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방법 논문

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

11.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55482

⸱

2017년 3월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

초록

알츠하이머병과 관련된 아밀로이드 베타(Aβ)와 같은 아밀로이드성 펩타이드는 고순도 물질을 얻으려고 할 때 상당한 문제를 제시할 수 있습니다. 여기에서는 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생산하기 위한 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 소수성 폴리(스티렌/디비닐벤젠) 고정상, 고분자 실험실 역상 - 높은 pH 조건에서 스티렌디비닐벤젠(PLRP-S)의 조합이 단일 크로마토그래피 실행에서 고순도(>95%) Aβ42를 달성할 수 있음을 발견했습니다. 정제는 재현성이 높으며 정제하고자 하는 물질의 양에 따라 반분취 및 분석 조건으로 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 Aβ40 펩타이드에 동일한 성공으로 적용할 수 있으며 방법을 변경할 필요가 없습니다.

서론

알츠하이머 병은 신경 퇴행성 질환 효과 만 35 명 이상의 세계이다. 질병의 발병 및 발달에 크게 관여 1은 매우 응집하기 쉬운 소수성 펩타이드 베타 아밀로이드 (Aβ)이다. 이 Aβ가 그러나, 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)는 단백질의 가장 독성 형태 42 아미노산 변이체 인 것으로 생각하고, 길이 36 내지 43 개의 아미노산의 범위이다. (3)이 용이 특히 신경 독성 엔티티 것으로 여겨진다 확산 성, 올리고머 성 종을 형성하는 Aβ42의 능력에 대부분 기인한다. 도 4는 Aβ 펩티드에 대한 이해를 증진하기 위하여, 일상적으로 고순도 재료를 얻는 것이 필수적이다. 미량 불순물의 존재는 크게 펩티드 응집 성향의 특성을 변화하는 것으로 나타났다. (5)

티raditionally 같은 소수성 Aβ 펩티드의 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분리 C 사 또는 C 8 실리카 계 정지상과 이동상 산성의 조합을 사용하여 수행되었다. (6) 그러나, 이러한 조건은 펩티드의 정제에 도전을 제공 할 수있다. Aβ 펩티드의 낮은 등전점은 PI (약 5.5) (7)는 산성 조건 하에서, 펩티드의 응집이 증가되고, 그 결과 종종 분리하기 어려운 넓은 비 - 분해 HPLC 피크는 (도 2A)을 생산하는 것을 의미한다. 또한, 이러한 넓은 피크들은 펩티드의 응집 프로필 영향 및 일반적 극적 제조 펩타이드의 양에 영향을 미칠 수있는 정제의 후속 발사가 필요할 수 불순물을 함유한다.

폴리 (스티렌 / 디 비닐 벤젠) 정지상 PLRP-S는을 정제의 대안적인 수단을 나타낸다잉 소수성 펩타이드. 정지상 다른 단백질과 메신저 리보 핵산 (mRNA의) 다수의 정제에 사용되어왔다. 8, 9 PLRP-S 정지상은 역상 분리 추가적인 알킬 리간드를 필요로하지 않고,보다 중요한 펩티드 deaggregation 리드 높은 pH에서 화학적으로 안정하다. 7 여기서, 우리는 고순도 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)과 아밀로이드 베타 40 (Aβ40) 펩타이드를 산출 맞춤형 HPLC 정화 프로토콜을보고합니다.

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프로토콜

1. Aβ40 또는 Aβ42 펩타이드의 제조용 HPLC 정제

  1. HPLC 정제를 위한 다음의 버퍼를 준비한다.
    1. 1,000 mL의 초순수에 NH4OH(28% 용액) 1.3 mL를 첨가하여 버퍼 A(20 mM NH4OH)를 준비한다.
    2. 800 mL의 HPLC 등급 아세토니트릴과 200 mL의 초순수로 구성된 용액에 NH4OH(28% 용액) 1.3 mL를 첨가하여 버퍼 B(20 mM NH4OH가 포함된 80% 아세토니트릴)를 준비한다.
    3. 100 mL의 초순수에 NH4OH(28% 용액) 100 µL를 첨가하여 시료 용해 버퍼(0.1% NH4OH)를 준비한다.
  2. 그림 1에 표시된 대로 HPLC 기기를 설정한다.
    1. 폴리머 튜빙을 사용하여 버퍼 A와 버퍼 B가 들어 있는 용매 병을 HPLC 펌프의 입구에 연결한다. 일체형 피팅을 사용하여 폴리머 튜빙을 HPLC 펌프에 고정한다. 각각의 버퍼 튜빙이 기기의 올바른 입구 밸브에 연결되었는지 확인한다. HPLC 펌프에 디가서를 장착한다.
    2. 폴리머 튜빙을 사용하여 HPLC 펌프를 300 Å 8 µm 25 mm х 300 mm 예비 컬럼(그림 1B, 가장 왼쪽 컬럼, 재료 목록 참조)의 입구에 연결한다.
      1. 일체형 핸드 타이트 피팅을 사용하여 폴리머 튜빙을 예비 컬럼에 연결한다. 폴리머 컬럼이 올바른 방향으로 배치되었는지 확인한다.
        참고: 예비 컬럼의 고정상은 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 입자로 구성되어 있다. 폴리머 컬럼의 올바른 방향은 외부 케이스에 있는 단일 방향성 화살표로 표시되어 있다.
    3. 폴리머 튜빙을 사용하여 컬럼의 출구를 이중 파장 검출기와 연결하고, 파장 검출기를 214 nm 및 280 nm로 설정한다.
      1. 내장된 HPLC 소프트웨어의 기기 설정 메뉴에서 검출 파장 파라미터를 변경하여 파장을 조정한다.
    4. 일체형 핸드 타이트 피팅을 사용하여 폴리머 튜빙을 파장 검출기의 입구에 연결한다. 파장 검출기의 출력 밸브에 폴리머 튜빙을 연결한다. 일체형 핸드 타이트 피팅을 사용하여 HPLC 검출기의 출구 밸브에 폴리머 튜빙을 연결한다. 이 튜빙은 시료 수집용 튜빙이 된다.
      참고: Aβ 펩타이드는 강한 크로모포어를 포함하지 않으므로, 피크 수집을 위한 주요 자외선(UV) 파장으로 214 nm를 사용해야 한다.

figure-protocol-1
아밀로이드 베타 펩타이드 정제에 사용된 HPLC 장비의 실험 설정. (A) 디가서와 214 nm 및 280 nm로 설정된 가변 파장 검출기를 장착한 사원계 HPLC 펌프; (B) 아밀로이드 베타 펩타이드 정제에 사용된 HPLC 컬럼들로, 왼쪽부터 25 x 300 mm2 제제용 컬럼, 7.5 x 300 mm2 반제제용 컬럼, 4.6 x 250 mm2 분석용 컬럼; (C) 분석용 HPLC에 사용되는 20 µL 스테인리스강 주입 루프를 갖춘 수동 인젝터; (D) 제제 및 반제제 정제에 사용되는 10 mL 스테인리스강 주입 루프를 갖춘 수동 인젝터. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

  1. HPLC 소프트웨어를 설정하여 표 1에 나와 있는 정제 방법을 실행하도록 프로그래밍한다. HPLC 소프트웨어에 내장된 장비 설정 방법 옵션에서 용매 시간표 매개변수를 변경하여 정제 방법을 입력한다. HPLC 펌프의 전원을 켜려면 클릭한다. "켜기" HPLC 소프트웨어의 버튼
    참고: 펌프가 준비 컬럼과 HPLC 장치를 통해 버퍼 A와 버퍼 B의 초기 비율 공급을 시작합니다.
    1. 30분 동안 시스템을 방치하여 완전히 평형 상태에 도달하게 한다.
시간 / 분버퍼 Aa의 비율 / %버퍼 Bb의 비율 / %유속d / mL min-1
080206
4575.524.56
45.0180206
52.0180206
52.0273276
8573276
92595c6

표 1: 25 × 300 mm 폴리머 컬럼을 사용한 Aβ42 및 Aβ40 펩타이드 정제를 위한 시간표. a버퍼 A - 20 mM NH4OH가 포함된 H2O; b20 mM NH4OH가 포함된 80% MeCN / 20% H2O; c다음 시료 주입 전에 컬럼을 세척하기 위해 15분 동안 수행; dHPLC 장비에서 6 mL/min의 유속을 유지하기 위해 압력 한도를 200 bar로 낮추어야 한다.

  1. Aβ 펩타이드 시료의 정제
    참고: 조제 펩타이드는 자동 고상 펩타이드 합성법을 통해 획득하였다.10
    1. 조제 Aβ 펩타이드 3 mg을 시료 용해 버퍼 4 mL에 용해시킨다. 용해를 돕기 위해 시료를 실온에서 40 kHz 주파수로 30-60초 동안 초음파 처리한다.
    2. 5 mL 플라스틱 주사기와 16게이지 스테인리스강 바늘을 사용하여 전체 시료를 HPLC 컬럼에 주입한다. 1.3번 하위 단계에 명시된 대로 정제 방법을 실행한다.
      참고: 시스템은 10 mL 스테인리스강 주입 루프가 장착된 수동 주입기를 사용하여 시료 주입이 가능하다(그림 1D). 원하는 Aβ 펩타이드는 72~74분 사이에 날카롭고 분리된 피크 형태로 용리된다(그림 2C).
    3. 시료를 50 mL 원뿔형 원심분리관에 회수한다. 회수된 용리액의 직접 주입 질량분석법을 통해 Aβ 피크의 정체를 확인한다.11 용리액은 -20 °C에서 최대 12시간 동안 보관할 수 있다.
      참고: 펩타이드의 산화 가능성이 존재하므로, 12시간 이상의 장기 보관은 권장하지 않는다.
    4. 액체 질소를 사용하여 회수된 Aβ 펩타이드 분취액을 급속 냉동한 후 동결건조하여 정제된 펩타이드를 분리한다. 시료를 -60 °C 온도와 20 mTorr 압력에서 24시간 동결건조하여 동결건조 과정을 수행한다.
    5. 아래에 명시된 분석용 HPLC 프로토콜을 수행하여 Aβ 펩타이드의 순도를 평가한다. 펩타이드는 동결건조 형태로 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관한다.

2. 정제된 Aβ 단백질의 분석적 HPLC 분석

  1. 위 프로토콜의 1.1절에 설명된 대로 HPLC 버퍼를 준비한다.
  2. 분석용 HPLC를 1.2.1단계에 따라 설정하고, 그림 1에 나와 있는 4.6 × 250 mm 분석 컬럼(그림 1B, 가장 오른쪽 컬럼)과 20 µL 스테인리스강 주입 루프를 장착한 수동 주입기를 기기에 연결한다(그림 1C).
  3. 1.3단계의 지시사항과 유사한 방법에 따라 표 2에 제시된 분석법이 실행되도록 HPLC 소프트웨어를 프로그래밍한다.
시간 / 분버퍼 Aa의 비율 / %버퍼 Bb의 비율 / %유속 / mL min-1
09551
3050501

표 2: Aβ 펩타이드의 HPLC 순도 분석을 위한 시간표.a버퍼 A - 20 mM NH4OH이 포함된 H2O; b20 mM NH4OH이 포함된 80% MeCN / 20% H2O.

  1. A의 순도 분석β 펩타이드
    1. 정제된 펩타이드를 시료 버퍼 용액에 녹여서 1 mg/mL 농도의 용액을 제조한다.
      참고: 버퍼 제조법은 1.1항을 참조하십시오. 단백질 농도는 280 nm에서의 단백질 흡광도(A280nm).12 몰량 흡광 계수(ε농도를 결정하는 데 사용됨 ε = 1,490 dm3 몰-1 cm-1.13
    2. 주사하다 20 µL 1 mg/mL의222 µM) 용액을 HPLC 컬럼에 주입하고 2.3단계에서 설정한 분석법으로 운전한다.
      참고: 분석에 사용하지 않은 잔여 용액은 액체 질소에서 급속 냉동한 후 동결건조하여 A를 회수할 수 있다.β 펩타이드. 동결건조 세부 사항은 1.4.4 소항을 참조하십시오. Aβ 펩타이드는 분석용 컬럼에서 16~18분 사이에 용리될 것이다(그림 2D). HPLC 장비에 내장된 통합 분석 소프트웨어를 사용하여 A의 순도를 측정한다.β 펩타이드. 순도는 스펙트럼 상의 각 개별 피크를 적분하여 펩타이드 피크의 면적 백분율을 계산함으로써 결정한다. 일반적으로, 정제 과정은 >95% 이상이 확보되어야 한다.

figure-protocol-2
그림 2: A의 대표적인 HPLC 크로마토그램β42. (A) 전통적인 C4 실리카 정제, 조건: 버퍼 A: H2O에 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA), 버퍼 B: 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴(MeCN), 그래디언트: 40분 동안 버퍼 B를 20%에서 27%까지 증가시킨 후 등농도로 27% 버퍼 B 유지; (B) 25 x 300 mm 컬럼을 이용한 제조적 정제2 폴리머 컬럼, 조건: 버퍼 A: H220 mM NH와 함께 O4OH, 버퍼 B: 80% MeCN / 20% H220 mM NH와 함께 O4OH, 구배: 70분 동안 버퍼 B를 20%에서 27%까지 구배하여 세척한 후, 등농도로 27% 버퍼 B 유지; (C) 25 x 300 mm 컬럼을 이용한 최적화된 제조적 정제2 폴리머 컬럼, 조건은 프로토콜 설명 문단의 1.3 소항에 있는 표 1에 기술되어 있음; (D) 4.6 x 250 mm을 사용한 분석용 HPLC2 폴리머 컬럼, 조건: 버퍼 A: H220 mM NH와 함께 O4OH, 버퍼 B: 80% MeCN / 20% H220 mM NH와 함께 O4OH, 30분 동안 버퍼 B를 5%에서 50%까지 기울기로 적용. A, B 및 C 부분에 대해 A에 해당하는 피크β42는 별표로 표시되어 있다. 표시된 A의 수집β부분 C의 42번 피크는 순도를 나타냅니다 >95%로, D 부분에 표시되어 있다. A의 정체를 확인하기 위해 질량분석법을 사용하였다.β42 피크 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

PLRP-S 고정상과 고 pH 이동상의 조합을 사용하여 Aβ42 펩타이드를 정제하면, 72분에서 74분 사이의 머무름 시간에서 Aβ 펩타이드에 대한 날카롭고 분리된 피크가 형성됩니다(그림 2C). 수집된 용출액의 직접 주입 질량 분석법을 통해 피크의 동일성을 확인합니다. 용출액은 용액 상태로 -20 °C에서 최대 12시간 동안 보관할 수 있습니다. 보관 기간이 길어지면 단백질의 산화가 발생할 수 있습니다. 정제된 펩타이드를 분리하기 위해, 용출액을 액체 질소로 급속 냉동시킨 후 동결 건조합니다. 정제된 펩타이드의 분석용 HPLC 결과 >95%의 순도가 나타납니다(그림 2D). 동일한 절차를 방법의 수정 없이 Aβ40 펩타이드 정제에도 사용할 수 있습니다(그림 3A). 분석용 HPLC 결과 Aβ40의 순도는 95% 이상인 것으로 나타납니다(그림 3B

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토론

Aβ 펩타이드의 HPLC 정제는 정제에 사용되는 고정상과 펩타이드를 용리하기 위해 선택된 이동상의 선택에 크게 의존합니다. 펩타이드의 낮은 등전점과 높은 응집 성향은 소수성 단백질(산성 이동 용리액과 결합된 C4 또는 C8 고정상)의 분리를 위한 전통적인 크로마토그래피 조건을 어렵게 만들며, Aβ 펩타이드는 장기간 넓고 분해되지 않은 피크로 용출됩니다(그림 2A).

이 문제를 피하기 위해 높은 pH에서 화학적으로 안정적인 PLRP-S 고정상이 Aβ 펩타이드의 정제에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다(그림 2B 및 2C). 높은 pH 이동상을 사용하면 응집 정도가 최소화되었으며, 최적화하면 날카롭고 잘 분해된 피크가 생성되었습니다. 최적화된 프로토콜에서 버퍼 B의 백분율은 52분 시점에서 20%에서 27%로 빠르게 전환되었고 그 결과 잘 정의된 Aβ 피크가 생성되었습니다(그림 2C<...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 기술적 지원에 대해 애질런트에 감사의 뜻을 전합니다. Kate Markham과 Rafael Palomino는 Aβ 펩타이드의 합성 및 정제에 초기에 도움을 준 공로를 인정받았으며, Hsiau-Wei Lee 박사는 원고의 그림 1을 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사를 표했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
애질런트 1260 Infinity II 쿼터너리 펌프애질런G7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
애질런트 1260 인피니티 II 이중 가변 파장 검출기애질런트G7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
10 mL 스테인리스강 시료 루프가 장착된 Agilent 1260 Infinity II 수동 주입기 Agilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
20 µ가 장착된 Agilent 1260 Infinity II 수동 주입기; L 스테인레스 스틸 샘플 루프AgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
링 스탠드 마운팅 브라켓Agilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  &마이크로; m 4.6 x 250 mm (분석)AgilentPL1512-5501
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features Aβ 42 또는 Aβ 40 펩타이드: CEM liberty 자동 펩타이드 합성기를 사용하여 사내에서 합성.
수산화암모늄 (NH4OH, 28% 용액)Fisher ScientificA669-500
아세토니트릴Fisher ScientificA998-4
HPLC 등급 물Fisher ScientificW5-4
Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-954-49A
Supelco PEEK 피팅 일체형 핑거타이트, 5개 패키지시그마-알드리치Z227250
Normject 5  cc 멸균 주사기Fisher Scientific1481729
16 게이지 SS 바늘Rheodyne3725-086
트

참고문헌

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