Method Article

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

DOI:

10.3791/55463

⸱

March 31st, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת כאן שיטה למיצוי, טיהור ובקרת איכות של DNA גנומי מהפתוגן הפטרייתי הביוטרופי המחייב, טחב אבקתי, לשימוש בריצוף גנום לקריאה ארוכה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פטריות טחב אבקה הן קבוצה של פתוגנים צמח פטרייתיים חשובים מבחינה כלכלית. יחסית מעט מאוד ידוע על הביולוגיה והגנטיקה המולקולרית של פתוגנים אלה, בין השאר בשל חוסר משאבים גנטיים גנומי מפותח. יש אורגניזמים אלה הגנום גדול, החוזרות על עצמן, אשר הפכו הגנום רצף והרכבה להחריד קשה. כאן, אנו מתארים שיטות לאיסוף, מיצוי, טיהור בקרת איכות הערכת הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי גבוה ממיני טחב אבקה אחד, Golovinomyces cichoracearum. הפרוטוקול המתואר כולל הפרעה מכנית של נבגים ואחריו מיצוי DNA גנומי מותאם פנול / כלורופורם. תשואה אופיינית היתה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 נבגים מ"ג. ה- DNA הגנומי כי הוא מבודד באמצעות הליך זה מתאים רצף ארוך לקרוא (כלומר,> 48.5 KBP). אמצעי בקרת איכות על מנת להבטיח את הגודל, תשואה, וטוהר של הדנ"א הגנומי הם גםהמתוארים בשיטה זו. רצף של הדנ"א הגנומי של האיכות המתוארת כאן יאפשר ההרכבה וההשוואה של הגנום טחב אבקתי מרובה, אשר בתורו יוביל להבנה טובה יותר ושיפור שליטת הפתוגן חקלאי זה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קימחון הם קבוצה של צמחים biotrophic פטרייתיים לחייב פתוגנים, כאשר נלקח יחד, הם הגורם הגדול ביותר של מחלות צמחים ברחבי העולם 1. ישנם מעל 900 מינים מתוארים של טחב אבקתי, אשר קובצו טקסונומית לחמש שבטים בתוך המשפחה Erisyphaceae 2. הן בשל חשיבותה הכלכלית שלהם ואת היחסים האינטימיים שהם מפתחים עם מארחיהם, מחלות טחב אבקתי כבר נושא למחקר עבור> 100 שנים. לאחר ההדבקה, קימחון לעורר שינויים דרסטיים במבנה הסלולר, חילוף החומרים וביולוגיה מולקולרית של מארחיהם, ליהנות פתוגן זה. עם זאת, המחקר של קימחון הוא מאתגר במיוחד בשל אורח חי מחייבים שלהם, והצמיחה של הפטרייה בתרבות טהורה טרם תאר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חומר פטרייתיים

  1. גידול אבק טחב
    1. לגדל צמחים בתאי גידול עם התנאים הבאים: 22 ° C יום הטמפרטורה, 20 ° C טמפרטורה בלילה, 80% לחות יחסית, 14-h-אורך היום לבין עוצמת אור של 125 μE / m 2 / s (המסופק על ידי תאורת פלורסנט ).
    2. להדביק צמחים מלפפון (מגוון סטיבה Cucumis בוש אלוף) עם UCSC1 זן cichoracearum Golovinomyces כמתואר 18, 29....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמה מייצגת של 60ng הדנ"א הגנומי מטוהרים מן G. cichoracearum להריץ על ג'ל agarose באמצעות ג'ל אלקטרופורזה ושימוש ג'ל אלקטרופורזה פעמו שדה מוצגים איורים 1 ו 2, בהתאמה. הכנות DNA הגנומי שעוברים, שולי לעבור להיכשל בקרת איכות מיוצגות. הכנות DNA הגנומי שעוברות בקרת איכות באופן מלא הם אידיאליים עבור סידור באמצעות גישות רצף הגנום ארוך לקרוא. הכנות כי שולי לעבור בקרת איכות כשרים, אך הכנות שעוברות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לקבל טהור, הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי גבוה מן פטריות וטחב אבקתי biotrophic לחייב, גרסה שונה של השיטות שתוארו קודם לכן פותחה 30. התשואה הממוצעת באמצעות פרוטוקול מותאם זה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 מ"ג נבגים, הכפלה של התשואה המתקבלת עם פרוטוקול מוקדם. כמו כן, את הגודל הממוצע גדל מכ 20 KBP למעל 48.5 KBP. פרוטוקול זה מותאם במערכת cichoracearum ג cucumber-. על מנת לקבל את האיכות הטובה ביותר ואת DNA הטוהר הגבוה ביותר טחב אבקה אחר או לחייב פט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה פותח לתמיכה בפרויקט ריצוף משותף של מכון הגנום והקהילה (#1657). העבודה נתמכה בחלקה על ידי קרן פילומטיה, הקרן הלאומית למדע (#0929226) והמכון למדעי האנרגיה ל-S. Somerville; ועל ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (#310030_163260) לב. ברצוננו להודות לעמיתינו, M. Figureroa ו- M. Miller (אוניברסיטת מינסוטה), R. Panstruga (אוניברסיטת RWTH אאכן), C. Pedersen (אוניברסיטת קופנהגן), P. Spanu (אימפריאל קולג'), J. Taneja (אוניברסיטת קליפורניה ברקלי), M. Wildermuth (אוניברסיטת קליפורניה ברקלי), R. Wise (אוניברסיטת מדינת איווה) ו- S. Xiao (אוניברסיטת מרילנד) על עצותיהם הנדיבות ועל התנדבות הפרוטוקולים שלהם בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול המתואר כאן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MM400 טחנת כדורRetsch20.745.0001או שווה ערך טחנת כדור
2 צינורות מ"ל לכרסום כדורSarstedt 72.694.007
5/32 אינץ' כדורי כרסום נירוסטהOPS אבחוןGBSS 165-5000-01
מיקרו-מעבד נשלט 280 סדרת אמבט מים מוגדרת מראש ל-65 מעלות; C Thermo Fisher Scientific2825או אמבט מים שווה ערך
מיקרו-מעבד נשלט 280 סדרת אמבט מים מוגדר מראש ל-37 מעלות; CThermo Fisher Scientific2825או אמבט מים שווה ערך
Eppendorf 5417R מיקרוצנטריפוגה מקוררתKrakeler Scientific 38-022621807או מיקרו-צנטריפוגה מקבילה
כלורפורם: IAA (24:1 v/v)סיגמא-אולדריץ' C0549מסוכן במקרה של מגע בעור או שאיפה. ללבוש כפפות ניטריל, משקפי מגן, מעיל מעבדה ולעבוד במכסה המנוע הכימי
פנול: כלורופורם: IAA
(25: 24: 1 v/v)		Thermo Fisher Scientific15593031מסוכן במקרה של מגע בעור או שאיפה. ללבוש כפפות ניטריל, משקפי מגן, מעיל מעבדה ולעבוד במכסה מנוע כימי
100% איזופרופנולסיגמא-אולדריץ' 
100% אתנולסיגמא-אולדריץ' 34923צינון עד -20 מעלות; C שימוש קודם
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ' S2889
Rnase, ללא דנאז (10 מ"ג/מ"ל)ThermoFisher ScientificEN0531
אשלגן מטאביסולפיטסיגמא-אולדריץ' P2522
נתרן לאוריל סקרואינטסיגמא-אולדריץ' L9150
טריס בסיססיגמא-אולדריץ' 
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא-אולדריץ' EDS
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ' S9888
Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)Sigma-Aldrich H6269
Uvex של Honeywell Futura משקפי מגן S345C, UvextremeStaples423263או משקפיים שווי ערך
High Five כפפות ניטריל COBALT, LARGENeta ScientificHFG-N193או כפפות שוות ערך
ג'ל חומצת גרעין אדומה כתם ג'ל 10,000x במיםביוטיום41003
אתידיום ברומיד 10 מ"ג/מ"לביוטיום40042מסוכן במקרה של מגע בעור. ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb תקני גודל DNA של CHEFBio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172או שווה ערך ג'ל שדה דופק aparatus
נייר סינון איכותי Whatman, כיתה 1סיגמא-אולדריץ' תאצמיחה WHA1001042 או שווה ערך
תא צמיחה PercivalAR66LXC9
NanoDrop 8000 UV-Vis ספקטרופוטומטרתרמו פישר מדעיND-8000-GLאו ספקטרופוטומטר שווה ערך
Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקתתרמו פישר סיינטיפיקP11496
TAE מאגר (Tris-אצטט-EDTA) (50x)תרמו פישר ScientificB49יש לדלל 1/50 במים לפני השימוש (עד 1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
Tris-Borate-EDTA, תמיסה פי 10 (אלקטרופורזה)Thermo Fisher ScientificBP13334לדלל 1/10 במים לפני השימוש (עד 1x)
חנקן נוזלי חנקןנוזלי (-196 ° ג) מהווה סכנת הקפאה. הוא גם יתרחב במהירות עם ההתחממות ואין לשמור אותו במיכל סגור היטב
W29290710708976001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
  2. Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
  3. Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Molecular Weight Genomic DNAPowdery Mildew DNA ExtractionPhenol Chloroform ExtractionLong Read Sequencing DNAPulsed Field Gel ElectrophoresisGenomic DNA PurificationFungal DNA IsolationDNA Quality ControlConidia DNA ExtractionGel Electrophoresis Analysis

Related Articles