Summary
Objekt Igenkänningstestet (ORT) är en enkel och effektiv analys för bedömning av inlärning och minne hos möss. Metoden som beskrivs nedan.
Abstract
Objekt Igenkänningstestet (ORT) är en vanligt förekommande beteende analys för utredning av olika aspekter av lärande och minne hos möss. ORT är ganska enkel och kan utföras över 3 dagar: tillvänjning dag, utbildningsdag och testing dag. Under träning får musen utforska 2 identiska objekt. På testdagen ersätts ett av objekten som utbildning med ett nytt objekt. Eftersom möss har en inneboende preferens för nyhet, om musen känner igen bekanta objektet, kommer att det tillbringa merparten av sin tid på det nya objektet. På grund av detta medfödda önskemål finns det inget behov av positiv eller negativ förstärkning eller länge träningsscheman. Dessutom kan ORT också ändras för många applikationer. Kvarhållning intervall kan förkortas för att undersöka korttidsminne, eller förlängs för att undersöka långtidsminnet. Farmakologisk intervention kan användas vid olika tillfällen innan träning, efter träning, eller före minns för att undersöka olika faser av lärande (dvs, förvärv, tidig eller sen konsolidering eller återkallande). Övergripande, ORT är en relativt låg stress, effektiv test för minne i möss, och är lämpliga för påvisande av neuropsykologiska förändringar efter farmakologiska, biologiska eller genetiska manipulationer.
Introduction
Igenkänningstestet objekt (ORT), även känd som nya objekt Igenkänningstestet (NOR), är en relativt snabb och effektivt sätt för att testa olika faser av inlärning och minne hos möss. Ursprungligen beskrevs av Ennaceur och Delacour 1988 och används främst i råttor1; sedan dess har det dock varit framgångsrikt anpassade för användning i möss2,3,4,5,6,7. Testet bygger på så få som tre sessioner: en tillvänjning session, ett träningspass och en testomgång. Utbildning innebär helt enkelt visuell utforskning av två identiska objekt, medan testsession handlar om att ersätta ett tidigare utforskade objekt med ett nytt objekt. Eftersom gnagare har en inneboende preferens för nyhet, kommer att en gnagare som kommer ihåg det välbekanta objektet spendera mer tid att utforska den nya objekt7,8,9.
Den största fördelen med ORT över andra gnagare minnestester är att det bygger på gnagare naturliga böjelse för att utforska nyhet8. Därför finns det inget behov av många träningspass eller någon positiv eller negativ förstärkning att motivera beteende. Detta innebär att ORT är mycket mindre stressande, i förhållande till andra tester10,11,12,13,14,15, och kräver avsevärt mindre tid att köra än andra vanliga minne tester, såsom Morris vatten labyrint eller Barnes labyrint, som båda kan ta upp till en vecka eller längre. Följaktligen, villkoren för ORT mer liknar de som används för att studera människans uppfattningsförmåga, ökande ekologiska giltigheten av testet över många andra gnagare minnestester. På samma sätt eftersom ORT är en enkel visuell recall uppgift, har det varit framgångsrikt anpassade för användning i många arter, inklusive människor och icke-mänskliga primater, för att bedöma olika mellan arter aspekter av deklarativa minnet 2,16 ,17. Slutligen, ORT kan enkelt modifieras för att undersöka olika faser av inlärning och minne (dvs, förvärv, konsolidering eller återkallande), att bedöma olika typer av minne (t.ex., rumsliga minne) eller att bedöma olika lagring intervall (dvs, kortsiktiga vs långtidsminne).
Mångsidigheten hos ORT ger en plattform för innumerable forskningsansökningar. Studier kan göra användning av farmakologiska agenter att antingen störa eller förbättra minnet. Varierande tiden av Läkemedelsverket innan eller efter träning, eller före testning kan antyda den underliggande Neurala mekanismer som leder till störd eller förstärkt minne6,18,19, 20. på liknande sätt, optogenetic teknik kan vara används på dessa samma olika tidpunkter för att titta på neural aktivering/hämning som bidrar till de olika faserna av inlärning och minne. ORT är också lämpligt för att bedöma skillnader i transgena djur, i lesionen studier, neurodegenerativa modeller eller i åldrande studier21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28. tiden mellan utbildning och testning, känd som kvarhållning intervall, kan ändras för att bedöma dessa ändringar på kort och lång sikt minne26. I slutändan, ORT kan användas som ett verktyg för att studera farmakologiska, genetiska och neurologiska förändringar till inlärning och minne, eller dessa verktyg kan användas för att studera grunden för inlärning och minne i ORT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla procedurer utförs här lämnades in till och godkänts av den Animal Care använder kommittén och genomfördes efter NIH riktlinjer.
1. objektval och experimentellt ställa in
- Välj objekt som är tillräckligt olika för att diskrimineras enkelt av möss, men har en liknande grad av komplexitet (konsistens, form, färg mallning och ljusstyrka, etc.) för att minimera eventuella inducerad objekt inställning som kan snedvrida resultaten (se Ennaceur 2010 för en utförlig beskrivning av objektet val 7).
- Test för medfödd preferens och diskriminering (se steg 2 & 3).
- Använda objekt som är mus-storlek eller endast något större att uppmuntra utforskning ( figur 1). För att minska inducerad preferens, säkerställa att möss kan klättra på både objekt eller varken objekt, även om förmågan att klättra på ett objekt kan öka intresset för prospektering (tid förbrukade bara sitter på ett objekt inte räknas mot utforskning tid.)
- Har minst 2 kopior av varje objekt. Har dock minst 3 av varje objekt, dubbletter för utbildning och en för testning för att minimera potentiella lukt ledtrådar under testningen,.
- Använda objekt gjorda av icke brytbar material, som förlust av ett objekt på grund av skada under experiment kunde störa kontinuiteten i testning, och potentiellt orsakar skada eller skada djuret.
- Grundligt rengöra objekt före och mellan användning (70% vol/vol etanol är lämplig).
- Att minimera stressen i ljusa belysning, använda diffusa, låg belysning, med centrum i labyrinten upplyst runt 20 lux. Använda en temperatur och luftfuktighet liknar vanlig boendeförhållanden. Om möss flyttas från ett bostäder rum till ett annat rum för experimentet, acklimatisera möss till deras nya rum för minst 1 h före användning varje dag.
- Handtag möss väl före träning. Eftersom testet är beroende av gnagare naturliga tendens att utforska nyhet, minska någon stress eller ångest hantering som kan störa deras önskan att utforska arenan och därefter objekt. Idealiskt, hantera möss 1 - 2 gånger / dag i minst 1 minut, 1 till 2 veckor före testning 15 , 29.
- För huvudarenan, använda en kvadratisk kammare (cirka 40 x 40 cm x 40 cm) tillverkad av vit eller svart, icke-porös plast, i kontrast till färgen på musen. Alternativt kan du använda en rund arena ed. specifikt, när du använder ängslig möss som får sitta i hörnen av en fyrkantig arena, en rund arena kan vara att föredra att uppmuntra undersökande beteende 18 , 30.
- På träningsdag, placera 2 identiska objekt på diagonalen (dvs. en i NW hörnet och en i SE hörnet). Om objekt är för ljus och kan flyttas med musen, fäst dem i golvet. Löstagbar montering kitt fungerar väl.
- För testning dag, använda 3 rd kopia av varje objekt för att placera en bekant objektet och en roman objektet på samma diagonal som training day ( figur 2).
- Motverka användningen av varje uppsättning objekt så att varje objekt används lika ett bekant objekt och som ett nytt objekt. Dessutom motverka placeringen av objektet roman vardera till 4 hörn av arenan. Se till att notera vilka diagonal används för vilket djur så att diagonalen används på Träningsdagen är samma som används på den testing dag, för varje mus.
- Grundligt Rengör apparaten och objekt att ta bort lukt cues före och mellan användning (70% vol/vol etanol är lämplig).
- Placera kameran direkt overhead av apparater för optimal vy av utforskning. Använd endast programvara med näsan-punkt upptäckt för exakt analys. Om du använder programvara, fånga en bakgrundsbild med objekt på plats innan start. Ange området prospektering kommer ca 2-3 cm runt objektet i programvaran,.
- Att minska försöksledaren störningar, registrera rättegången och poäng det senare. Blind målskytten till de experimentella förhållandena. Kontrollera att försöksledaren är mer än 1 meter från arena och inte synlig till musen om scoring manuellt under experimentet,.
Obs: Helst musen spenderar sittande på objektet utan aktiva vibrissae svepande eller sniffa inte räknas som utforskning tid. - Definiera prospektering som när musen ' s buller är pekade mot objektet och inom 2-3 cm av objektet, med aktiv vibrissae svepande eller sniffa. Räknas inte som helst som sitter på objektet utan tecken på aktiv utforskning.
2. Nödvändiga Pilot experiment
- testning för inducerad preferens
- för tillvänjning, ta bort musen från sin hem bur och placera den i mitten av arenan öppen. Låt musen för att fritt utforska för 5 min.
- På Training Day (T1), placera 2 olika objekt i motsatt kvadranter av apparater, (dvs, NW och SE hörn). Ta bort musen från sin hem bur och placera den i mitten av arenan öppen. Tillåta gratis prospektering efter 10 min.
- Beräkna indexet diskriminering. Om det finns ingen inducerad preferens, bör indexet diskriminering vid eller nära noll. Alla objekt som visar preferens bör inte användas för ORT.
- Testning för diskriminering förmåga
- för tillvänjning, ta bort musen från sin hem bur och placera den i mitten av arenan öppen. Låt musen för att fritt utforska för 5 min.
- På träningspasset (T1), placera 2 identiska objekt i motsatt kvadranter. Placera musen i mitten av arenan och låt musen för att utforska för 10 min.
- På test Session (T2), placera en av objektet som används under T1 och ett nytt objekt i motsatt kvadranter (dvs NW och SE hörn). Sextio minuter efter T1, Placera musen i mitten av arenan och låt gratis prospektering efter 10 min.
- Beräkna indexet diskriminering. 60 min kvarhållning intervall, indexet diskriminering bör vara över 0,25.
3. Experimentell förfarande
- tillvänjning
- ta bort musen från sin hem bur och placera den i mitten av arenan öppen, tom. Låt gratis utforskning av arenan för 5 min. När buren är tom, spara den för användning som en anläggning bur nästa dag.
- i slutet av 5 min, ta bort musen och placera i en anläggning bur. Inte tillbaka musen till sin ursprungliga bur, eller detta kan påverka beteendet hos de återstående möss ska testas.
- Rengör apparaten mellan möss använder 70% vol/vol etanol.
Obs: Under tillvänjning, ångest-liknande beteende kan bedömas genom att beräkna tid i centrum (se Prut & Belzung 2003 31). Detta är ett användbart mått när man överväger längden av tid för T1. Högre ångest möss kan kräva en 10 min session för att nå lägsta prospektering kriteriet.
- Utbildning (T1)
- Placera två identiska objekt i motsatt kvadranter på arenan (dvs, Nordöstra hörnet och SW hörnet).
- 24 h efter tillvänjning, ta bort musen från sin hem bur och placera den i mitten av arenan, lika långt från 2 identiska objekt.
- Tillåt gratis prospektering i minst 5 min. Om du använder en stam av möss som är kända för att ha låg rörelseapparaten eller prospektering aktivitet, (dvs. de flesta möss inte når ett minimum av 20 s utforskning av båda objekten av 5 min, som påpekas i pilotförsök eller litteraturen), förlänga provperioden till 10 min för alla mic e i kohorten.
- i slutet av rättegången, ta bort musen och placera i jordbruksföretaget buren. När buren är tom, spara det för användning som innehav buren på testning dag.
- Grundligt Rengör apparaten och föremål mellan möss använder 70% vol/vol etanol.
- Testing (T2)
- Placera ett objekt används under T1 (dvs, det välbekanta objektet) och ett nytt objekt i motsatt kvadranter på arenan. Använd samma platser som används under T1 för varje mus.
- På the T1 T2 intervall av välja, ta bort musen från sin hem bur och placera den i center arena, lika långt från bekant objektet och objektet roman.
Obs: Kvarhållning intervall 24 h, de flesta möss kommer inte att kunna diskriminera mellan det välbekanta och nya objektet (vanligtvis -0,2 < d2 < 0,2, jämfört med en positiv kontroll 32). Om test för nootropa effekter, använda denna tidpunkt sond för minne förbättring. För att undersöka för minne underskott, använda kortare kvarhållning intervall på någonstans mellan 20 min till 4 h, beroende på stam av mus. - Tillåt gratis prospektering efter 10 min. I slutet av rättegången, ta bort musen och placera i jordbruksföretaget buren.
- För både T1 och T2, poäng de första 5 min. Om musen inte uppfyller den minsta utforskning tid 20 s för båda objekten, fortsätta scoring förbi 5 min tills totala prospektering överstiger 20 s.
4. Dataanalys
- Uteslutningskriterier
- både vid utbildning (T1) och testning (T2), beräkna den totala utforskning tid för båda objekten för varje session (e1 och e2). De flesta möss bör nå en minsta utforskning totalt för båda objekten 20 s genom 5 min.
- Utöka T1 och T2 tid till 10 min för stammar av möss som har låg utforskning och inte uppfyller detta lägsta kriterium av 5 min, som observerats under pilottester.
- Poäng beteende för 5 min eller längre än 5 min tills de når 20 s minsta kriteriet.
- Om möss inte når 20 s minst prospektering för både objekt antingen T1 eller T2 på 10 min, utesluta från analys, eftersom det inte kan bekräftas de utforskande tillräckligt tid att lära sig/diskriminera.
- Absoluta vs relativa analys
Obs: olika formler för analys och deras relation till varandra kan ses i tabell 1.- Beräkna e1 som den totala utforskning tid under träning för 2 identiska objekt, där a1 och a2 är identiska objekt.
e1 = a1 + a2 - Beräkna e2 som den totala utforskning tid under testning för objektet bekant (a) och romanen objekt (b).
e2 = a + b - Beräkna d1 helt enkelt tid att utforska romanen objektet minus tid utforskande bekant objektet. Den absoluta diskriminering åtgärden (d1) tar inte hänsyn till skillnader i utforskning tid mellan möss eller behandling grupper, men i vissa omständigheter kan det vara en mer känslig åtgärd 2.
d1 = b-en - Beräkna d2 som den tid att utforska det nya objektet minus tiden utforskande objektet bekant dividerat med totala utforskning tid. Den vanligaste åtgärden är en relativ diskriminering värde ofta som den diskriminering index (d2), som inte påverkas av skillnader i utforskning tid. Detta innebär att alla värden hamnar mellan -1 och + 1.
d2 = d1/e2 - Beräkna alternativt erkännande eller preferens index (d3) 3. Detta är den tid att utforska det nya objektet dividerat med den totala tiden. Detta innebär att alla värden hamnar mellan 0 och 1. Det är ofta multiplicerat med 100 och används som procentvärde.
d3 = b/e2 * 100
- Beräkna e1 som den totala utforskning tid under träning för 2 identiska objekt, där a1 och a2 är identiska objekt.
- Statistikanalys
- med genomsnittlig diskriminering värden för varje grupp, bestämma minnesprestanda med envägs ANOVA. För vidare analys, göra tvåvägs post hoc jämförelser med behandlade vs fordonets skick och positiva/negativa kontrollgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En allmän experimentella inställning för ORT visas i figur 2. På tillvänjning dag (T0) möss är placerade på den tomma scenen för 5 min. tjugofyra timmar senare, möss placeras tillbaka i kammaren med 2 identiska objekt och tillåtet att fritt utforska för upp till 10 min (T1). Vid provtagning dag (T2), är mössen igen placeras i arenan, men med en bekant objekt och en roman-objekt, och att utforska för upp till 10 min. Kvarhållning intervall, kan tiden mellan T1 och T2, ändras, beroende på de ultimata mål av experimentet. I representativa data, eftersom hämmare förväntas förbättra minnet, är mössen testade 24 h efter T1, en tid i vilket fordon bör behandlade möss visar ingen diskriminering.
Fosfodiesteras-2-hämmare har visat sig förbättra inlärning och minne i ORT. Jämfört med fordon, administrering av de PDE2 hämmare Bay 60-7550 eller ND7001 avsevärt förbättrat minne på ett dosberoende sätt, när det ges 30 min innan träning (T1)6 (siffror 3a och 3b). När administreras vid olika tidpunkter i förhållande till utbildning och testning, förbättrar den PDE2 hämmaren Bay 60-7550 avsevärt minne när det ges 30 min innan träning, direkt efter träning, och 30 min före recall (figurerna 4a och 4b ). Detta tyder på att PDE2 hämning förbättrar minne under förvärv eller tidig konsolidering mekanismer och minns6. Möss som används i detta experiment var experiment naiva ICR hanmöss, 6-8 veckor gamla.
När man överväger utformningen av experimentet, finns det ett antal faktorer som måste beaktas. Stam av musen kan kraftigt påverka både utforskning tid och kvarhållning intervall för positiva objekt diskriminering. SıK och kollegor analyseras ett antal vanliga stammar, inklusive C57BL, Swiss, BALB/c och 129/Sv möss30. De visade att det finns en signifikant skillnad i total förberedande tid mellan stammarna, med Swiss och Balb/c att ha högsta förberedande tid och C57BL och 129/sv med lägst förberedande tiden. Detta påverkar värdet absoluta diskriminering (d1). Dessutom kvarhållning intervall visar en betydande minskning över tid, med 129/Sv möss som har det lägsta d2-värdet av de fyra stammarna på 1 h (figur 5). För 129/Sv stam, kan det bero på deras låga utforskning och inte nödvändigtvis deras brist på erkännande. Det bör noteras att i denna studie, forskarna använde en kortare T1 och T2 (3 min per studie), vilket resulterade i endast två av de fyra stammar når 20 s minimitiden för prospektering som föreslås här. Detta lägsta kriterium anses ofta vara kortaste tid som behövs för att lära och utforska den objekt4. Studien citerade här visar vikten av att ha ett sådant minsta kriterium.
Figur 1: prov objekt för användning i ORT. De objekt som används i Lueptow et al. är ganska enkel, men har några skilja har6. Alla artiklar är något större än en normal mus och kan enkelt klättrade på. Visas från vänster till höger är ett uppochnervänt ölglas provsmakning, en leksak byggsten med tejp för konsistens, en kylklamp och en leksak byggblock med en utskjutande ögon fastsättning. Objekt var fast i golvet med flyttbara montering spackel, så att inte att flytta eller spets under utforskning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: experimentell Setup för ORT. Den ORT äger rum över 3 dagar. Den första dagen är tillvänjning (T0), som en mus tillåts att utforska öppna fältet för 5 min. dag 2 är utbildning (T1), i som musen får utforska arenan med 2 identiska objekt placeras längs diagonalen. Testning (T2) äger rum 24 h efter T1 (detta kvarhållning intervall kan göras kortare eller längre, beroende på experimentella förhållanden). Möss är tillåtna att utforska arenan med ett bekant objekt och en roman objekt, placeras längs diagonalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: dosberoende Enhancement minne i ORT. (en) vik 607550 och (b), ND7001, förbättrat när det ges 30 min innan träning, minne på ett dosberoende sätt när tanke, som ses av en ökning av diskriminering index (d2). Staplarna representerar medel ± S.E.M.; n = 10-18 per grupp. p = 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 kontra fordon. Denna siffra har kopierats från Lueptow et al., 20166 med vänligt tillstånd från Springer Science and Business Media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: PDE2 hämning under förvärvet, Early konsolidering eller återkallande avsevärt förbättrat minne i ORT. (en) Bay 607550 (3 mg/kg) avsevärt förbättrat minne när det ges 30 min innan träning (förvärv). (b) Bay 607550 (3 mg/kg) ges omedelbart efter utbildning (konsolidering) eller 30 min före provning (recall) avsevärt förbättrat minne, som ses av en ökning av diskriminering index (d2). Staplarna representerar medelvärde ± S.E.M.; n = 10-18 per grupp. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 kontra fordon. Denna siffra har kopierats från Lueptow et al., 20166 med vänligt tillstånd från Springer Science and Business Media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Sila beroende skillnader i minnet över kvarhållning intervall. Utförandet av C57BL, Swiss, BALB/c och 129/Sv möss på relativa diskriminering index (d2) i en objektet erkännande uppgift på olika förseningar. Alla stammar diskriminerade mellan objekten med 1-h intervall, men inte vid 4 och 24 h intervall. Värdena representerar medelvärdet (±S.E.M.). Området mellan de streckade linjerna anger S.E.M.-spänna av virtuella gruppen (menar: 0, S.E.M.: 0,06). Denna siffra har kopierats från Şık et al. 200330 med tillstånd från Elsevier.
| Prospektering | Diskriminering |
| E1 = a1 + a2 | D1 = b - en |
| E2 = en + b | D2 = d1/e2 |
| D3 = b/e2 * 100 |
Tabell 1: formeln för dataanalys i ORT. E1 är den totala utforskning tid under utbildning. a1 och a2 är tiden på varje identiska objekt under T1. E2 är den totala utforskning tid under testning, där en är bekant objektet och b är det nya objektet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ORT är en effektiv och flexibel metod för att studera lärande och minne hos möss. När du konfigurerar ett experiment, är det viktigt att överväga ett antal variabler som kan påverka resultatet. Som diskuterades i de representativa resultat, kommer att stam av musen påverka både utforskning tid och kvarhållning intervall. En minskning av utforskning tid kan förvränga eller mask resulterar i en absolut diskriminering analys2,3,5,30,32. Vissa stammar av möss kan ha lägre diskriminering värden på kortare kvarhållning intervall, t ex 1 eller 4 h, som kunde dölja utfall om letar försämrat minne. Alternativt, vissa stammar kanske hög diskriminering värden på längre kvarhållning intervall, t ex 24 h, vilket kan maskera effekterna av minne förbättring4,5,30. Förutom stam skillnader är andra biologiska faktorer viktiga att tänka på, inklusive ålder, kön och sjukdomstillstånd (se referenser för vidare läsning20,21,22,23 ,24). Därför kvarhållning intervall måste övervägas noggrant, och en tid-kursen analys är sannolikt nödvändigt att bestämma den mest lämpliga intervallen. Slutligen är det också viktigt att noggrant utvärdera de objekt som används i analysen7. De bör vara testats för att utesluta någon objekt preferens och alltid används i en motviktstruckar sätt att minimera någon inducerad objekt preferens.
Medan ORT är ganska enkel och snabb att använda, har den begränsningar. Eftersom det finns endast ett träningspass, går det inte att analysera potentiella skillnader i graden av lärande. Eftersom endast en session varje utbildning och minns, kan det dock för att studera enskilda faserna av inlärning och minne, till exempel konsolidering eller återkallande. Dessutom de gruppstorlekar som behövs för att uppnå statistisk signifikans med ordentlig makt tenderar att vara ganska hög (ofta 15-20 möss/grupp) och ofta, 2 eller fler möss måste uteslutas på grund av bristen på adekvat utforskning under T1, T2 eller båda. Den tid som behövs för att genomföra analysen är dock ganska korta jämfört med andra tester av minne, vilket tillåter högre genomströmning övergripande. När det gäller neurobiologin som ligger bakom ORT, till skillnad från vissa av de andra testerna av minne, som kan tillskrivas klart en hjärnregionen, ORT verkar göra använda av några regioner i hjärnan och neurotransmittor system, inklusive hippocampus och perirhinal regioner16,17,33,34,35,36,37,38,39. Detta gör det potentiellt svåra att tolka, när det gäller underliggande neurobiologi, men erbjuder också ett rikt område i forskning för att ytterligare förstå.
Medan du kör ORT, kan vissa problem uppstå, såsom brist på prospektering bland vissa stammar eller kohorter av möss, en medfödd objekt preferens som leder till skev prestanda eller brist på effekt på grund av en felaktigt vald tidpunkt. Det är därför mycket viktigt att köra pilotförsök för att identifiera och korrigera eventuella problem. Vissa stammar av möss har högre inneboende ångest, som kan komma att påverka rörelseaktivitet och/eller utforskning tid. Öka antalet exponeringar eller duration av exponering för arenan före träning kan hjälpa lägre ångest och uppmuntra utforskning30. För en längre tillvänjning, öka prospektering till två gånger per dag för 5 min varje gång (6 h intervall) i 3 dagar. Om möss inte når det lägsta kriteriet av 10 min, igen, möss kan vara ängslig, i vilket fall tillvänjning bör tid och/eller hantering ökas för alla möss. Andra orsaker till ångest kan vara från en stressfaktor i bostäder rummet eller i den experimentella rum som bör åtgärdas (buller, lukt, temperatur, belysning, etc.). Om stress och ångest är uteslutet, kanske möss helt enkelt inte intresserade av de valda objekt, i vilket fall nya objekt ska användas. Vid bedömningen av försämrat minne, om kontroll möss inte diskriminerar mellan objekten på valt intervall, Välj en kortare kvarhållning intervall. Vid bedömningen av minnesförbättringar, om kontroll möss diskriminera mellan objekt, Välj ett längre kvarhållning intervall. Om använda farmakologiska agenter med ingen effekt, en dags kurs kan användas att avgöra om det är effektivt i ett annat skede av lärande (t.ex. förvärv, tidig eller sen konsolidering eller återkallande).
Vikten av kör pilotförsök kan inte över anges. Felaktig experimentell design kan leda till antingen falskt positiva eller falskt negativa resultat. Om möss har en inducerad preferens för ett specifikt objekt, kommer detta resultera i möss spendera mer tid på det önskade objektet, helt ändra paradigm och förhindra uttrycket av inlärning och minne. Dessutom kan vissa stammar av möss eller möss med vissa genetiska mutationer har minskat visuella förmågor, som kan potentiellt påverka diskriminering förmåga, oberoende av eventuella kognitiva förändringar. Möss bör därför testas en kortsiktig tidpunkt (dvs.1 h eller mindre), varvid deras kognitiva förmågor skulle tillåta diskriminering.
En gemensam ändring till ORT är att använda en ny plats, i stället för ett nytt objekt. Detta tillåter bedömning av mer rumsligt beroende minne. Under T2, istället för att ersätta ett bekant objekt med ett nytt objekt, flytta en bekant objekt till en ny plats i arenan. Detta kräver tillägg av rumsliga ledtrådar runt arenan. Enkla, stora former eller mönster (t.ex., 8 ”x 12” vita pappersark med 4 ”tjocka svarta ränder; 8” x 12 ”vita pappersark med stor, svart cirkel) bör användas. Använd om möjligt gardiner för att omge labyrinten. Gardiner minimera externa rum ledtrådar som kan förändra hela loppet av experimentet, och tillåta konsekvent och reproducerbart placering av labyrint ledtrådar. De återstående setup och analys är liknande. Alla ekvationer för analys kan förbli densamma, subbing i tid på den nya platsen för tid på det nya objektet. Liknar ORT, en ökning av den tid som tillbringas på objektet i den nya platsen i förhållande till objektet på samma plats är en indikation på minnet.
Det är viktigt att notera att de för närvarande tillgängliga mjukvarusystem inte kan vara perfekt för poängberäkning utforskning. Först, de kräver 3-punkts upptäckt (näsa, kropp och svans) för att korrekt identifiera när näsan är nära objektet, och inte alla programvarupaket kommer med 3-punkts upptäckt. För det andra mösssitter ibland på eller nära objektet utan att aktivt utforska objektet (som påpekas av bristande vibrissae svepande), och programvaran är inte kunna göra sådan diskriminering. Därför är det rekommenderat att spela in videor och få dem hand-gjorde av en blindad försöksledaren vid ett senare tillfälle.
De framtida tillämpningarna av ORT ganska långtgående. I området i närheten finns det goda möjligheter att dissekera de molekylära kaskader och/eller neurala kretsar inblandade i olika faser av inlärning och minne (t.ex., förvärv, tidiga och sena konsolidering). Det kan också användas som en skärm för potentiella nootropa droger, eller när du letar behandlingar mot neurodegenerativa sjukdomar. Det kan också vara användbar för att identifiera rollen av olika genetiska mutationer på inlärning och minne. På grund av dess relativa användarvänlighet, brist på påfrestande förhållanden för möss och ganska kort assay längd, kan det vara ett robust första steg i att identifiera kognitiva förändringar eller ett primära verktyg för analys. Sammantaget är dess potentiella tillämpningar många.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbete ovan och tidigare publicerats av författaren stöddes av ett stipendium från National Institute of Mental Health (MH088480). Författaren vill tacka hennes före detta mentor, Dr. James O'Donnell för hans stöd i detta projekt. Denna publikation stöds av ett stipendium från National Institute of Health (T32 DA007135).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open Field Box | Panlab/Harvard Apparatus | LE800SC | Available in grey, white, or black |
| ANY-maze | Stoelting Co. | 60000 | Behavior tracking system |
| EthoVisionXT 12 | Noldus | Behavior tracking system; requires 3 point tracking | |
| Video Camera | Any | Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned. |
References
- Ennaceur, A., Meliani, K. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav. Brain Res. 51 (1), 83-92 (1988).
- Akkerman, S., et al. Object recognition testing: methodological considerations on exploration and discrimination measures. Behav. Brain Res. 232 (2), 335-347 (2012).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cogn. Process. 13 (2), 93-110 (2012).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nat. Protoc. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- van Goethem, N. P., et al. Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle. Behav. Brain Res. 232 (2), 323-334 (2012).
- Lueptow, L. M., Zhang, C. -G., O'Donnell, J. M. Cyclic GMP-mediated memory enhancement in the object recognition test by inhibitors of phosphodiesterase-2 in mice. Psychopharmacology (Berl). , (2015).
- Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav. Brain Res. 215 (2), 244-254 (2010).
- Berlyne, D. Novelty and curiosity as determinants of exploratory behavior. Br. J. Psychol. 41 (1-2), 68-80 (1950).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats I. Behavioral-data. Behav. Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Aguilar-Valles, A., et al. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology. 82 (5-6), 306-319 (2005).
- Anisman, H., Hayley, S., Kelly, O., Borowski, T., Merali, Z. Psychogenic, neurogenic, and systemic stressor effects on plasma corticosterone and behavior: Mouse strain-dependent outcomes. Behav. Neurosci. 115 (2), 443-454 (2001).
- Kim, J. J., Diamond, D. M. The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat. Rev. Neurosci. 3 (6), 453-462 (2002).
- Willner, P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10 year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl). 134, 319-329 (1997).
- Leussis, M. P., Bolivar, V. J. Habituation in rodents: A review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (7), 1045-1064 (2006).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat. Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Dere, E., Huston, J. P., De Souza Silva, M. A. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 31, 673-704 (2007).
- Winters, B. D., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Object recognition memory: Neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav. Rev. 32, 1055-1070 (2008).
- Rutten, K., et al. Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 558 (1-3), 107-112 (2007).
- Prickaerts, J., De Vente, J., Honig, W., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur. J. Pharmacol. 436 (1-2), 83-87 (2002).
- Bertaina-Anglade, V., Enjuanes, E., Morillon, D., Drieu la Rochelle, C. The object recognition task in rats and mice: A simple and rapid model in safety pharmacology to detect amnesic properties of a new chemical entity. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 54 (2), 99-105 (2006).
- Li, S., Wang, C., Wang, W., Dong, H., Hou, P., Tang, Y. Chronic mild stress impairs cognition in mice: From brain homeostasis to behavior. Life Sci. 82 (17), 934-942 (2008).
- Frick, K. M., Gresack, J. E. Sex Differences in the Behavioral Response to Spatial and Object Novelty in Adult C57BL/6 Mice. Behav. Neurosci. 117 (6), 1283-1291 (2003).
- Grayson, B., Leger, M., Piercy, C., Adamson, L., Harte, M., Neill, J. C. Assessment of disease-related cognitive impairments using the novel object recognition (NOR) task in rodents. Behav. Brain Res. 285, 176-193 (2015).
- Tuscher, J. J., Fortress, A. M., Kim, J., Frick, K. M. Regulation of object recognition and object placement by ovarian sex steroid hormones. Behav. Brain Res. 285, 140-157 (2015).
- Balderas, I., Moreno-Castilla, P., Bermudez-Rattoni, F. Dopamine D1 receptor activity modulates object recognition memory consolidation in the perirhinal cortex but not in the hippocampus. Hippocampus. 23 (10), 873-878 (2013).
- Akkerman, S., Blokland, A., Prickaerts, J. Mind the gap: delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors. Neurobiol. Learn. Mem. 109, 139-143 (2014).
- Domek-Łopacińska, K., Strosznajder, J. B. The effect of selective inhibition of cyclic GMP hydrolyzing phosphodiesterases 2 and 5 on learning and memory processes and nitric oxide synthase activity in brain during aging. Brain Res. 1216, 68-77 (2008).
- Reneerkens, O., et al. Inhibition of phoshodiesterase type 2 or type 10 reverses object memory deficits induced by scopolamine or MK-801. Behav. Brain Res. 236 (1), 16-22 (2013).
- Deacon, R. M. J. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat. Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Şık, A., van Nieuwehuyzen, P., Prickaerts, J., Blokland, A. Performance of different mouse strains in an object recognition task. Behav. Brain Res. 147 (1-2), 49-54 (2003).
- Prut, L., Belzung, C., Rabelias, U. F., Psychobiologie, E. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors a review. Eur. J. Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Akkerman, S., Prickaerts, J., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. Object recognition testing: statistical considerations. Behav. Brain Res. 232 (2), 317-322 (2012).
- Balderas, I., Rodriguez-Ortiz, C. J., Bermudez-Rattoni, F. Retrieval and reconsolidation of object recognition memory are independent processes in the perirhinal cortex. Neuroscience. 253, 398-405 (2013).
- de curtis, M., Pare, D. The rhinal cortices: a wall of inhibition between the neocortex and the hippocampus. Prog. Neurobiol. 74 (2), 101-110 (2004).
- Brown, M. W., Barker, G. R. I., Aggleton, J. P., Warburton, E. C. What pharmacological interventions indicate concerning the role of the perirhinal cortex in recognition memory. Neuropsychologia. 50 (13), 3122-3140 (2012).
- Moore, S. J., Deshpande, K., Stinnett, G. S., Seasholtz, A. F., Murphy, G. G. Conversion of short-term to long-term memory in the novel object recognition paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 105, 174-185 (2013).
- Suzuki, W. A. The anatomy, physiology and functions of the perirhinal cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 179-186 (1996).
- Wan, H., Aggleton, J. P., Brown, M. W. Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J. Neurosci. 19 (3), 1142-1148 (1999).
- Warburton, E. C., Brown, M. W. Findings from animals concerning when interactions between perirhinal cortex, hippocampus and medial prefrontal cortex are necessary for recognition memory. Neuropsychologia. 48 (8), 2262-2272 (2010).
