Summary
قمنا بتطوير طريقة لإزالة بنجاح، عملية، قسم، وصمة عار، للتقييم الأنسجة، الأنسجة الثديية التي كانت أصلا تم إصلاحها على الشرائح كما يتصاعد كله. هذا الأسلوب قد تعزز جمع وتقييم الغدة الثديية يتصاعد كله في الدراسات الإرشادية الإنجابية والتنموية اختبار.
Abstract
قد يتغير تطور الغدة الثديية العادية عن طريق التعرض للمواد السامة والبيئية، والتعرض المفرط للهرمونات، والتغيرات الجينية. الغدة الثديية يتصاعد كله هي وسيلة غير مكلفة لالتقاط تطور التغيرات المورفولوجية التي قد تنشأ بعد التعرض. ومع ذلك، في الحياة في وقت لاحق، عندما تشوهات أكثر عرضة للتطور، والاعتماد الوحيد على هذه الطريقة واحدة قد لا توفر دائما ما يكفي من المعلومات لإجراء التشخيص المناسب للشذوذ. تاريخيا، في الدراسات التوجيهية اختبار الكيمياء اختبار، يتم إزالة الغدة الثديية واحدة في التشريح وإعدادها على شكل هيماتوكسيلين و يوسين (H & E) -insted القسم. دمج المقابل الثديي بأكمله جبل جمع وتحليل يقلل من احتمال تقييم سلبية كاذبة. تقييم جبل كله يقتصر وجود واحد أو اثنين من الغدد الثديية بأكملها على شريحة، وفي بعض الحالات، فإن تشوهات لوحظ في جبل كله لاt ممثلة بشكل موحد في قسم H & E. وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير بروتوكول لتحويل يتصاعد كامل الثديي كوفيرسليبد إلى أقسام H & E الملون بحيث الآفات التي من شأنها أن تكون قد غاب عن ذلك أو التي يصعب تشخيصها يمكن تحديدها. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة لإنتاج عالية الجودة، جزءا لا يتجزأ من البارافين H & E القسم من الغدة الثديية التي تم إعدادها في البداية كما جبل بأكمله. بالمقارنة مع الأنسجة التي أعدت عمدا ل H & E سيكتيونينغ، جبل كله يتطلب إعداد إضافي لإزالة الأنسجة ومعالجتها. ومع ذلك، تعتبر هذه الطريقة غير مكلفة، لأنها تتطلب الكواشف مختبر مشترك وقليل من الوقت الإضافي. ونتيجة لذلك، يمكن أن توفر هذه الطريقة معلومات لا تقدر بثمن حول كيفية التعرض الكيميائية والبيئية تغير تطور الثديية العادية، فضلا عن تغييرات العرض التي تحدث بسبب التعديلات الجينية.
Introduction
الثديية بأكملها مونتيس طريقة مفيدة وغير مكلفة تنفيذها في العديد من الفئران والفأر الدراسات لفهم كل من الطبيعي والمستحثة كيميائيا، والتنمية غير طبيعية. بشكل عام، فإن الغدة الثديية التي تم جمعها في مراحل مختلفة خلال تطوير القوارض ( أي المراهقة، سن البلوغ، منتصف إلى وقت متأخر من الحمل، ومرحلة الانقلاب) تظهر التغيرات المورفولوجية في الأنسجة والهندسة المعمارية الخلوية تتأثر عوامل الغدد الصماء، والغدد الصماء، 1 - في الفئران الشيخوخة، وأجزاء الظهارية والانسجة من الغدة تصبح على نحو متزايد كثيفة، مما يجعل قياس المعلمات المورفولوجية صعبة في جبل بأكمله. وبالتالي، فمن الممارسة الشائعة لجمع غدة للتقييم النسيجي لتحديد التغيرات على مستوى المجهري. كلا العمليتين مفيدة بشكل خاص في الدراسات التي تنطوي على التعرض الكيميائي ( أي البيئية، أو الصيدلانية) أو لدراسة التغيرات المورفولوجية المصحوبة بتعديل وراثيبالجمع.
التقنيات والقدرات لاستخدام الغدة الثديية في تقييم المخاطر تستمر في التطور. في حين أن إعداد كامل جبل هو روتيني وموحدة، والتعديلات على باجتزاء تستمر 2 ، 3 . العديد من المجموعات البحثية من مختلف الخلفيات ( أي الأوساط الأكاديمية والحكومة والصناعة) تكيفت أقسام الاكليلية / الطولية من الأنسجة الثديية كطريقة مفضلة، في حين أن بعض المختبرات لا تزال تستخدم المقاطع عبر قطع من خلال الجلد 4 . هذا الأسلوب الأخير ينتج في تمثيل غير عادي للبشرة (الجلد)، بدلا من الأنسجة من الفائدة: ظهارة الغدة الثديية 2 . أقسام الاكليلية أو الطولية هي أكثر فائدة لتوصيف الأنسجة الطبيعية 5 وتحسين كبير في الكشف عن تشوهات والآفات بسبب زيادة مساحة السطح وعدد من الهياكل الحالية. عموما، وهذا يجعل مو كلهونت طريقة مناسبة للتقييم النسيجي المرضي للغدة الثديية 1 ، 2 . سواء باستخدام الفأرة أو فأر، واسترجاع، والحفاظ على ال 4 و 5 تشرين الغدد الأربية ينصح بشدة للمقارنة بين جبل بأكمله إلى قسم H & E المقابل.
عندما تستخدم في تركيبة، وقسم H & E وكل جبل يوفر حساب دقيق للتغيرات الخلوية والمورفولوجية الناجمة عن التعرض البيئي. وهذا صحيح بشكل خاص في بعض سلالات القوارض التي يكون النموذج فيها قابلية منخفضة لتشكيل الورم أو ورم ليس مرئيا بشكل واضح. في بعض الظروف، الحصول على الأنسجة المطلوبة قد لا يكون ممكنا دائما باستخدام كل من التقنيات ( أي عدم كفاية كمية الأنسجة، والموارد، أو نتائج تجريبية غير متوقعة). في حالتنا، لوحظت تشوهات في جبل كامل الثديية، في حين هيستوباثوالنتائج المنطقية في المقابل H & E الغدة كانت في الغالب طبيعية. أدى الاختلاف الساحق بين الغدد المقابل لنا لتطوير إجراءات اقتصادية وفعالة لتحديد تشوهات في يتصاعد كله. باستخدام إجراء المعالجة والتضمين المعدلة، تم إعداد أجزاء عالية الجودة H & E الملون من يتصاعد كامل جزءا لا يتجزأ من البارافين. ونحن نتصور هذا البروتوكول تصبح أداة قوية للكشف عن آثار التعرض الكيميائية، وتعزيز المقارنات بين المختبرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع استخدام الحيوان والإجراءات لهذه الدراسة من قبل نيهس مختبر الحيوان
لجنة الرعاية والاستخدام، وأجريت في جمعية للتقييم والاعتماد
مختبر رعاية الحيوان منشأة معتمدة.
1. الثديية كله جبل إعداد 2 ، 3 ، 6 ، 7
- إزالة الغدد الثديية الأربية من جانب واحد من غير الحامل الماوس الإناث سد-1، كما هو موضح في المرجع 3 ، ووضعها على شريحة مشحونة كهربائيا.
- تغطية الغدة مع ورقة غير لاصقة أو فيلم ووضع شريحة أخرى على القمة. إضافة ضغط ( أي الأوزان المياه) إلى الشريحة لنشر الغدة من شقة بحيث الغدة ستلتزم الشريحة لتثبيت.
- غمر الشرائح في تثبيتي (على سبيل المثال، الإيثانول 100٪، الكلوروفورم، وحمض الخليك الجليدي في نسبة 6: 3: 1)بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الغدد من تثبيتي وغسل في الإيثانول لمدة 15-30 دقيقة. بعد غسل لمدة 30 دقيقة، وتغير تدريجيا إلى الماء عن طريق صب 1/3 من الإيثانول وإضافة الماء. السماح للغسل الجلوس لمدة 5 دقائق في كل مرة، وتكرار مع إضافة الماء 3 مرات.
- وصمة عار (على سبيل المثال، حل الشبك القرمزي) لمدة 12-24 ساعة.
ملاحظة: سوف الأنسجة سمكا تتطلب وقتا أطول تلطيخ مرات. انظر المرجع 3 للحصول على تفاصيل تلطيخ. - صب قبالة وصمة عار بعد الوقت المخصص وشطف الشرائح في الماء لمدة 30 ثانية. تجفف الأنسجة عن طريق غسل الشرائح في الايثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة، تليها أداء غسل 15 دقيقة في الايثانول 95٪ وغسل النهائي في الايثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة.
- مسح الدهون من الأنسجة عن طريق وضعها في زيلين لمدة لا تقل عن 24 ساعة، أو أطول إذا كان النسيج سميكة، بحيث تتم إزالة أي مناطق مبهمة أو بيضاء.
- إزالة الأنسجة من زيلين وبسرعة إضافة مأونتينغ المتوسطة إلى الشريحة لتجنب الأنسجة الجفاف. وضع ساترة على القمة. السماح للشريحة لتجف لمدة 48 ساعة على الأقل.
- تقييم الأنسجة مثبتة بالكامل لشذوذ، كما هو موضح في 2 .
ملاحظة: عندما يتم الكشف عن الآفات في يتصاعد كله و سيكتيونينغ ضروري لتحديد هويتهم، يجب اتباع الخطوات التالية.
2. إزالة جبل كله الثديية من شريحة زجاجية
- إزالة ساترة وتصاعد المتوسطة عن طريق غمر الشريحة كامل جبل الثديية في جرة تلطيخ الزجاج مليئة زيلين بين عشية وضحاها.
ملاحظة: قد تتطلب الأنسجة والشرائح سمكا مع حل تصاعد المفرط وقتا إضافيا لإزالة ساترة. - بعد نقع بين عشية وضحاها الأولي، ضع الشرائح في الزيلين الطازجة وينقع لمدة 6 ساعات. أداء واحد نقع النهائي في الزيلين الطازجة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: ساترة سوف تقع بسهولة قبالة الشريحة بعد آخر نقع. - مع أغأحب اليد، عقد الشريحة وإزالة بعناية ساترة مع زوج من ملقط لضمان أن تتم إزالته في قطعة واحدة.
ملاحظة: في حالة أن ساترة لا تزال تعلق على الشريحة الزجاجية، ومواصلة تمرغ حتى يمكن إزالتها مع القليل من الجهد. - مرة واحدة تتم إزالة ساترة، عقد الشريحة عموديا على طبق بيتري الزجاج التي تحتوي على الزيلين، واتخاذ بعناية حادة، شفرة حلاقة المتاح وشريحة شفرة في حركة واحدة أسفل الشريحة.
- مرة واحدة يتم إزالة الأنسجة، وغمر بسرعة لوحة الثديية في زيلين شغل الزجاج طبق بتري لضمان أن الأنسجة لا الهواء الجاف.
ملاحظة: كن حذرا مع هذه الخطوة. جبل كله رقيقة (≤ 1 ملم)، وهشة من معالجة الزيلين. أي انطباعات أو دموع قد تغير مورفولوجيا الأنسجة وتعقد التقييمات في وقت لاحق.
3. تجهيز الأنسجة
- مرة واحدة في الأنسجة في طبق بتري، نقله بعنايةإلى كاسيت الأنسجة المسمى. الاستيلاء على حافة لوحة الدهون مع حادة-- الانف، ملقط مسننة-- ملقط للحد من تلف الأنسجة.
- باستخدام الحلاقة، وقطع الأنسجة الكبيرة (وخاصة بالنسبة للفئران) في نصف ووضعها في اثنين من أشرطة وصفت منفصلة من شأنها أن تستوعب حجم الأنسجة. وضع الأنسجة الجانب الأيمن حتى (استخدام العقدة الليمفاوية كمرجع). تأكد من أن الأنسجة دون العقدة الليمفاوية يتم الاحتفاظ في نفس، موقف تستقيم عندما يتم نقله إلى كاسيت.
- وضع الكاسيت في وعاء من الزيلين لمدة تصل إلى 2 ساعة قبل وضعها في معالج الأنسجة.
ملاحظة: فمن المستحسن لمعالجة العينات في نفس اليوم يتم وضعها في الكاسيت. لم يتم اختبار النقع الموسعة في الزيلين. - تحميل الحد الأقصى لعدد الكاسيت في معالج الأنسجة باليد.
- قبل البدء، برنامج جميع الكواشف التي سيتم استخدامها لهذه العملية في قائمة كاشف المعالج. لأتمتة الحركةمن محطة واحدة إلى أخرى، استخدم خيارات القائمة وإنشاء برنامج جديد. عند اكتمال جميع الخطوات، حدد "موافق" للمتابعة.
ملاحظة: سيسمح المعالج بمراجعة جميع تفاصيل المحطة قبل البدء.- أتمتة المعالج لنقع الأشرطة في زيلين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها نقع الثانية في الزيلين الطازج في ظل نفس الظروف. أتمتة المعالج لإزالة الكاسيت من محلول زيلين ونقل الأنسجة إلى المحطة التالية التي تحتوي على 1: 1 زيلين: خليط البارافين المنصهر، تعيين في 60 درجة مئوية، لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: المعالج ثم نقل أشرطة في غرفة جديدة تحتوي على البارافين المنصهر لمدة 1 ساعة. بعد 1 ساعة، سيتم نقل العينات تلقائيا إلى غرفة جديدة من البارافين المنصهر الطازج وسيتم معالجتها لمدة 2 ساعة إضافية. يتم تنفيذ كلا الخطوتين في 60 درجة مئوية. - ثم يقوم المعالج بنقل الكاسيت إلى المحطة التي تحتوي على الفقرة المنصهرةفيفين لمدة 1 ساعة. ثم، يتم نقل العينات تلقائيا إلى المحطة النهائية من البارافين المنصهر الطازج ومعالجتها لمدة 2 ساعة إضافية. يتم تنفيذ كلا الخطوتين في 60 درجة مئوية.
- أتمتة المعالج لنقع الأشرطة في زيلين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها نقع الثانية في الزيلين الطازج في ظل نفس الظروف. أتمتة المعالج لإزالة الكاسيت من محلول زيلين ونقل الأنسجة إلى المحطة التالية التي تحتوي على 1: 1 زيلين: خليط البارافين المنصهر، تعيين في 60 درجة مئوية، لمدة 30 دقيقة.
4. تضمين الأنسجة الثديية المصنعة
- وضع أشرطة في 58 درجة مئوية بارافين عقد خزان من محطة التضمين حتى جاهزة لتضمين الأنسجة في القالب.
- إزالة غطاء كاسيت لتحديد أفضل حجم العفن للأنسجة. تأكد من أن القالب كبير بما فيه الكفاية لاستيعاب الأنسجة، وترك مساحة كافية لديك حدود خالية من الأنسجة من البارافين حول محيط.
- إضافة 3-4 ملم من البارافين المنصهر للقالب وتوجيه سطح كامل جبل الثديية، والتي كانت متاخمة للجزء السفلي من الشريحة الزجاجية والجزء السفلي من كاسيت، التي تواجه في القالب.
- نقل القالب إلى لوحة التبريد وسرعة ضبط الأنسجة حسب الحاجة بحيث يكون موازيا للقالب بottom.
ملاحظة: مرة واحدة في بارافين يصلب، وسوف بيسكورد النسيج في المكان. - باستخدام ملقط الدافئة، وضع المسمى، النصف السفلي من الكاسيت على رأس القالب؛ اضغط بقوة باستخدام ملقط.
- إضافة البارافين المنصهر إضافية إلى القالب في حركة مستمرة لتغطية الكاسيت بأكمله. نقل القالب من لوحة دافئة إلى لوحة الباردة لاستكمال تصلب كتلة.
- إزالة كتلة من القالب عندما البارافين يصلب تماما لتجنب الشقوق أو فقاعات الهواء.
ملاحظة: تخزين الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للقسم.
5. سيكتيونينغ الأنسجة الثديية جزءا لا يتجزأ من البارافين على مشراح
- قبل سيكتيونينغ، احتضان كتل البارافين في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: سيكون هناك المتبقية تصاعد المتوسطة في كتلة من الأصلي كوفرسليبد كامل جبل الأنسجة. تقشعر لها الأبدان كتلة يحسن تقسيم الاقسام و ريبونينغ. - إعداد هيئة التصنيع العسكريدوامة من قبل تحول على حمام الماء، التي تحتوي على الماء المقطر الطازج، وضبط درجة الحرارة إلى 42-45 درجة مئوية. وضع شفرة جديدة، منخفضة الشخصي على مشراح وتعيينه في 4 ميكرون.
ملاحظة: يتم تقليل جودة القسم مع أقسام سمكا من 4 ميكرون بسبب وجود المتوسطة المتزايدة المتبقية في الأنسجة. - إدراج كتلة في مشراح مع الشمع التي تواجه شفرة ومحاذاة الطائرة العمودية. ثم، رطبة جزء من لوحة الشاش في الماء البارد ووضعه على كتلة لعدة دقائق.
- قسم كتلة عن طريق تحويل عجلة كبيرة في حركة عقارب الساعة، جنبا إلى جنب مع عجلة متقدمة الخشنة، حتى يتم الحصول على الوجه الكامل أو مقطع تمثيلي من كتلة.
ملاحظة: الأنسجة رقيقة بسبب زيلين المقاصة خلال عملية جبل كامل. محاذاة كتلة بشكل صحيح مع شفرة لتقليل عدد من التخفيضات في الحصول على قسم تمثيلي. - اختر الشريطقسم باليد، تعويم بعناية الشريط في دافئ (45 درجة مئوية) حمام الماء (أعدت مسبقا)، والسماح للتجاعيد الأنسجة لتبديد وتطفو بعناية قسم على شريحة زجاجية نظيفة.
- وضع الشرائح تستقيم على رف التجفيف لإزالة المياه الزائدة. احتضان الشرائح في مربع الشريحة فتح قليلا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
6. الآلي ودليل H & E تلطيخ من الأنسجة الثديية المقسمة
- قبل تلطيخ، يتم تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة.
- لتلطيخ الآلي، حدد H & E من خيارات وصمة عار على القائمة الرئيسية. ديبارافينيزاتيون، تلطيخ، والجفاف كلها اكتمال على تلطيخ الآلي. استخدام المتوسطة المتزايدة وساترة لتركيب المقاطع.
- إذا تلطيخ يدويا الشرائح، ديبارافينيز المقاطع عن طريق غمر الشرائح في زيلين لمدة 5 دقائق. نقل إلى الزيلين الطازجة وتكرار لمدة 5 دقائق.
- ترطيب الشرائح عن طريق غمر ثم مرتين في الإيثانول 100٪ لمدة 3 دقائق لكل منهما، تليها اثنين من التكرار في الطازجة الإيثانول 95٪ واثنين من يغسل منفصلة في 1X غسل العازلة في 5 دقائق لكل منهما.
- شطف الشرائح في الماء المقطر.
- إضافة الشرائح إلى الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة. إزالة الشرائح وشطف لهم مع تشغيل مياه الصنبور لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تصفية الهيماتوكسيلين قبل كل استخدام. - وضع الشرائح في حمض الخليك الجليدية 1٪ لمدة 30 ثانية لتعزيز التمايز اللون، ثم شطف في تشغيل مياه الصنبور لمدة 1 دقيقة.
- إضافة الشرائح إلى برنامج تلفزيوني 1X لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة إلى الأزرق أقسام الأنسجة، تليها 5 دقائق شطف في مياه الصنبور ثم في 95٪ الكحول لمدة 15-20 ثانية.
- كونترستين مع الحل يوزين لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة. بعد ذلك، يذوى الشرائح مرتين في الطازجة الايثانول 95٪، تليها اثنين من التكرار الطازجة في الإيثانول 100٪. أداء كل غسل لمدة 5 دقائق.
- مسح الشرائح في الزيلين، مع اثنين من التغييرات في الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- ساترةقسم الأنسجة مع تصاعد المتوسطة والجافة شقة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه الطريقة فعالة في المساعدة مع التشخيصات التي قد تكون قد غاب خلاف ذلك إذا كان المقابل الأصلي H & E القسم من لوحة الثديية لا تظهر أي تغييرات نسيجية. ومع ذلك، فإن النتيجة تكون مفيدة فقط إذا تم اتخاذ الرعاية خلال الإعداد كامل جبل الأولي، وكذلك أثناء إعداد الأنسجة للتقييم النسيجي. سوف التضمين البارافين توفير الحماية وسوف تساعد على الحفاظ على الأنسجة ل سيكتيونينغ في المستقبل.
لتحديد سمك مثالي من الأنسجة الثديية، تم إعداد 4 ميكرون و 6 ميكرون أقسام. اختبرنا أعماق التي كانت أكبر من هامش الخطأ من ± 1 ميكرون على مشراح. أقسام سمك 6 ميكرون ( الشكل 1A ) كانت كثيفة جدا مع الخلايا المدمجة. وعموما، تفتقر الشرائح التفاصيل الخلوية متميزة من شأنها أن تكون ضرورية لجعل إيدنتيف السليمication. كان سمك الأمثل 4 ميكرون ( الشكل 1B ). وقدمت هذه الأنسجة أفضل النتائج، حيث تم تمييز المناطق الظهارية و انسجة وأنواع الخلايا المقابلة بسهولة.
استخدمت شرائح من دراسة كبيرة ومستمرة لتوضيح سهولة وفائدة هذه الطريقة. في العديد من الحالات، تم العثور على قسم H & E الأصلي من 14 عاما الإناث العذراء الإناث سد-1 لديها نتائج متضاربة مقارنة مع جبل كامل الثديية المقابل من نفس الحيوان. كانت الآفات واضحة في جبل كامل، ولكن لا يمكن التعرف عليها من دون مزيد من التقسيم وتلطيخ. وتم اختيار عينات من حيوانين مختلفين كقضايا تمثيلية. في كلتا الحالتين، تم استخدام قسم واحد للتلطيخ، ولكن تم إجراء عدة تخفيضات حتى تم الحصول على قسم تمثيلي. كان هناك عدد قليل جدا من التخفيضات اللازمة للحصول على قسم تمثيلي، منذ التحضيرات السابقة كلها جبل مسح موست من لوحة الدهون، وترك الغدة رقيقة جدا بالمقارنة مع الغدة الثديية أعدت أصلا لتضمين البارافين، والتي تحيط بها لوحة الدهون سميكة. الشكل 2 ألف والشكل (3) وتوضيح الأجزاء النسيجية من الغدد التي تم تقييمها بشكل طبيعي. يظهر كل من الغدد الهياكل الأقنية محاطة من قبل السكان المتينين الغنية بالكريات الشحمية متجانسة. ويصف كل قناة من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية مكعبية بسيطة ويتم الحفاظ عليها من قبل طبقة ثانية من الخلايا القاعدية، وتتألف أساسا من الخلايا الظهارية، ولكن تشمل أيضا الجذعية والسكان الخلية السلف. ممثل يتصاعد كامل المقابل ( أرقام 2B والشكل 3 ب ) أظهرت قنوات و سدى مع زيادة التعتيم. ومع ذلك، كان من الصعب تحديد ما إذا كان أوباكينيس نتيجة للتغيرات مفرط التنسج، التهابات، أو الورم معحيث يوجد قسم H & E يمكن أن يوفر تفاصيل خلوية متميزة.
تم استخدام يتصاعد كله المقابل من نفس الحيوانات لتنفيذ الطريقة الموصوفة هنا ويمكن ملاحظتها في الشكل 2 C و D والشكل 3 C و D. تم تشخيص العينات في الشكل 2 C & D كما التهاب الأوعية بسبب زيادة عدد الخلايا الليمفاوية التي كانت موجودة حول الأوعية الدموية الكبيرة في قسم الغدة الثديية. في الحالة الثانية، تم الحفاظ على العمارة الغدة الثديية مفصص ولكن تم توسيعها متعددة من خلال زيادة عدد وحجم الحويصلات الهوائية والقنوات (تضخم لوبولوالفيولار). وكانت الخلايا الظهارية السنخية متباينة جيدا، مستديرة، في كثير من الأحيان، فاكولاتد، وشكلت طبقة متحدة المركز واحد حول التجويف التي تحتوي عادة السائل البروتيني. دوككانت تيسي مبطنة بالخلايا العمودي وكانت مشابهة للخلايا السنخية، مع ظهارة متباينة جيدا التي شكلت طبقة متحدة المركز واحد. وغالبا ما لوحظ هذا النمط الظاهري في الغدد الثديية من الفئران منتصف الحوامل والجرذان. لا ينبغي الخلط هذا مع الهياكل لوبولوفولار في الغدد الثديية من الذكور الذكور الفئران 8 . في الغدة الثديية الذكور البالغين، الحويصلات الهوائية بارزة والقنوات نادرة، ولكن الحويصلات الهوائية والقنوات تصطف من ظهارة الطبقية، مع طويل القامة، فاكولاتد مكعبة إلى خلايا ظهارية عمودية قصيرة.
الشكل 1 : سمك الموصى بها للفأر الغدة الثديية جبل كامل ل H & E أقسام . A) 6 ميكرون و B) 4 ميكرون. لم تكن قرارات هياكل الغدة الثديية مثالية للتقييم النسيجي باستخدام السمكا (6 - & #181؛ م) أقسام، وبالتالي ينصح القسم 4 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكر وآخرون. 9 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : جبل كامل ل H & E قسم التهاب الأوعية. هذه الصورة هي الغدة الثديية الماوس التي تم جمعها في ديستروس. أ) فورمالين ثابتة H & E القسم الغدة الثديية مع أي تعديلات هيستوباثوجيكال. ب) المقابل كله جبل القسم، مع مناطق زيادة التعتيم (منطقة محاصر). C) التكبير 20X من قسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاصر). حاصرت مجموعات من الخلايا وحيدات النوى الأوعية الدموية وامتدت إلى الأنسجة الدهنية المحيطة بها. د) ثه 40X التكبير من قسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاصر) يظهر بمزيد من التفصيل أن معظم السكان وحيدات النوى يتكون من الخلايا الليمفاوية ويسلط الضوء على شدة التهاب حول الأوعية. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكر وآخرون. 9 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : جبل كامل ل H & E القسم من تضخم السنخية مفصص . هذه الصورة هي الغدة الثديية الماوس التي تم جمعها في ديستروس. A) الفورمالين ثابتة H & E القسم الغدة الثديية مع أي تعديلات النسيجية. ب) المقابل كله جبل القسم مع زيادة التعتيم في المناطق الأقنية و انسجة (محاصرا). C) التكبير 20X من قسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاصر). تم الحفاظ على الهندسة المعمارية المرمى ولكن تم توسيعها بشكل متعدد من خلال زيادة عدد وحجم الحويصلات الهوائية والقنوات (تضخم لوبولوالفيولار). د) يكبر التكبير 40x لقسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاطة) أن الفصيصات الموسع تحتوي على عدد متزايد من الحويصلات الهوائية والقنوات التي تصطف من قبل خلايا ظهارية متباينة جيدا، في كثير من الأحيان، فاكولاتد الظهارية، والتي تشكل شمعة التي تحتوي على سائل بروتيني. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكر وآخرون. 9 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الغدة الثديية كله جبل هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لتوضيح التطور الثديي الطبيعي والتغيرات المورفولوجية التي قد تنشأ وتستمر بعد التعرض للمواد الكيميائية، بما في ذلك اضطرابات الغدد الصماء. عندما يتم تقييم جبل كامل وقسم H & E من نفس الحيوان معا، فإنها يمكن أن توفر لقطة بصرية دقيقة من التعديلات في وقت مبكر، والتي يمكن أن تتحول إلى حالة أكثر مريضا.
القدرة على الحصول على هذه المعلومات المفيدة تكمن في ضمان أن تؤخذ الرعاية للحفاظ على وعدم المساس مورفولوجيا غدية عند إزالة الأنسجة. في حين أن القوارض عدة مواقع الغدة الثديية تقع ثنائيا على طول الجدار الظهري، فمن المستحسن لجمع ال 4 و 5 تشرين الغدد للحد من الانتعاش الأنسجة العضلية. وينبغي أيضا أن تكون منطقة مرفق الحلمة والعقدة الليمفاوية موجودة، لأنها بمثابة المعالم المورفولوجية المفيدة. وينبغي أيضا أن تنتشر الغدة وخنقتشيد عبر سطح مستو ( أي شريحة زجاجية، كاردستوك، أو قماش) لتقليد عن كثب البنية الطبيعية للنسيج في الموقع . تشوهات داخل الغدة الثديية وعادة ما تكون غير مرئية حتى بعد الغدة قد دنتيد في زيلين أو كان ملطخة القرمزي. على عكس الأنسجة الثديية التي أعدت في الأصل لالقصاء النسيجي، جبل كامل إزالة من الزجاج لتضمين البارافين سيكون رقيقة للغاية وهشة. يجب تجنب الانطباعات ملقط والدموع الأنسجة، لأنها من المحتمل أن تغير التشكل الخلوي وجعل التقييمات النسيجية للمنتج النهائي صعبة.
مرة واحدة وقد تم جبل كامل جزءا لا يتجزأ من البارافين، قبل باجتزاء، فمن المستحسن للسماح للكتل لاحتضان في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. هذه الخطوة يحسن القدرة على الحصول على قسم الأنسجة التمثيلية المثلى في الشريط. سيكتيونينغ من الأنسجة في 6 ميكرون ( الشكل 1A ) 9 الشكل 1B ) 9 ، تم التعرف على جميع الميزات الخلوية، بما في ذلك الأنسجة الظهارية والتلوث اللحمية المحيطة بها، بسهولة. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه على الرغم من أن هذه الأجزاء كانت ملطخة بالكرميين سابقا، إلا أن البقعة لم تظهر بعد التقسيم ولم تتداخل مع تلطيخ H & E. ولذلك، فإن خطوة دي تلطيخ لم يكن ضروريا في البروتوكول. على الرغم من أن ملطخة أقسام الأنسجة فقط مع H & E، ونحن نتوقع مع تعديلات طفيفة، والبقع النسيجية وربما ربما المناعية قد تكون قابلة للتطبيق مرة واحدة باجتزاء كاملة. ومع ذلك، فإنه كان خارج نطاق هذا البروتوكول، وسوف تتطلب مزيدا من التحقيق لتحديد الظروف المثلى لهذه البقع.
وقد تم تطوير هذا الإجراء لأننا لاحظنا النتائج المتباينة بين الذين يجمعون روتينيا الذينلي يتصاعد وعلى المقابل H & E الملون أقسام الغدة الثديية من نفس الحيوان. توجد بروتوكولات الثديية مماثلة 6 ، 10 ؛ ومع ذلك، فإن الإجراءات لم تكن مفصلة أو سهلة لمتابعة. وأسست تلك الأسس أساسا لتطوير بروتوكولنا. وقد لوحظت مورفولوجيا الغدة الطبيعية في أقسام الأنسجة H & E الملون ( الشكل 2 A والشكل 3 A ) 1 ، في حين كشفت يتصاعد كلها تكميلية العديد من الميزات المورفولوجية غير طبيعية ( الشكل 2 B والشكل 3 ب ) 9 . من خلال أداء الأنسجة على يتصاعد كله، يمكننا تصنيف السمات الشاذة. على سبيل المثال، تم التعرف على التهاب الأوعية الدموية والتضخم لوبولوفولار في حالتين منفصلتين كانت متباينة مقارنة مع ثه H & E النتائج التي لوحظت في الجانبين المقابل ( الشكل 2 C و D والشكل 3 C و D ) 9 .
ومعرفة المؤلفين، لا توجد تقارير معروفة عن تناقضات الغدة الثديية مماثلة لتلك التي لوحظت في دراستنا الجارية. ومع ذلك، قد يكون هذا بسبب قضايا التصميم التجريبي بدلا من عدم حدوث، كما الغدة الثديية غالبا ما يتم جمعها فقط لتطبيق واحد أو التحليل الذي لا ينطوي على التشكل، مثل رت-ير أو البقع الغربية. ومع ذلك، العديد من التجارب تتضمن تطبيقات متعددة التي تتطلب كمية كافية من الأنسجة لكل نقطة نهاية. الغدد الأربية هي الخيار المفضل لكامل يتصاعد والتطبيقات المصب لأنها نادرا ما تلوث الأنسجة المحيطة بها مثل الغدد الصدرية ( أي تلوث العضلات) ولأن العقد الليمفاوية الثديية الأربية توفر فالوومعايير قادرة على التوجه والمقارنة عبر الغدد. ولذلك، فإن تحديد أي الغدة ومقدار من الغدة سوف تكون مخصصة لكل تطبيق تؤثر على دقة الكشف. وينبغي أن يكون تحديد الأولويات لاستخدام الغدة الثديية ل: 1) كلها جبل تتألف من ال 4 و 5 تشرين كامل الغدد، 2) الأنسجة من المقابل 4 غدة تحتوي على بعض العقدة الليمفاوية لاستخدامها بوصفها معلما عشر، و 3) في المقابل الغدة الموافق 5 (مع عدم وجود العقدة الليمفاوية تلويث) لتطبيقات المصب (أي RNA، DNA، والبروتين). إذا كان شذوذ مرئيا في التشريح، يجب أن جبل كامل تفضيل الأفضل لجمع الأنسجة.
كما هو الحال مع أي بروتوكول، هناك قيود مصاحبة؛ والحاجة إلى تدمير دائم جبل بأكمله أثناء التقسيم وجود الأنسجة محدودة لاستخدامها في التحليلات البديلة، على سبيل المثال. وبالتالي، نوصي توثيق كثيف يتصاعد كله مع s سطح المكتبكانر لإنتاج الصور الرقمية للتحليل والمرجعية في المستقبل. أيضا، إذا تلطيخ لن يحدث في غضون شهر، والحد من عدد من أقسام قطع للحفاظ على الأنسجة لأي تحليلات في المستقبل. فوائد هذا جبل كله ل H & E طريقة القسم تفوق القيود، بحيث يمكن تطبيقها عالميا للدراسات الثديية التي تنطوي على تخصصات متعددة، وخاصة علم السموم. وقد شملت العديد من الدراسات باستخدام المواد الكيميائية مع آثار الغدد الصماء المعروفة نسخة معدلة من هذا البروتوكول، مما يدل على انطباقه 11 ، 12 ، 13 . وقد تساعد النتائج المستمدة من هذه الدراسات على تقليل فرص حدوث سلبي كاذب في الاختبارات الكيميائية، ولكنها قد توفر أيضا معلومات جديدة أو إضافية يمكن استخدامها للقرارات التنظيمية وتقييم المخاطر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي مصالح متضاربة للإعلان فيما يتعلق بالبحث، أو التأليف، و / أو نشر هذه المقالة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بام باموفويغو، وتينيت جونز، وناتاشا كلايتون، نيهس، بخبرتهم الفنية ودعمهم لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , In press (2017).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
- Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
- Whole mount preparations. , Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
