Hier presenteren we een methode om S100A12 (Calgranulin C) uit te drukken en te zuiveren. We beschrijven een protocol om zijn antimicrobiële activiteit tegen het menselijke pathogeen H. pylori te meten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Calgranulin eiwitten zijn belangrijke mediators van aangeboren immuniteit en zijn leden van de S100 klasse van de EF-hand familie van calcium bindende eiwitten. Sommige S100-eiwitten hebben de mogelijkheid om overgangsmetalen te binden met een hoge affiniteit en ze kunnen ze effectief wegvallen van invallende microbiële pathogenen in een proces dat "voedingsimmuniteit" wordt genoemd. S100A12 (EN-RAGE) bindt zowel zink als koper en is zeer overvloedig in aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen. We rapporteren een verfijnde methode voor de expressie, verrijking en zuivering van S100A12 in zijn actieve, metaalbindende configuratie. Gebruik van dit eiwit in bacteriële groei en levensvatbaarheidsanalyses laat zien dat S100A12 antimicrobiële activiteit heeft tegen het bacteriepatogen, Helicobacter pylori . De antimicrobiële activiteit is gebaseerd op de zinkbindende activiteit van S100A12, die chloorvoedingszink chelaat, waardoor H. pylori verhongert, wat zink vereist voor groei en proliferation.
Inleiding
S100 eiwitten zijn een klasse van de EF-hand familie van calcium bindende eiwitten met een uiteenlopende reeks functies 1 . Ze worden uitgedrukt in een weefsel- en celspecifieke manier en regelen een breed spectrum van cellulaire functies 2 , 3 . Uniek voor calciumbindende eiwitten, S100-eiwitten vertoonden zowel intracellulaire als extracellulaire functies 4 , 5 . Binnen de cel veroorzaakt Ca 2+ binding een conformatieve verandering die een hydrofoob oppervlak blootstelt dat specifiek op eiwitbindende partners
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Uitdrukking van S100A12
- Transformeer bevoegde BL21 DE3 cellen met een pGEMEX-S100a12 plasmide met behulp van een standaard warmte schok protocol 18 . Voeg 1 tot 5 ul plasmide toe aan 50 μl bacteriën in een microcentrifugebuis op ijs. Incubeer gedurende 20 minuten.
- Warmte schok de cellen bij 42 ° C gedurende 30 s.
- Incubeer de cellen gedurende 2 minuten op ijs.
- Voeg 500 μL SOC media toe aan de cellen. Incubeer bij 37 ° C bij schudden bij 250 rpm op een orbitale shaker gedurende 1 uur.
- Plate 150 μl van de transformatie reactie op LB-agar medium (aangevuld met 100 μg / ml ampicilline). Incubeer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
S100A12 expressie en zuivering
Een drievoudige zuivering produceerde ~ 40 mg recombinant S100A12 uit 50 ml bacteriële cultuur. De eerste stap was een ammoniumsulfaatprecipitatie van endogene E. coli- eiwitten. Deze stap werd gevolgd door anion-uitwisselingschromatografie ( Figuur 1A ). Het eiwit wordt gevolgd door een SDS-PAGE gekleurd met Coomassie Brilliant Blue ( Figuur 1B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een efficiënt protocol voor zowel expressie als zuivering van menselijke S100A12 wordt gepresenteerd. Het E. coli expressiesysteem is het meest voorkomende hulpmiddel dat wordt gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, met name wanneer mg hoeveelheden nodig zijn voor biochemische en biofysische studies. Een belangrijke verbetering van de hier beschreven werkwijze is het gebruik van auto-inductiemedia 26 die de opbrengst van gezuiverd eiwit verhoogt met een factor van bijna de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701, CTSA-prijs UL1TR000445 van het National Center for Advancing Translational Sciences, de National Science Foundation Award Numbers 1547757 en 1400969, en NIH grant GM05551. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs officiële opvattingen van het Nationaal Centrum voor de Bevordering van Vertaalwetenschappen of de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| S100A12 Expressie | |||
| Expressiecellen | |||
| BL 21 (DE3) competente cellen | New England Biolabs | C25271 | |
| Auto-inductie medium componenten | |||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 | |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 | |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 | |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 | |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 | |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 | |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 | |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 | |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 | |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 | |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 | |
| Selectie-agens | |||
| ampicilline | Research Products International | A40040-5.0 | |
| S100A12 Zuivering | |||
| AKTA Start Chromatografie Systeem | GE | 29-220-94 | |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 | |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 | |
| Nanodrop lite spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE | |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 | |
| H. pylori Cultuur | |||
| Bloedbouillon platen | Lab Supply Company | BBL221261 | |
| Brucella bouillon | Sigma-Aldrich | B3051 | |
| Cholesterol (250x) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zinkchloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
Referenties
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).
- Chen, B., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
