Articolo metodologico

Una multi-foro esageratamente Elimina gelati Imperfezioni muscoli sono direttamente immerso in azoto liquido

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 aprile 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una procedura di congelamento tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Questo protocollo evidenzia anche un nuovo esageratamente che può evitare l'effetto "coperta" di gas azoto quando i contatti di azoto liquido la superficie del tessuto di un campione.

Abstract

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Studi sulla fisiologia del muscolo scheletrico affrontare la sfida tecnica di trattare opportunamente i campioni per ottenere sezioni con vani citoplasmatici ben visibili. Un altro ostacolo è la stretta apposizione di miofibre ai tessuti circostanti. Poiché il processo di fissaggio di tessuto e in paraffina conduce alla contrazione delle fibre muscolari, congelamento è un mezzo ottimali di indurimento tessuto muscolare per il sezionamento. Tuttavia, un problema di frequente riscontro, la formazione di cristalli di ghiaccio, si verifica durante la preparazione delle sezioni congelate a causa del alto contenuto di acqua del muscolo. Il protocollo presentato qui in primo luogo descrive un metodo semplice ed efficace per il congelamento correttamente tessuti muscolari immergendole in azoto liquido. Il problema con l'utilizzo di azoto liquido da solo è che provoca la formazione di una barriera al gas azoto accanto al tessuto, che funge da isolante e inibisce il raffreddamento dei tessuti. Per evitare questo effetto "coperta di vapore", a neesageratamente w è stato progettato per aumentare la velocità di flusso del liquido intorno alla superficie del tessuto. Questo è stato ottenuto per tranciatura di un totale di 14 fori di ingresso nella parete del flaconcino. Secondo dinamiche bolla, un più alto tasso di risultati di flusso del liquido in bolle più piccole e meno probabilità di formare una barriera al gas. Quando l'azoto liquido fluisce nella esageratamente attraverso i fori di ingresso, la velocità di flusso intorno il tessuto è abbastanza veloce per eliminare la barriera ai gas. Rispetto al metodo di congelamento tessuti muscolari utilizzando isopentano pre-raffreddato, questo protocollo è più semplice e più efficiente e può essere utilizzato per bloccare il muscolo in modo di throughput. Inoltre, questo metodo è ottimale per gli istituti che non hanno accesso a isopentano, che è estremamente infiammabile a temperatura ambiente.

Introduzione

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Il muscolo scheletrico è la componente più importante di un animale produttrice di carne dal punto nutrizionale e l'elaborazione di vista. Nel settore della carne, ci sono due aspetti particolarmente critici: l'efficienza della crescita muscolare e la qualità della carne risultante. Come componente principale del muscolo, le fibre muscolari sono direttamente legate alla performance di crescita e la qualità della carne fresca in animali 1. Ad esempio, il numero totale di fibre (TNF) e l'area trasversale di fibre (CSAF) in gran parte determinano la massa muscolare e la qualità della carne; Inoltre, Fibra Tipologia Composizione (FTC) influenza fortemente la qualità della carne fresca 2. Pertanto, la manipolazione delle caratteristiche della fibra muscolare negli animali è un metodo molto efficace per aumentare la redditività core e competitività delle aziende 1.

Fino ad oggi, diversi fattori intrinseci ed estrinseci sono stati identificati per manipolare fibra muscolare caratteristica atmosferaCI 1. Questa manipolazione può essere ottenuto attraverso la selezione mirata di animali con geni specifici, come il gene miostatina nei bovini 3, il gene Callipyge nelle pecore 4, e la RYR1 e geni IGF2 nei suini 5. Inoltre, controllo della dieta e trattamenti con ormoni specifici svolgono un ruolo importante nelle caratteristiche della fibra muscolare 6. Così, un approccio che combina i fattori genetici e nutrizionali potrebbe essere in grado di migliorare tenore di carne magra e la qualità della carne. Tuttavia, gli studi sulle fibre muscolari sono limitati nel settore della carne, perché la spiegazione della struttura delle fibre muscolari è ancora una sfida.

proprietà delle fibre muscolari vengono identificati mediante metodi istochimici, quali il test miosina adenosina trifosfatasi (ATPasi). Questo metodo si basa sul fatto che gli enzimi trova a sezioni sottili (6-8 micron) congelati difibre muscolari possono essere fatti reagire chimicamente con alcuni prodotti. Tuttavia, il contenuto di acqua dei muscoli è maggiore del 75% nei suini, conigli, topi, ed esseri umani, indipendentemente dalla posizione (cioè, schiena, addome, o degli arti posteriori) 7. Tale elevato contenuto di umidità nei muscoli causa un problema di frequente riscontro - artefatti congelamento - durante la preparazione di criosezioni, come precedentemente descritto 8, 9. Nella maggior parte dei casi, è quasi impossibile per congelare in modo appropriato tessuti muscolari in una linea di produzione di macellazione, secondo la nostra esperienza.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice ed efficace utilizzato nel nostro laboratorio di congelare i tessuti muscolari per criosezionamento in maniera high-throughput. Il culmine di questo metodo è un nuovo esageratamente che è progettato per i tessuti muscolari flash congelamento in azoto liquido. Il flusso di lavoro corrente può contemporaneamente facilitare tessutocongelamento e lavorazione per un'eccellente cryosection muscolare, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante. Inoltre, questo protocollo può essere applicata a una vasta gamma di opzioni per l'analisi dei tessuti perché l'azoto liquido non si mescola con i tessuti.

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Protocollo

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Il metodo attuale è stato stabilito e convalidato per raccogliere e memorizzare più di 1.000 campioni di muscolo per la colorazione istologica nel nostro laboratorio. Tutte le procedure che coinvolgono la cura degli animali e l'uso hanno seguito le linee guida stabilite dal Ministero dell'Agricoltura della Cina.

1. apparecchiature per la raccolta del campione

  1. Etichettare l'identità del campione su ogni fiala criogenico.
    Nota: La fiala criogenico è appositamente progettato per congelare campioni di tessuto fresco per la procedura cryosection (Figura 1A). I flaconi sono realizzati in polipropilene in una fabbrica di stampo (Figura 1C).
  2. Ottenere le seguenti attrezzature: azoto liquido in un apposito serbatoio di azoto liquido, occhiali di protezione o una visiera, guanti congelatore, 10 cm forcipe, 25 pinzette cm, un dispositivo di raffreddamento polistirolo (dimensioni interne: 20 cm x 12 cm larghezza x 13,5 cm ; dimensioni esterne: 24 cm di lunghezza x 16 cm di altezza di larghezza x 15 cm), film plastici (2,5 cm di lunghezza x 0,8 cm di spessore di larghezza x 0,1 mm),un bisturi, e copre vincolante A4 in PVC (21 cm x 29,5 centimetri) (Figura 1B).

2. Preparazione di campioni di muscolo

  1. Riempire il dispositivo di raffreddamento di polistirolo con azoto liquido 5 minuti prima del prelievo del campione.
    NOTA: La grande colonna di azoto liquido è essenziale perché parte del azoto liquido bolle di distanza e si trasforma in gas quando campioni freschi toccano. Al fine di ridurre la frequenza di trasferimento di azoto liquido per ricostituire la perdita, un dispositivo di raffreddamento polistirolo dimensioni adeguate deve essere acquisita in anticipo secondo il numero di campioni.
  2. Una volta che un campione viene ottenuta, appoggiarlo su un foglio di copertura vincolante A4 PVC e osservare la direzione delle fibre muscolari.
    NOTA: Qui, abbiamo usato la sezione del muscolo longissimus Doris dal primo all'ultimo vertebra lombare nei suini. I campioni sono lunghe circa 12 cm, 8 cm di larghezza e 5 cm di altezza.
  3. Utilizzare un bisturi per fare due incisioni parallele attraverso il I Modellon la direzione delle fibre muscolari, circa 3 cm di lunghezza e 0,6 cm di distanza. Tagliare il muscolo incisa in un rettangolo circa 0,6 centimetri di larghezza x 0.6 cm lungo alte x 1,5 cm.
    NOTA: L'affidabilità della misurazione della sezione trasversale delle fibre muscolari principalmente dipende l'orientamento delle fibre del muscolo incisa.
  4. Utilizzare 10 cm pinze per mettere delicatamente il campione su un pezzo di pellicola plastica, con l'asse longitudinale del parallelo muscolo incisa al lato lungo della pellicola (Figura 2A).
    NOTA: La pellicola plastica ha due funzioni: una funzione di tenuta che aiuta a fissare l'orientamento delle fibre muscolari e una funzione di adesione che impedisce crepe nel campione a causa di congelamento rapido.
  5. Utilizzando pinze, posizionare il tessuto muscolare in basso al centro di una fiala criogenico etichettato, proprio tra i fori di ingresso, e poi ermeticamente tappare il flacone (Figura 2B).

3. Congelare e conservare muscolare CampioneS

  1. Con 25 pinzette cm, immergere rapidamente l'intero flaconcino criogenico in azoto liquido nel refrigerante pre-raffreddato polistirolo, aspettando dell'azoto liquido non bolla (circa 10-20 s).
    NOTA: L'esageratamente galleggia quando l'azoto liquido bolle, quindi immergere attentamente la fiala in azoto liquido bollente per 10-20 s.
  2. Trasferire i campioni di muscolo di un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido o un -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

4. Preparazione del vetrino

  1. Preraffreddare un criostato a -20 ° C e -22 ° C.
  2. Rimuovere ed eliminare la vecchia lama microtomo, pulire il portalama e la piastra anti-rollio nel criostato, installare una nuova lama microtomo criostato, e impostare lo spessore di taglio a 8 um.
  3. Trasferire il campione di muscolo nella fiala criogenico dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido o -80 ° C freezer al criostato, trasportandolo in azoto liquido o il ghiaccio secco.
  4. Attendere 30 minuti per il campione equilibrare con la temperatura del criostato.
    NOTA: Tutte le apparecchiature che potrebbero toccare il campione deve essere pre-raffreddamento, a causa di una temperatura elevata potrebbe causare la formazione di cristalli di ghiaccio presenti nel campione.
  5. Montare il campione nel portacampione sotto la formulazione ottimale temperatura di taglio di glicoli e resine idrosolubili (OCT). Tagliare sezioni 8-micron.
    NOTA: regolare l'angolo di taglio perpendicolarmente all'orientamento delle fibre muscolari, perché il CSAF è l'area della sezione trasversale delle fibre muscolari.
  6. Montare le sezioni verso il centro di un MicroSlide a temperatura ambiente. Collocare immediatamente il vetrino in una cassa scorrevole in una -80 ° C freezer. Non lasciare che il vetrino asciugare a temperatura ambiente.

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Risultati

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L'illustrazione esageratamente e l'equipaggiamento di laboratorio per il congelamento muscoli durante la preparazione di sezioni congelate sono mostrati in Figura 1. I cryovials sono realizzati in polipropilene in uno stampo di fabbrica. Ogni flaconcino ha un totale di 14 fori di ingresso: uno è sul cappuccio; un altro è nella parte inferiore; e le restanti 12 formano quattro linee parallele, ciascuna con quattro fori a 90 ° fra loro. Questi fori di ingresso possono acce...

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Discussione

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Qui, descriviamo un nuovo, multiforo esageratamente per il congelamento e la conservazione tessuti muscolari per effettuare valutazioni istologiche della funzione muscolare. La fase critica modificato in questo protocollo è che il campione nella esageratamente fori multipli è direttamente immersa in azoto liquido. A nostra conoscenza, questo è il modo più semplice e rapidest di ottenere campioni congelati eccellenti per criosezionamento muscolare tra i metodi di congelamento esistenti (vedere i risultati rappresentativi...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interesse, finanziario o di altro, sono dichiarate dagli autori.

Ringraziamenti

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Questo progetto è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (NSFC): 31.301.950 e 31.671.288.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microtomo del criostato Microscopio digitale LeicaLeica CM1950
NikonNikon DS-U3
  Fiala criogenica    Film plasticoProgettato da noi stessi
AzotoBisturi
comune
Pinze da 10 cm
25 cmusata in comune Vetro
di sicurezzacomune
Guantida congelatore usati in comuneComunemente usato
liquido usato in in modalità comune Pinzetta da usato in

Riferimenti

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