Method Article

التنبؤ الجينات إسكات من خلال التحكم المكاني الزماني من سيرنا الافراج عن نانوكاريرز البوليمرية استجابة الصورة

DOI:

10.3791/55803

⸱

July 21st, 2017

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة الرواية التي تستخدم البوليمرات كتلة استجابة الصورة للتحكم الزماني الزماني أكثر كفاءة من إسكات الجينات مع عدم الكشف عن الآثار خارج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التنبؤ بالتغيرات في التعبير الجيني باستخدام مقايسات إطلاق سيرنا مباشرة ونمذجة حركية بسيطة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك حاجة إلى مواد وطرق جديدة لتحسين السيطرة على ملزمة مقابل الافراج عن الأحماض النووية لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتطلب التنظيم الدقيق للنشاط الجيني. على وجه الخصوص، والمواد المحفزة استجابة جديدة مع تحسين السيطرة المكانية الزمانية على التعبير الجيني فتح منصات قابلة للترجمة في اكتشاف المخدرات وتكنولوجيات الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن تعزيز القدرة على السيطرة على إطلاق الحمض النووي من المواد من شأنه أن يتيح تطوير أساليب مبسطة للتنبؤ فعالية نانوكارير مسبق ، مما يؤدي إلى الفحص المعجل من مركبات التسليم. هنا، نقدم بروتوكول للتنبؤ الكفاءة إسكات الجينات وتحقيق السيطرة المكانية الزمانية على التعبير الجيني من خلال نظام نانوكارير نظام استجابة وحدات. إن رنا التداخل الصغير (سيرنا) معقد مع مبيغ- b- بول (5- (3- (أمينو) بروبوكسي) -2-نيتروبنزيل ميثاكريلات) (مبيغ- ب -P (أبنبا)آرإم مستقرة نانوكاريرز التي يمكن السيطرة عليها مع الضوء لتسهيل الانضباطي، على / قبالة الإفراج سيرنا. نحن الخطوط العريضة اثنين من المقايسات التكميلية استخدام مضان ارتباط الطيفي والهلام الكهربائي لقياس الكمي الدقيق لإطلاق سراح سيرنا من حلول محاكاة البيئات داخل الخلايا. وقد تم دمج المعلومات المكتسبة من هذه المقايسات في نموذج الحركية رنا التدخل (رني) بسيط للتنبؤ ردود الفعل إسكات ديناميكية لمختلف الظروف التحفيز الصورة. في المقابل، سمحت هذه الظروف التشعيع الأمثل صقل بروتوكول جديد لمراقبة سباتوتيوتومبوري إسكات الجينات. هذه الطريقة يمكن أن تولد أنماط الخلوية في التعبير الجيني مع خلية إلى خلية القرار وليس الكشف عن آثار خارج الهدف. مجتمعة، نهجنا يوفر وسيلة سهلة الاستخدام للتنبؤ التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني والسيطرة على وجه التحديد سيرنا النشاط في المكان والزمان. هذه المجموعة من المقايسات يمكن تكييفها بسهولة لاختبار مجموعة واسعة من أوتنظمها المحفزة استجابة من أجل التصدي للتحديات الرئيسية ذات الصلة إلى العديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية والطب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رنا التدخل الصغيرة (سيرناس) توسط إسكات الجينات بعد النسخي من خلال مسار رني الحفاز التي هي محددة للغاية، وقوية، وقابلة للتخصيص تقريبا أي الجينات المستهدفة 1 . وقد مكنت هذه الخصائص واعدة العلاجات سيرنا للمضي قدما في التجارب السريرية الإنسان لعلاج العديد من الأمراض، بما في ذلك سرطان الجلد النقيلي والهيموفيليا 2 ، 3 . ومع ذلك، لا تزال هناك قضايا تسليم هامة عرقلت الترجمة 4 . على وجه الخصوص، يجب أن تظل مركبات التسليم مستقرة وحماية سيرناس من تدهور خارج الخلية، ولكن أيضا إطلاق حمولة في السيتوبلازم 5 . وعلاو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صياغة سيرنا نانوكاريرز

  1. إعداد حلول منفصلة من سيرنا و MPEG- ب -P (أبنبا) مع أحجام متساوية المخففة في 20 ملي 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-إيثانسولفونيك العازلة (هيبيس) العازلة في درجة الحموضة 6.0.
    1. إضافة سيرنا بتركيز 32 ميكروغرام / مل إلى 20 ملي هيبيس الحل.
      ملاحظة: كان سيرنا غير المستهدفة، عالمية تسلسل السيطرة السلبية. ومع ذلك، يمكن تصميم سيرنا لاستهداف أي الجينات من الفائدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد صياغة نانوكاريرز، تم إجراء مقايسات إطلاق سيرنا لإبلاغ ظروف التشعيع لاستخدامها في ترانسفكتيونس في المختبر . تم تطبيق جرعات مختلفة من الضوء لتحديد نسبة سيرنا التي تم إصدارها. استخدم الفحص الأول للهلام الكهربائي لفصل جزيئات سيرنا الحرة من جزيئات سيرنا لا تزال معقدة / المرتبطة البوليمر. نانوكاريرز التي لم تعالج بالضوء ظلت مستقرة ولم تفرج عن أي سيرنا. كما زادت مدة التشعيع الوقت، زادت كثافة مضان من العصابات سيرنا الحرة. الكمي من شدة الفرقة ب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك خطوات قليلة في الطريقة التي تعتبر حاسمة بشكل خاص. عند صياغة نانوكاريرز، ترتيب إضافة عنصر وسرعة الخلط هما معلمات هامة تؤثر على فعالية 39 . يتطلب هذا البروتوكول أن المكون الموجبة، MPEG- ب -P (أبنبا)، يضاف إلى عنصر أنيوني، سيرنا، بطريقة قطرة بينما فورتيكسينغ. اعتمادا على مجموع حجم الصياغة، وهذا عملية خلط يأخذ 3-6 ق. لاختبار ما إذا تم تشكيل نانوكاريرز بشكل صحيح، وقياس توزيع حجم باستخدام تقنية مثل تشتت الضوء الديناميكي. و مبيغ- ب -P (أبنبا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة (نيه) على الدعم المالي من خلال جائزة التنمية المؤسسية (إيديا) بموجب المنحة رقم P20GM103541 وكذلك رقم المنحة P20GM10344615. ولا تعكس البيانات الواردة في هذه الوثيقة آراء المعاهد الوطنية للصحة. ونعترف أيضا بمعهد ديلاوير للتكنولوجيا الحيوية (ديبي) ومكتب التنمية الاقتصادية في ديلاوير (ديدو) للحصول على الدعم المالي من خلال جائزة مركز العلوم البيولوجية للتكنولوجيا المتقدمة (بيوسينس كات) (12A00448).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
siRNASigma-AldrichSIC001غير مستهدفة ، تحكم سلبي عالمي
mPEG-b-P (APNBMA)تم تصنيعه في مختبرنابوليمر غير مستجيب للصور
HEPESFisher ScientificBP310-100
كبريتات دوديسيل الصوديوم   ؛سيجما ألدريتش436143
طوقا مطاطيMcMaster-Carr3788T210.5 مل
ليزر الأشعة فوق البنفسجية السميكة   ؛Excelitas TechnologiesOmnicure S2000وفلتر 365 نانومتر
من agaroseFisher ScientificBP160-100
بروميد الإيثيديومفيشر ScientificBP1302-10
siRNA الملصق ب Dy547GE Healthcare Dharmacon، Inc.طلب مخصصالفلوروفور مترافق إلى 5 'نهاية شريحة مجهر حبلا الإحساس
فيشر العلمي12-550-A3زجاج منظف مسبقا
Secure-Seal SpacerLife TechnologiesS24735لاصق على الوجهين
LSM 780 & nbsp ؛كارل زايسمجهر متحد البؤر
EN 2010كارل زايسN / AFCS التحليل
MATLABMathWorksN / Aلغة البرمجة
NIH / 3T3 الخلايا  ATCCATCC CRL-1658
DMEMMediatech10-013-CVوسائط النمو
مصل الأبقار الجنينيMediatech35-011-CVالستربتومايسين المعطل
بالحرارة Mediatech  30-002-CI
6 آبار ألواحفيشر Scientific08-772-1B
Opti-MEMLife Technologies11058021وسائط التعداء
تستخدم عدسة موازاة البنسلين

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (20....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

siRNA ReleasePhoto responsive NanocarriersGene Silencing PredictionFluorescence Correlation SpectroscopyGel ElectrophoresisRNA Interference Kinetic ModelSpatiotemporal Gene ControlUV Laser IrradiationConfocal Microscopy FCSNanocarrier Efficacy Screening

Related Articles