Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell'ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).
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Articolo metodologico
Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli studi epidemiologici indicano che l'aumento dell'assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all'angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l'etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L'estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.
Introduzione
I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale 1 . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell'esistenza di tali composti 2 . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici 3 . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che ....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare l'etanolo 80% (100 mL) mescolando 80 mL di etanolo assoluto (grado di biologia molecolare) e 20 mL di acqua sterile a coltura cellulare.
- Per preparare l'estratto di polifenolo (10 mg / ml), pesare 10 mg di CE o PE. Aggiungere 1 ml di pianta Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sotto un cofano di cultura cellulare. Vortice la soluzione. Aliquota in porzioni da 200 μl e conservare a -20 ° C.
- Preparare il buffer di lisi.
- Aggiungere 5 ml di soluzione 1 M di base di HEPES (pH 7,4, 50 mM finale), 1 ml di soluzione a base di 5 M NaCl (finale di 50 mM), 1 ml di 0,5 M soluzione EDTA ....
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Risultati
È stato dimostrato in precedenza che gli estratti di polifenoli isolati da BL, RB e BRB hanno ridotto la senescenza dei VSMC in risposta a Ang II 21 . È stato dimostrato che questi estratti polifenolici purificati modulano la segnalazione di Ang II riducendo la fosforilazione di Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL impedisce la senescenza riducendo l'espressione della NADPH ossidasi (Nox) 1, un enzima che produce anioni superossidich.......
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Discussione
I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dall'American Heart Association (14GRNT20180028) e dal Florida State University Council sulla ricerca e la creatività (COFRS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Angiotensina II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Trattamento di VSMCs |
| β-actina | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Anticorpo primario (1:5000) |
| Mora frutto | Mercer Foods | Mora liofilizzata in polvere | |
| Catalasi | Calbiochem | 219010 | Anticorpo primario (1:1000) |
| Cloroformio | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparazione di estratti di polifenoli purificati |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Coltura di etanolo VSMC |
| (grado assoluto di biologia molecolare) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparazione di estratti di polifenoli |
| Acetato di etile | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparazione di estratti di polifenoli purificati |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Anticorpo primario (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Tampone di lisi |
| Liofilizzatore | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparazione di estratti di polifenoli |
| Siero fetale bovino (FBS) | Seradigm | 1400-500 | Coltura cellulare |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Tampone di lisi |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Tampone di lisi |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Tampone di lisi |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Tampone di lisi |
| Na4P2O7 , decaidrato | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Tampone di lisi |
| fosfo ERK1/2 | Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc. | 9101S | Cocktail di inibitori della proteasi (1:1000) anticorpi primari |
| Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Tampone di lisi | |
| Reagente colorante per il dosaggio delle proteine | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Misurazione della concentrazione di proteine |
| Membrana di trasferimento PVDF | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Evaporatore rotatorio | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 | Preparazione di estratti di polifenoli |
| Acqua sterile | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparazione di estratti di polifenoli |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparazione di estratti cellulari |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Anticorpo primario (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 carta da filtro | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparazione di estratti di polifenoli |
Riferimenti
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev.
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Ristampe e permessi
