Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Integration af miniaturiseret fastfaseekstraktion og LC-MS / MS-detektion af 3-nitrotyrosin i human urin til kliniske applikationer

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

En selektiv og følsom væskekromatografi-tandemmassespektrometri-metode (LC-MS / MS) kombineret med en effektiv fastfaseekstraktion på en mikronpladet 96-brønds mixplast med blandet tilstand (MCX) blev udviklet til måling af frit 3-nitrotyrosin ( 3-NT) i human urin med høj gennemstrømning, som er egnet til kliniske anvendelser.

Abstract

Gratis 3-nitrotyrosin (3-NT) er blevet udbredt som en mulig biomarkør for oxidativ stress. Øgede niveauer af 3-NT er blevet rapporteret i en lang række patologiske tilstande. Eksisterende metoder mangler imidlertid den tilstrækkelige følsomhed og / eller specificitet, der er nødvendig for at måle det lave endogene niveau af 3-NT pålideligt og er for besværligt til kliniske anvendelser. Derfor er det nødvendigt med analytisk forbedring for nøjagtigt at kvantificere niveauerne af 3-NT og verificere 3-NTs rolle i patologiske tilstande. Denne protokol præsenterer udviklingen af ​​en ny væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) detektion kombineret med en miniaturiseret fastfase-ekstraktion (SPE) til hurtig og præcis måling af 3-NT i human urin som en ikke-invasiv biomarkør Til oxidativ stress. SPE ved hjælp af en 96-brønds plade forenklet processen markant ved at kombinere prøveoprensning og analyt berigelse uden kedelige derivatisering og fordampningstrin, Reducering af opløsningsmiddelforbrug, bortskaffelse af affald, risiko for forurening og samlet behandlingstid. Beskæftigelse af 25 mM ammoniumacetat (NH4OAc) ved pH 9 som SPE elueringsopløsningen væsentligt forbedret selektivitet. Massespektrometrisignalrespons blev forbedret ved tilpasning af multiple reaktionsovervågning (MRM) overgange. Anvendelse af 0,01% HCOOH som additiv på en pentafluorphenyl (PFP) søjle (150 mm x 2,1 mm, 3 um) forbedrede signalresponsen en anden 2,5 gange og forkortet den samlede driftstid til 7 min. En lavere grænseværdi for kvantificering (LLOQ) på 10 pg / ml (0,044 nM) blev opnået, hvilket repræsenterer en signifikant følsomhedsforbedring over de rapporterede analyser. Denne forenklede, hurtige, selektive og følsomme metode tillader to plader af urinprøver (n = 192) at blive behandlet i en 24 h tidsperiode. I betragtning af den markant forbedrede analytiske ydeevne og ikke-invasiv og billig urinprøveudtagning er det foreslåede assay gavnligt for præklinisk og kliniskundersøgelser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Effekten af ​​oxidativ stress på klinisk præsentation er blevet fremmet i forkant de seneste år 1 . En af de biomarkører, der udforskes, er 3-nitrotyrosin (3-NT), et slutstabilt produkt, der dannes, når reaktive nitrogenarter (RNS) interagerer med tyrosin, en catecholamin neurotransmitterprecursor. Mens 3-NT kan have klinisk værdi som biomarkør for RNS in vivo, kan de væsentlige ændringer af tyrosins egenskaber og funktioner påvirke tilsvarende proteiner og cellefunktioner 1 , 2 . Ny forskning har antydet, at 3-NT kan spille en vigtig rolle i inflammatoriske tilstande 3 , neurodegenerative lidelser 4 , 5 , kardiovaskulær sygdom 6 og diabetes 7 samt tilstande relateret til oxidativ stress. Men disse obseRvationer er baseret på resultater fra metoder, der mangler følsomhed og / eller selektivitet 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme 3-NT koncentrationsområder for de biologiske prøver, der tidligere er rapporteret i litteraturen, viser, at alvorlige analytiske problemer er forbundet med disse analyser, og teknisk forbedring er nødvendig for nøjagtigt at kvantificere niveauerne af 3-NT og verificere sin rolle i patologien af ​​disse betingelser .

Kvantitering af gratis 3-NT i biologiske matricer præsenterer en særlig udfordring for mand og instrument 8 , 9 , 10 , 11 . For det første kræver sporingsniveauet for endogen 3-NT en ultrafølsom detektion; For det andet eksisterer adskillige strukturelt lignende analoger, især tyrosin, som er til stede iStort overskud kræver en høj grad af selektivitet For det tredje kræver den artefaktuelle dannelse af 3-NT ved tyrosinitrering med allestedsnærværende nitrat og nitrit særlig hensyntagen under prøvefremstilling for at undgå falsk overestimering af 3-NT.

Blandt en lang række metoder, der anvendes til at måle 3-NT, er MS / MS blevet betragtet som guldstandardmetoden på grund af sin overlegne følsomhed og selektivitet 11 , 12 , 13 , 14 . Gaskromatografi (GC) koblet MS / MS giver den bedste følsomhed, men de uundværlige prøve derivatiseringstrin er for kedelige og tidskrævende for at være effektive til klinisk nytteværdi 15 , 16 . LC-MS / MS kræver ikke kompleks prøve derivatisering, hvilket gør det mere lovende valg. Ikke desto mindre er der flere forhindringer at overvinde som seNsitiviteten af ​​LC-MS / MS-metoder, der er rapporteret i litteraturen, skal forbedres til måling af lavt rigeligt 3-NT 7 , 17 , 18, og den relativt lange vendingstid skal afkortes for applikationer med høj gennemstrømning 12 , 13 , 17 , 19 .

Desuden spiller den anvendte biologiske matrix en vigtig rolle, når man overvejer kliniske anvendelser. Det skal være nemt og billigt at opnå og ikke-invasiv hvis det er muligt 20 , 21 , 22 . Plasma, den traditionelt anvendte prøve i litteraturen, er ikke en klinisk ønskelig matrix, så man søgte en metode, der anvender urin, som ikke er invasiv og omkostningseffektiv.

Flere forsøg på at udvikle relIable og specifikke LC-MS / MS metoder er blevet lavet ved brug af urin 9 , 10 , 11 . De har dog alle været utilstrækkelige til at være selektive, pålidelige eller effektive nok til klinisk brug. Effektiviteten af ​​den overvejende SPE ved anvendelse af traditionel reverseret fasepatron (C18 type) som prøveoprensning til 3-NT-analysen er blevet stillet, og en sekventiel SPE af stærk kationbytter (SCX) og omvendt fase C18-OH er blevet foreslået 6 , 7 , 19 . En nyligt udviklet LC-MS / MS-metode anvendte en multi-trin rensningsproces med manuel C18 SPE, præparativ højtryksvæskekromatografi (HPLC) og online SPE til analyse af 3-NT 23 . Selvom denne metode var følsom nok til kliniske formål, med en LLOQ på 0,041 nM, var oprydningsprocessen intensiv og kedelig og krævedeRød 3 ml urin, hvilket begrænser dets gennemførlighed for høj gennemstrømning. En molekylært aftrykt polymer blev anvendt som SPE-sorbenten for at forbedre effektiviteten af ​​oprydningsprocessen 14 , men den resulterende LLOQ (0,7 μg / ml) var ikke lav nok til kliniske prøver. En anden metode krævede todimensionel (2D) LC-MS / MS og immunaffinitetskromatografi til prøveoprensning for at opnå en detektionsgrænse (LOD) på 0,022 nM 24 . Mens alle disse metoder har gjort fremskridt i vurderingen af ​​3-NT, har ingen opnået følsomheden, pålideligheden og effektiviteten, der er nødvendig for kliniske anvendelser.

For at undersøge patologien omkring gratis 3-NT og dets rolle som biomarkør af oxidativ stress i kliniske omgivelser har vi udviklet en metode, der er enkel, effektiv, præcis og præcis, hvilket muliggør kliniske applikationer med høj gennemløb 25 . En miniaturiseret blandet mode kation eksk(MCX) 96-brønds ekstraktionsmikroplade blev implementeret for at opnå enkel og effektiv prøveoprensning og berigelse af 3-NT i en enkelt ekstraktion omgå de ulemper, der ses i de eksisterende metoder, der kræver derivatisering, fordampning og 2D-LC. Væskekromatografi med 0,01% HCOOH som additiv i mobilfase gav et forbedret signalrespons med en hurtig cykeltid. Selektivitet blev yderligere forbedret ved anvendelse af en mild NH4OAc elueringsopløsning til selektiv eluering af 3-NT, og anvendelse af MRM overgang for både 3-NT og den interne standard (IS). Matrixeffekten blev kompenseret ved anvendelse af en reduceret mængde af en foretrukken 13C-mærket isotopisk IS til kvantificering. Med fremkomsten af ​​denne metode vil forskere og klinikere kunne kontrollere 3-NT's rolle i kliniske forhold og yderligere undersøge virkningen af ​​oxidativt stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle undersøgelser, der involverede urinprøver fra mennesker, blev gennemført i overensstemmelse med proceduren godkendt af Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Urinprøveopsamling og kreatinin (Cr) bestemmelse

  1. Saml 5 ml af de næste morgen urinprøver efter ca. 10 timer natten over fastende i et 5 ml transportrør A indeholdende 250 μl 3 N HCI som konserveringsmiddel og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
  2. Tø og hvirvel 5 ml transporturin Et rør og centrifuge i en centrifuge ( f.eks. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquot 1 ml urin to gange fra 5 ml transportrør A.
  4. Bestem Cr ved en urin kreatinin metode 26 .

2. Forberedelse af standard, IS og Quality Control (QC) prøver

  1. Forbered en stamopløsning af 3-NT ved 100 μg / mL i vand med 0,01% HCOOH mobil fase A (MA) og opbevar ved -20 ° C.
  2. LaveEn 3-NT-arbejdsstandardopløsning ved koncentration på 100 ng / ml ved fortynding af 100 μg / ml 3-NT stamopløsning med MA.
  3. Generere standarder, der spænder fra 5 til 2500 pg / ml ved fortynding af 100 ng / mL-arbejdsstandarden med 0,15 M HCI syrnet blank urin fri for 3-NT sammen med tomme og dobbeltblanke prøver.
  4. Forbered en stamopløsning af IS 13 C 9 -3-NT ved 100 μg / ml i vand med MA og opbevar ved -20 ° C.
  5. Lav en IS-arbejdsopløsning ved 500 pg / ml ved fortynding af 100 μg / ml 13 C 9 -3-NT IS stamopløsningen med MA.
  6. Etablere fem niveauer af QC-prøver, der dækker LLOQ, lavt, mellemt og højt niveau ( dvs. 10, 25, 100, 500 og 1.250 pg / mL) ved fortynding af 3-NT-arbejdsstandard i den forsurede tomme urin.

3. Fastfaseekstraktionsprocedure

  1. Thaw og vortex urinprøver, standarder og QC prøver.
  2. Tilføj urinprøver, standarder og QC sampLes (250 μl hver) til 32 brønde af en ren 2 ml 96-brøndsopsamlingsplade.
  3. Indfør 500 pg / ml IS-arbejdsløsningen (50 μl) til hver brønd undtagen dobbeltblankt prøvebrønd. Tilsæt 0,01% HCOOH (50 μl) til prøven med dobbeltblankt prøve.
  4. Tilsæt LC-MS / MS vand med 0,1% HCOOH (250 μl).
  5. Bland ovennævnte blanding med en 8-kanals pipette tre gange.
  6. Dæk pladen, indtil SPE indlæses.
  7. Anbring en MCX 96-brønds ekstraktionsplade og et opsamlingsreservoir på en positivtryksprocessor.
  8. Tilsæt ekstraktionspladen med flydende MeOH (200 μL) gennem sorbenten.
  9. Equilibrere ved at flyde vand med 2% HCOOH (200 μL) gennem sorbenten.
  10. Indsæt hele volumenet af hver af de præblandede prøver forsigtigt på den forkonditionerede ekstraktionsplade forsigtigt med en 8-kanals pipette.
  11. Indstil lavt positivt tryk ( f.eks . 3 psi) på den positive trykprocessor for at lade blandingen strømme thrOugh sorbenten langsomt, juster trykket om nødvendigt.
  12. Vask brøndene ved at flyde vand med 2% HCOOH (200 μL) gennem sorbenten.
  13. Vask brøndene ved at flyde methanol (200 μL) gennem sorbenten.
  14. Vask brøndene ved at flyde vand (200 μL) gennem sorbenten.
  15. Tør brøndene fuldstændigt med høj positiv trykindstilling ( f.eks . 40 psi) på positivtryksprocessoren.
  16. Udskift reservoiret med en ren 2 ml 96-brønds samleplade.
  17. Anvende 25 mM NH4OAc ved pH 9 (50 pi) for at eluere tilbageholdt analyt og IS fra udvinding pladen.
  18. Pipette LC-MS vand med 5% HCOOH (50 μl) for at neutralisere eluatet.
  19. Bland med 8-kanals pipetten tre gange og send til LC-MS / MS station til analyse.

4. LC-MS / MS-analyse

  1. Mål nøjagtigt 2.000 ml LC-MS vand med en gradueret cylinder og overfør den til en 2 L flaske.
  2. PIpette 200 μL ren HCOOH i ovennævnte flaske indeholdende LC-MS vand.
  3. Bland grundigt og mærkning som mobil fase A (MA). Inkluder initialer, forberedelsesdato og udløbsdato.
  4. Tag en 2 L flaske LC-MS methanol og mærkning som mobil fase B (MB) med startdato og udløbsdato.
  5. Indstil temperaturen for auto-sampler til 4 ° C.
  6. Placer samlepladen med forberedte prøver i autosampleren.
  7. Placer en PFP-søjle (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) og beskytt kolonne i ovnen.
  8. Indstil ovntemperaturen til 30 ° C.
  9. Equilibrere 10 minutter ved anvendelse af opkøbsmetoden med LC-gradientelueringen som vist i tabel 1 .
Tid (min) Modul Begivenheder Parameter
0 Pumper Pumpe B Conc. 5
0,5 Pumper Pumpe B Conc. 20
1 Pumper Pumpe B Conc. 50
3 Pumper Pumpe B Conc. 80
4 Pumper Pumpe B Conc. 90
4.01 Pumper Pumpe B Conc. 95
5.5 Pumper Pumpe B Conc. 95
5.6 Pumper Pumpe B Conc. 5
7 Controller Hold op

Tabel 1: Væskekromatografi Gradientelueringsbetingelser

  1. Opret en batch liste inklusiveStandarder, QC og urinprøver.
  2. Start partiet ved injektion af de fremstillede prøver (12 μl).

5. Peak Identifikation, Integration og Data Process

  1. Styr dataindsamling og -behandling ved hjælp af softwaren.
  2. Identificer og integrér 3-NT og IS-toppe for alle prøverne.
  3. Etablering af en standardkurve med intervallet 10-2.500 pg / ml til 3-NT kvantificering ved lineær regression af topparealforholdet 3 NT og IS versus den nominelle 3-NT koncentration med en vægtningsfaktor på 1 / x.
  4. Kvantificer alle prøver ved hjælp af standardkurven.
  5. Bestem, om QC-prøverne falder inden for det etablerede område.
  6. Konverter de påviste koncentrationer af urinprøver til endelige resultater i enheden af ​​nM eller nmol / mmol Cr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 illustrerer, at 3-NT er fuldstændigt chromatografisk adskilt fra andre strukturelt ensartede tyrosinanaloger under den optimerede LC-tilstand, hvilket eliminerer de co-eluerende interferenser som følge af disse meget overskydende forbindelser og følgelig forbedrer graden af ​​assayselektivitet. Derudover tillader gradientelueringen med 0,01% HCOOH som additiv i MA og methanol ved en strømningshastighed på 0,45 ml / min hurtig eluering af 3-NT ( dvs. 3 min med en omdrejningstid på 7 minutter).

figur 1
Figur 1: Baseline LC-kromatografisk separation af 3-NT fra andre tyrosinanaloger i en standardopløsning. ( A ) p- Tyrosin; ( B ) m- Tyrosin; ( C ) o -Tyrosin; ( D ) Cl-tyrosin; ( E ) 3-NT. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2 viser, at ingen 3-NT-signal observeres i dobbeltblindprøven, hvilket indikerer ingen dannelse af artefaktuel 3-NT under hele processen. Figur 3 illustrerer repræsentative MRM kromatogrammer af 3-NT og IS for en sund individ. Som det kan ses, observeres ingen interfererende signaler ved retentionstiderne for 3-NT og IS. Endvidere blev der observeret mindre end ± 6% forskel i 3-NT mellem de ikke-spikede og spiked poolede urinprøver med nitrit (50 μM), nitrat (50 μM) og tyrosin (50 mg / L) 25 , hvilket yderligere yder støtte Til analysens specificitet.


Figur 2: MRM kromatogrammer af 3-NT og IS i en repræsentativ dobbelt blank prøve. ( A ) 3-NT MRM-kvantifier 227,0> 90,0; ( B ) er MRM-kvantifikator 236,0> 189,0. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: MRM-kromatogrammer af 3-NT og IS i en repræsentativ urinprøve af sunde mennesker. ( A ) 3-NT MRM-kvantifier 227,0> 90,0; ( B ) er MRM-kvantifikator 236,0> 189,0. Venligst klik på hanIgen for at se en større version af denne figur.

Standardkurven blev etableret ved ekstraktion af forsuret tom urin spidset med 3-NT i intervallet 10-2.500 pg / ml ved at udforme topparealforholdet på 3 NT og IS versus den nominelle koncentration af 3-NT med en lineær montering Af 1 / x vægtning. En repræsentativ standardkurve er vist i figur 4 . LOD defineret som den laveste koncentration med et signal-støjforhold på mere end tre blev bestemt til at være 2 pg / ml (0,0088 nM). LLOQ'en blev bestemt til at være 10 pg / ml (0,044 nM) pr. Definition som den laveste koncentration, der skal måles inden for ± 20% upræcision og nøjagtighed med signal-støjforholdet større end ti.

Figur 4
Figur 4: En repræsentativ 3-NT standardkurve iOmråde på 10-2.500 pg / ml. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Væsentlige variationer i koncentrationer, der tidligere er rapporteret i litteraturen for det endogene frie 3-NT i humane urinprøver, afslører metodologiske problemer forbundet med tilgængelige analyser 8 , 9 , 10 , 11 . Nøjagtig bestemmelse af det lave basale niveau af 3-NT i human urin forbliver en udfordrende opgave, der kræver særlige forholdsregler for prøvepræparation og LC-MS / MS analyse. Denne protokol beskriver en ny SPE-procedure kombineret med en selektiv LC-MS / MS detektion, der tillader den specifikke og følsomme bestemmelse af urin 3-NT med høj gennemstrømning.

Omhyggeligt udvalg af MRM-parametre forbedrede selektiviteten til påvisning af 3-NT. MRM-overgangen m / z 236,0> 96,0 af IS for 3-NT i plasma 27 forårsagede alvorlig kontaminering for urinprøver. En renere 9-gangs stigning i signaletRespons blev opnået med MRM overgang m / z 236,0> 189,0. MRM overgang m / z 227,0> 90,0 blev valgt til 3-NT kvantificering på grund af alvorlig interferens ved anvendelse af den mest intensive overgang m / z 227,0> 181,0. De detaljerede MRM-overgange og sammensatte parametre er opsummeret i tabel 2 .

analysand MRM overgang (m / z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V)
3-NT (kvantifier) 227,0> 90,0 50 10 38 13
3-NT (kvalifikator) 227,0> 103,9 50 10 45 16
13C 9 -NT (IS) 236,0> 189,0 50 10 21 14
En ionspændingsspænding: 2200 V; Temperatur: 600 ° C; Gardingas: 35; CAD gas: 9; Nebulisatorgas (GS1): 50; Varmelegeme (GS2): 55.

Tabel 2: Optimerede MRM betingelser.

Den traditionelle C18-type søjle, der almindeligvis anvendes til LC-kromatografisk adskillelse af 3-NT i litteraturen 12 , 13 , 17 , 19 krævede typisk en lang omdrejningstid for at reducere interferens, hvilket gør det ufremmende for høj gennemstrømning. I denne protokol blev en PFP-søjle anvendt til optimering af LC-kromatografisk separation af 3-NT baseret på dets forbedrede retention af polære forbindelser 22 ,> 27 , 28 . Koncentrationen af ​​mobilfaseadditiver har en vigtig indflydelse på signalintensiteten 25 , 28 . HCOOH ved 0,01% viste sig at være det optimale additiv i MA, da det resulterede i en 2,5 gange signalforøgelse over 0,1% koncentration og yderligere fald i koncentrationsredukt signalrespons. En gradientelueringsprofil ved anvendelse af 0,01% HCOOH i vand (MA) og methanol (MB) blev etableret med en strømningshastighed på 0,45 ml / min, hvilket opnåede en optimal separation og hurtig eluering af 3-NT inden for 3 min med en samlet løbetid på Kun 7 minutter, hvilket muliggør signifikant hurtigere analyse af 3-NT i komplicerede biologiske matricer end rapporteret i litteraturen 12 , 13 , 17 , 19 .

At afhjælpe ineffektiviteten af ​​den traditionelle revers-fase patron (C18 type) sOvervejende anvendt til SPE af biologiske prøver 6 , 7 , udviklede vi for nylig en LC-MS / MS-metode til bestemmelse af 3-NT i human plasma af SPE på en enkelt dobbeltfunktionel 96-brønd MCX plade 27 , hvilket resulterede i forbedringer i SPE Effektivitet og selektivitet. En tydelig ulempe ved alle SPE-tilgange i litteraturen er imidlertid besværlige og risikoforbundne fordampnings- og rekonstitutionstrin. Derudover krævede plasmametoden en ekstra forvaskning af ekstraktionspladen for at eliminere forurening fra sorbenten. I denne protokol er disse ulemper blevet elimineret af en skræddersyet SPE ved anvendelse af en miniaturiseret 96-brønds mikroplade. Udvælgelsen af ​​elueringsopløsning viste sig at være afgørende for udvindingseffektiviteten. Betydelige interferenser blev observeret i urinprøver ved at anvende den fælles NH4OH elueringsopløsning med varieret sammensætning MeOH. Det blev hypoteseret, at interferereing stoffer blev co-elueret med analytten på grund af den stærke eluering magt methanolisk NH4OH elueringsopløsning og forårsager den lave selektivitet. For at forbedre selektiviteten var det nødvendigt at identificere en løsning, der ville være både stærk nok til at eluere 3-NT og svag nok til ikke at forårsage eluering af interfererende forbindelser. Efter detaljeret undersøgelse af mindre basisk NH4OAc ved forskellige pH og koncentrationer, der blev fundet en 25 mM NH4OAc opløsning med pH 9 at være optimal som elueringsopløsning. Med den optimerede elueringsopløsning, blev spørgsmålet om interfererende forbindelser løst, og en 40% gevinst i følsomhed blev opnået forhold til den almindelige methanolisk NH4OH elueringsopløsning.

Tabel 3 giver et detaljeret resumé af den analytiske ydeevne af denne protokol 25 sammenlignet med andre tilgængelige metoder til bestemmelse af det frie 3-NT i biologiske matricer. Denne protokol af Har flere forskellige fordele i forhold til tidligere rapporterede analyser. For det første blev der ved anvendelse af 96-brønds ekstraktionsmikropladen opnået et enkelt trin for prøveoprensning og analyt-berigelse, idet man undgår 1 - 5 cyklusser for fordampning og rekonstituering, der typisk kræves i 3-NT-metoderne, der involverer SPE. For det andet blev opløsningsmiddelforbruget pr. Prøve for SPE drastisk reduceret, fra 5,5-118 ml til kun 1,1 ml, hvilket repræsenterer en 5-107 gange reduktion i opløsningsmiddel og bortskaffelse af affald. For det tredje blev LC-omladningstiden pr. Prøve nedsat 2-7 gange sammenlignet med andre analyser og var 30% hurtigere end vores tidligere plasmametode. Fjerde, en 10-3,000 gange lavere mængde af den foretrukne 13C-mærket IS var nødvendig for kompensation af matrix virkning. Til sidst repræsenterer dette assay en signifikant følsomhedsforbedring i forhold til andre konventionelle SPE-baserede LC-MS / MS metoder til kvantificering af urin 3-NT.

måder "> Prøveforberedelse Analytisk
metode
Matrix LOD (nM) LOQ (nM) LC løb (min) Evap c Sol d (ml) IS (ng) Ref. SPE (C18)
+ filtrering LC-MS / MS Plasma 0,034 0,112 20 1 13 Analog f 2 [6] SPE
(MCX plade) LC-MS / MS Plasma 0,0088 0,022 10 1 5.6 13 C 9 -NT 0,25 [27] PPT + SPE (MCX) + der a HPLC-UV Serum NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC + der a GC-MS / MS Urin 0,004 0,125 NA b 5 NA b D 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE (amino) + der a LC-MS / MS Kat urin NA b 14.5 40 3 23 D 3 -NT 75 [17] PPT + hydrolyse + SPE (SCX-C18) LC-MS / MS Urin (protein) 400 NA 50 2 118 D 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS Urin 0,022 NA 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0,85 [24] SPE (C18) + hydrolyse HPLC-ECD Urin (total) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [13] SPE (C18) + Prep LC g
+ Online SPE LC-MS / MS Urin 0,0088 0,041 30 2 38 D 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) HPLC-UV Spiked Urin 700 NA 20 18 NA b NA b [14] SPE (MCX μEution) LC-MS / MS Urin 0,0088 0,044 7 INGEN 1.1 13 C 9 -NT 0.03 Dette arbejde A der: derivatisering; B NA: ikke tilgængelig; C Evap: Fordampning; D Sol: Opløsningsmiddel pr. Prøve; E IA-2D LC: immunaffinitetskromatografi og todimensionel LC; F Analog: o-methyl-tyrosin; G Prep LC: præparativ HPLC oprensning.

Tabel 3: CompariSøn af denne protokols analytiske ydeevne med eksisterende analyser til detektion af 3-NT i biologiske matricer

Analytisk og klinisk validitet af det foreslåede assay blev yderligere vurderet ved bestemmelse af referenceintervallet for urin 3-NT, der blev etableret ud fra de autentiske urinprøver af 82 raske mennesker 25 . Den forbedrede enkeltheds- og gennemløbsmetode gør det muligt at behandle og analysere to plader af urinprøver (n = 192) i en 24 h tidsperiode. Den udviklede metode, der benytter den ikke-invasive urinprøveudtagning, er enkel, hurtig, følsom og selektiv, forventes at være et kraftfuldt værktøj til at verificere 3-NTs rolle i kliniske forhold og yderligere undersøge virkningen af ​​oxidativt stress. Protokollens kritiske trin indbefatter SPE på en MCX-mikroplade ved anvendelse af en mild NH4OAc som elueringsbuffer, LC-adskillelse på en PFP-søjle med 0,01% HCOOH som et additiv og MRM-selektion for 3-NT quantification. Fremtidig anvendelse af metoden er at kvantificere 3-NT koncentrationer hos patienter med patologiske tilstande som inflammatoriske og neurodegenerative lidelser mv . Potentielle faldgruber i den foreslåede protokol til kliniske anvendelser skal fortsat behandles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne ville anerkende Scott Howard og Abigail Marinack for generel støtte og koordinering af dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52, (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87, (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61, (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111, (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33, (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44, (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25, (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851, (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42, (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33, (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26, (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217, (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40, (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276, (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827, (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75, (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799, (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181, (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35, (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406, (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28, (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380, (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407, (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
Integration af miniaturiseret fastfaseekstraktion og LC-MS / MS-detektion af 3-nitrotyrosin i human urin til kliniske applikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter