 통해) 전달 된3 분 - 2 매를 감수. 온전한 글루타메이트 신경 시스템 (34)을 나타내는 10 개 재현 신호 후 그 결과를 비교하여, 각 그룹의 평균 진폭을 평균 하였다. 주제 트레이스 (도 3b), 릴루 졸 처리 (도 3c)에 의해 구조 된 효과 (CA3 만 표시) 세 개의 하위 영역에서 애플리케이션의 KCl 다음 TauP301L 마우스에서 글루타메이트 방출을 증가 밝혀.
접합체는 반대쪽 반구 이동 안정된 기준선에 도달시켰다 - 외인성 글루타메이트가 글루타메이트 간극 (도 4) 검사에 적용되기 전에 (10-20 분). 가변 볼륨 글루타메이트 흡수 계수로서 사용 된 곡선 (AUC) 아래의 3 분 및 순 면적 - - 200 μM 멸균 여과 글루타메이트 용액 (50 250 거리 nL)의 세포 외 공간에 매 2를 적용 하였다. t에 글루탐산이 신속한 응용 프로그램그는 세포 외 공간은 내생의 글루타메이트 방출 및 글루탐산 흡수 측정의 흉내 수 있습니다. 글루타메이트 수송 전시 미카엘리스 - 멘텐 35 동력학 때문에 볼륨의 범위 - 외인성 글루타메이트 (50 거리 nL 250)의 흡수 차이를 노출 시키도록 주입된다. 내셔널 범위 250 - 50 50 개 내 내셔널 단위에서 2 주사 -이를 위해, 각각의 동물은 1를 수신한다. 한 지역 당 그룹당 주입 볼륨이 통풍 관 관련이 0.05 수준, 순 AUC를 확인하는 가장 좋은 방법 ≤는 P에서 통계적으로 다르지 않다, 그리고 글루탐산하지 양이 적용되거나 확산 확인 항상해야하지만, 다음 사항을 확인하는 것입니다 모두의 진폭 (도 4a) 및 T 상승 (도 4b의 MEA에 점 광원 (마이크로 피펫)에서 확산 계수)가 10, 11, 19, 20 다르지 않다. 이여보세요WS 순 AUC 차이 인해 도포량이나 확산에 흡수되지 차이로 간주되도록, "피크 매칭"진폭 (도 4C)에 대한. 동물의 글루타메이트 방출에서 기존의 차이가있을 때 피크 매칭은 특히 중요하다. 볼륨의 범위가 주입되기 때문에, 진폭 및 T 모두 상승에 대한 편차는 종종 큰 그들이 설계에 고유 한, 이러한 방법에 대한 편차를 감소시키지 않는 추가의 동물을 추가한다. 진폭 및 T 상승 각 서브 영역 (도 4A, 4B)에서 그룹간에 차이가 없었다 때문에, 순 AUC (도 4C, 4D)의 차이 글루타메이트 흡수의 차이에 기인한다고 가정한다. 릴루 졸은 세 개의 하위 영역 (도 4d)에서 대조군과 비교 글루타메이트 간극을 향상시켰다. 마지막으로, 부착 된 마이크로 피펫과 MEA 로컬 절편 뇌 후 MEA의 위치를 확인하기 위해 염료를 적용하는 데 사용됩니다그림 3D로 시연한다.
이러한 데이터는 MEA 기술 만의 연결 회로 (28), (29)를 큰 샘플 영역에서 기록 종종 손상 이전의 기술 (예를 들어, 미세 투석)과 달리, 해마 (24), (25)의 작은 서브 영역 내에서 신경 전달 물질 방출을 측정 할 수 있음을 나타낸다. 또한, 신체의 체중 측정은 글루타메이트 방출 및 통관 (25)의 빠른 반응 속도를 측정하기 위해 높은 시간 분해능으로 우리를 제공합니다.
그림 1 : 글루타민산 산화 효소 사이트에 전류 (PA)의 변화를 측정 자체 참조 바께 미세의 체외 교정 (GluOx, 빨간색)에 대 센티넬 사이트 (전송; 푸른). 간섭 물질의 아스 코르 빈산 (AA : 250 μM)과 도파민 (DA : 2 μM)는 글루타민산 염 산화 효소 또는 감시 사이트 중 하나에서 전류를 변경하지 않았다. (글루 : 20, 40, 60 μM), 글루타메이트의 첨가는 글루타메이트 산화 효소 사이트 단계적 전류 증가하지만 감시 위치에 전혀 변화를 일으켰다. 과산화수소 (H 2 O 2 : 8.8 μM)의 두 사이트에 전류의 증가를 일으켰다. 감도, 기울기 검출의 제한 및 R 2 개 값을 보정 한 후에 계산 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 샘플 전기 화학 워크 시트. 이 시트는, 주사 또는 주입 수 (TIME / TTL)의 시간에 대한 항목이, 뇌 좌표 (AP, ㎖, DV)을 포함인가 된 압력의 양 (질소)의 압력 (시간)의 길이는, 압력 분사기에 의해 분사 볼륨. 이러한 홀수 신호 또는 마이크로 피펫의 막힘 등의 임의의 음은 노트 열에 기록되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 세포 외 토닉과 염화칼륨 (KCl을) 해마의 DG, CA3 및 CA1 지역에서 글루타메이트의 -evoked 릴리스. 해마, 토닉 글루타메이트 농도의 CA1과 CA3 영역에서 (A)는 크게, 비히클 - 처리 된 마우스 TauP301L (VEH-TauP301L)에 의해 감쇠 릴루 졸 치료 효과를 증가시켰다. (B)은 CA3-KCl을 유발에서 글루타메이트 방출 기준 정합 대표 녹음 R 나타났다 iluzole 처리 (RIL-TauP301L)는 VEH TauP301L - 마우스에서 관찰 글루타메이트 방출의 진폭의 유의 한 증가를 감쇠. 의 KCl의 지역 응용 프로그램 (↑) 빠르게 토닉 수준으로 돌아 세포의 글루타메이트의 강력한 증가를 생산했다. KCl을 로컬 어플리케이션 릴루 졸 치료 감쇠 된 후 (C)를 크게 DG, CA3에 VEH TauP301L - 마우스에서 관찰-KCl을 유발 글루타메이트 방출을 증가되고, CA1. ** p <0.01 VEH 제어 VEH-TauP301L 대 #의 p <.05 RIL-Tau- (D) 크레 실 바이올렛 염색 해마 20 μm의 섹션 CA3과 CA1에 MEA 트랙의 위치를 나타낸다 (SEM 평균 ± P301L VEH-TauP301L 대, ## 대 TauP301L VEH-p <.01 RIL-TauP301L; N = 14-19 / 군). 이 그림은 존 와일리와 아들 (19), (20)의 허가를 받아 재 인쇄했습니다.rget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
해마의 DG, CA3 및 CA1 지역에서 외생 글루타민산 응용 프로그램에 따라 그림 4. 조미료 통풍 관. (A)이 로컬인가 글루타메이트 신호의 진폭은 각각의 영역에서 그룹간에 유사 하였다. (B) T 상승, 마이크로 피펫으로부터 글루타메이트 확산의 지표는, 각 영역의 그룹간에 유사 하였다. (C) - 로컬 VEH 대조군 글루타메이트의 애플리케이션 VEH-TauP301L 및 RIL-TauP301L 마우스에서 글루타메이트 CA3 대표적인 신호. (D) 릴루 졸 처리 릴루 졸 처리 T 향상 글루타메이트 흡수를 나타내는, 해마의 3 개 영역에서 VEH TauP301L - 마우스에서 관찰 된 곡선 (AUC) 아래의 순 면적의 상당한 증가를 감소auP301L 마우스는 (평균 ± SEM; Veh- 대 * p <VEH-TauP301L 대 0.05 VEH 제어, ** p <0.01 VEH 제어는 VEH-TauP301L 대 #의 p <.05 RIL-TauP301L TauP301L ## P-VEH TauP301L 대 <.01 RIL-TauP301L; 13 명 - 15 / 군). 이 수치는 존 와일리와 아들 (20)의 허가 재판되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 0.05 M PBS | 2 L의 DI 물 : |
| 유리 비커에 보관 주석 호일로 포장. 필요한 경우 KOH로 pH 7.4까지를 가져와. | 의 NaH 2 PO 4 · H 2 O 2.8 g 나 2 HPO 4 : 11.34 g의 염화나트륨 : 11.68 g |
| 20 mM의 아스코르브 산 50 ㎖ DI 물 : | |
| 신선한 매일합니다. | 아스코르브 산 : 0.18 g |
| 20mM의 L 글루탐산 | 50 ㎖ DI 물 : |
| 신선한 주간을 확인합니다. | L 글루탐산 모노 나트륨 염 수화물 0.15 g |
| 2 mM의 도파민 | 도파민 염산염 0.038 g |
| 신선한 매달하십시오. | 0.1 M 산 과염소산 10 ㎖를 탈 이온수 100 mL의 부피를 가져 |
| 8.8 mM의 과산화수소 | 50 ㎖ DI 물 : |
| 신선한 주간을 확인합니다. | 과산화수소 : 500 μL |
| 70 mM의 염화칼륨 | 100 ㎖ DI 물 : |
| 실험의 신선한 일을합니다. | 염화칼륨 0.08 g 염화나트륨 0.07 g 염화칼슘 : 0.004 g |
| 200 μ; M 글루타메이트 | 20 mM의 글루타메이트 100 μL |
| 실험의 신선한 일을합니다. | 멸균 생리 식염수 10 mL를 |
표 1 : 교정 솔루션.
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Discussion
MEA를 기술은 시험 관내 및 생체 내에서 신경 전달 물질 방출 및 흡수 빠른 반응 속도의 측정을 허용한다. 따라서, 기술 토닉 신경 전달 물질의 농도를 포함하는 데이터 출력 유발 신경 전달 물질 방출, 및 신경 전달 물질 간극 다양한 생산한다. MEA의 사용이 상대적으로 복잡한 과정이기 때문에, 성공적인 사용을 위해 최적화 될 필요가있다 수많은 요인이있다. 예를 들어, 교정 중에 하나에는 신호 파형 (동경 스크린) 또는 자극에 대한 반응이 최소, 또는 부재 있음이 없는지주의있다. 가능성 시스템 레코딩 시스템을 다시 시작 오작동, 또는 컴퓨터로 인해이 문제를 해결할 수 있습니다. 또한, 문제는 연결 오류 일 수 있습니다. 교정하기 전에, MEA 및 기준 전극 연결부가 적절히 연결되어 있는지 다시 확인과 관련된 것이다. headstage에 DIP 소켓의 교체는 MEA 연결 문제를 해결할 수 있습니다.접합체 용액이 완전히 없거나 불완전 유지 기준 전극을 사용하는 경우, 이들은 또한 교정 중에 기록을 방해 할 수있다. 보정시 둔화 신호 응답은 필요한 BSA / 글루 타르 알데히드 혼합물 또는 느리게 회전 교반 막대보다 두꺼운 발생할 수있는 또 다른 일반적인 문제이다. 간섭 물질이 교정시에 신호를 제공하는 경우,이 전기 도금에 오류가 있다고 가능하다 MPD 제외 층 (예 충분히 전기 도금하지 않았다). 이러한 경우에, 전기 도금 절차를 반복하는 것이 필요하다.
수술하는 동안, 하나 개 마취 수준은 모든 마우스에 충분하지 않을 수 있습니다; 일부 마우스는 "아래 이동"하는 마취의 높은 수준을 필요로 할 수 있으며 일부 마우스는 덜 필요할 수 있습니다. 마취의 낮은 수준에서 시작하여 천천히 마우스가 빛 마취 될 때까지 인상하는 것이 필수적입니다. 마우스가에 의해 정위 장치에 한 번 깊은 마취를 테스트 할 수 있습니다꼬리 또는 발가락 핀치. 접합체를 이식하기위한 좌표를 선택할 때, 또한 많은 신경 퇴행성 동물 모델 36, 37, 38에서 발생할 수있는 뇌의 위축에 대한주의하는 것이 중요하고 정확합니다. 또한,이는 MEA의 기록 특성에 영향을 미치는 느린 시간 분해능 또는 크게 최소화 신호 반응을 초래할 수 있으므로 혈액의 MEA에 축적되지 않는 수술 중 필수적이다. 혈전 전극 주변의 경우, 단순히 MEA를 제거하고 식염수로 씻어.
기록하는 동안 발생할 수있는 가장 일반적인 문제 중 하나는 그 잡음 신호이다. 이러한 보조 조명 기기 추가, 및 드릴 등의 다른 전자 장치들로부터의 간섭이 거의 가능성 범죄자, 그래서 그것이 기록 시스템과 같은 전기 회로 및 / 또는 출구로 연결해 방지하는 것이 최상이다. 또한, 기록 SYS 경우편 하나는 기록 시스템의 오실로스코프의 진동뿐만 아니라 모든 사이트에 따른 소음 및뿐만 아니라 기록 사이트를 준수합니다, 제대로 접지되지 않습니다. 녹화 시스템에서 권장 접지 매트는 이러한 문제를 방지하기 위해 접지 된 파이프에 연결해야합니다. 그 다음으로 오류없는 것으로 판정 된 경우, 오류가 상기 기준 전극 또는 MEA 자체에 놓여있다. 시스템의 작동 상태를 확인하지 않은 새 MEA를 사용, 소음 문제가 발생하면 유용한 문제 해결 방법이 될 수 있습니다. 분리 또는 전혀 변화가 거의 상기 기준 전극의 결과를 교체하는 경우, 기준 전극 또는 반 - 셀 고장 날 수있다. 기준 전극을 변경하면 문제를 해결할 수있는 유일한 방법이 될 수 있습니다. 녹음이 완료되면, MEA의 최종 장점은 청소하고 재사용 할 수있는 기능입니다. 이 MEA를만큼 MEA 교정 동안 적절하게 수행하기 위해서 지속적으로 대략 3 번 재사용 될 수있다.
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Disclosures
GG는이 연구에서 글루탐산 측정에 사용되는 FAST-16 기록 시스템을 만드는 Quanteon, LLC의 유일한 소유자입니다. JEQ는 Quanteon에 대한 유료 컨설턴트이다.
Acknowledgments
(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR, R15AG045812), 알츠하이머 협회 (MNR, NIRG-12-242187), WVU 교수 연구 상원 그랜트 (MNR) 및 WVU PSCOR 보조금이 작품은 국립 일반 의학 연구소에 의해 지원되었다 (MNR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | #786500 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
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