本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。
本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。
精巣上体は、精子の成熟および生殖に関する健康に不可欠な器官である。副睾丸上皮は、分子および形態学的特徴だけでなく生理学的特性においても区別される複雑に連結された細胞型からなる。これらの違いは、精巣上体内腔における精巣後精子の発生に必要な微小環境を共に確立する多様な機能を反映している。副睾丸上皮細胞の生物物理学的特性の理解は、生理学的および病態生理学的条件下での精子および生殖器の健康におけるそれらの機能を明らかにするために重要である。それらの機能的特性はまだ完全に解明されていないが、副睾丸上皮細胞は、細胞事象および単一細胞の膜特性を測定するためのツールであるパッチクランプ技術を用いて研究することができる。ここでは、細胞単離法および全細胞パッチクランプ法を用いて、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を確認してください。
男性生殖管の精巣上体は、モザイク上皮細胞の層で裏打ちされた器官である。他の上皮組織と同様に、主細胞、清澄な細胞、基底細胞および免疫系およびリンパ系からの細胞を含む種々の細胞型の副睾丸上皮は、尿細管最前線で障壁として機能するよう協調して働き、精子成熟および生理学1、2、3のための細胞を支持します。したがって、これらの上皮細胞は、リプロダクティブ・ヘルスに必須の役割を果たす。
上皮細胞は、一般による電圧依存性Na +またはCa 2+チャネル4,5の欠如に、刺激を脱分極に応答して、全か無かの活動電位を生成することができない非興奮性の細胞とみなされます。しかし、上皮細胞はユニ分泌および栄養輸送などの特殊な生理的役割を調節するイオンチャネルおよび輸送体のセット6 。したがって、異なる上皮細胞は、特徴的な電気的特性を有する。例えば、主細胞は、流体及び塩化物輸送のためにCFTRを発現し、明確な細胞が管腔酸性<....
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全ての動物実験は、ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施され、これは国内外の要件を満たすものである。
1.実験動物
ラット・カウダ・エピジディミドからの上皮細胞の単離
注記：以下の手順は、特に明記しない限り、無菌条件下で実施します。
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ラットカウダの精巣上体から上皮細胞を単離するための説明酵素消化手順は、我々の以前の研究9、12から修正されたプロトコルです。この方法は、90％以上の生存率を有し、表面ブリスターまたは膨潤した細胞容積のない単一細胞の混合物を産生する。我々は以前に1を記載しているように異種細胞混合物は、主に主細胞、明確な細胞および基底細胞からなります。このプロトコルでは、副睾丸上皮細胞の比較的純粋なサンプルは、ペトリ皿上で一次解離細胞を一晩培養して、非上皮細胞（線維芽細胞および平滑細胞など）を皿上に接着させることによって得ることができる。 図1A （収穫前）に示されている。細胞型は、顕微鏡下での表現型によって予備的に区別することができるそれらの特定の受動的な膜特性に従って分類される。解離した細胞混合物中には、それらの表面膜の一端に微絨毛または粗い膜を有し、偏極した細.......
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このプロトコルにおいて、ラット尾部精巣上体の酵素的分散は、一貫して健常な上皮細胞を産生した。パッチクランプ実験のための副睾丸上皮細胞の質は、プロトコルのいくつかの重要なステップに依存する。例えば、低遠心力（30×g）での細胞混合物の遠心分離は、精子および精巣上体内腔の内容物を除去するために重要である。精巣上体細胞は、細胞培養中の精子の存在下では不健康になる。さらに、解離した細胞混合物をペトリ皿上で数時間培養することは、線維芽細胞および平滑筋細胞を除去するための重要なステップである。非上皮細胞は培養皿上でより速く接着し、上皮細胞を懸濁液中に残し、穏やかな吸引によって再収穫することができる。さらに、コラゲナーゼ消化および細かいガラスピペットによる粉砕は、放出するための2つの重要なステップである細胞解離手順の間に単細胞である。最後に、非効率的な酵素活性による過小消化または長期インキュベーションによる過消化は、ピペットと細胞膜との間のギガオームシール形成を妨害する可能性があるため、精巣上体細胞の酵素消化がパッチクランプ実験にとって重要である。
細胞混合物では、一方の末端に立体虫を有し、細胞.......
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著者は何も開示することはない。
私たちは、このテキストに関する有益なコメントをいただいたChristopher Antos博士に感謝します。この作業は、上海テクニカル大学（Winnie Shum）に授与された創立資金と、中国自然科学財団（NNSFC no。31471370）からの資金提供によって支援されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Axonシステムの機器 | |||
| コンピュータ制御アンプ | 分子デバイス - Axon | Multiclamp 700B パッチクランプアンプ | |
| デジタル取得システム | 分子デバイス - Axon | Digidata 1550コンバータ | |
| 顕微鏡 | リンパス | BX-61WI | |
| マイクロマニピュレータ | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| 記録室とインラインヒーター | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipurator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| 録音室・インラインヒーター | Warner Instruments | TC-324C | |
| その他の機器 | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| 録音室 | ワーナー・インスツルメンツ | RC-26G または自家製チャンバー | |
| ホウケイ酸キャピラリーガラス フィラメント | サッター・インストゥルメント / ハーバード・イスラーム | BF150-86-10 | |
| 防振台 | TMC | 63544 | |
| デジタルカメラ | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| strong>Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 2005年30月30日 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT Collagenase | |
| I | Sigma | C0130 | |
| コラゲナーゼII | ΣC6885 | ||
| 5-&α;-ジヒドロテストステロン | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| ウシ胎児血清 | 山羊 | FBS-12A | |
| <ストロング>マイクロピペット内部溶液(K +ベースの溶液)(pH 7.2、280-295 mOsm) | |||
| KCl、35mM | シグマ/各種 | V900068 | |
| MgCl<サブ>2&ミドドット、6H<サブ>2O、2mM | シグマ/各種 | M2393 | |
| EGTA、0.1mM | シグマ/各種 | E4378 | |
| HEPES、10mM | シグマ/各種 | V900477 | |
| K-グルコン酸、100mM | シグマ/各種 | P-1847 | |
| Mg-ATP、3mM | シグマ/各種 | A9187 | |
| <強力>標準外部記録生理食塩溶液(PSS)(pH 7.4、300-310 mOsm) | |||
| NaCl、140mM | シグマ/各種 | V900058 | |
| KCl、4.7mM | Sigma/各種 | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/各種 | V900266 | |
| MgCl2 & middot; 6H2O, 1.2mM | Sigma/各種 | M2393 | |
| NaH2PO4、1.2mM | Sigma/各種 | V900060 | |
| HEPES、10mM | Sigma/各種 | V900477 | |
| グルコース、10mM | シグマ/各種 | V900392 | |
| <強力>pH調整用 | |||
| NaOH | シグマ/各種 | V900797 | 純度>=97% |
| KOH | シグマ/各種 | 60371 | 純度>=99.99% |
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