Bamboe poeder werd voorbehandeld met NaOH en enzymatisch gehydrolyseerd. Het hydrolysaat van bamboe werd gebruikt als voedingsstof voor 2,3-butaandiol, R- acetoïne, 2-ketogluconzuur en xylonzuurproductie door Klebsiella pneumoniae .
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bamboe is een belangrijke biomassa, en bamboehydrolysaat wordt gebruikt door Klebsiella pneumoniae als grondstof voor chemische productie. Hier werd het bamboe poeder voorbehandeld met NaOH en gewassen tot een neutrale pH. Cellulase werd toegevoegd aan het voorbehandelde bamboepoeder om het hydrolysaat, dat 30 g / L glucose en 15 g / L xylose bevatte, te vormen en werd gebruikt als de koolstofbron om een medium voor chemische productie te bereiden. Bij cultuur in microaerobe omstandigheden werd 12,7 g / L 2,3-butaandiol geproduceerd door wildtype K. pneumoniae . Bij aërobe condities werd 13,0 g / L R- acetoïne geproduceerd door de budC mutant van K. pneumoniae . Een mengsel van 25,5 g / L2-ketogluconzuur en 13,6 g / L xylonzuur werd geproduceerd door de budA- mutant van K. pneumoniae in een tweetraps, pH-gestuurde fermentatie met hoge luchtaanvulling. In de eerste gistingstadium werd de cultuur gehandhaafd bij een neutrale pH; Na celgroei, de fermentatieN ging verder naar de tweede fase, waartussen de cultuur zuur werd.
Inleiding
Klebsiella pneumoniae is een bacterie die goed groeit onder zowel aërobe en anaërobe omstandigheden. K. pneumoniae is een belangrijk industriële micro-organisme die veel chemicaliën produceert. 1,3-propandiol is een waardevolle chemische stof die voornamelijk gebruikt wordt als monomeer om polytrimethylentereftalaat te synthetiseren. Polytrimethylentereftalaat is een biologisch afbreekbare polyester die betere eigenschappen vertoont dan die van 1,2-propandiol, butaandiol of ethyleenglycol 1 . 1,3-propandiol wordt geproduceerd door K. pneumoniae onder gebruikmaking van glycerol als een substraat in zuurstofbeperkte condities 2 . 2,3-butaandiol en zijn derivaten hebben toepassingen op het gebied van kunststoffen, oplosmiddelproductie en synthetische rubber en hebben het potentieel om als biobrandstof 3 te gebruiken . Met glucose als substraat is 2,3-butaandiol de belangrijkste metaboliet van de wildtype stam 4 . 2,3-butaandiol is synthesizAfkomstig uit pyruvaat. Ten eerste kondenseren twee moleculen pyruvaat om a-acetolactaat op te leveren; Deze reactie wordt gekatalyseerd door a-acetolactaatsynthase. A-acetolactaat wordt dan omgezet in acetoïne door a-acetolactaat decarboxylase. R -acetoïne kan verder worden gereduceerd tot 2,3-butaandiol wanneer gekatalyseerd door butaandioldehydrogenase. Een efficiënte genvervangingsmethode die geschikt is voor K. pneumoniae is onderzocht en veel mutanten zijn geconstrueerd 5 , 6 , 7 . Een budC mutant, die zijn 2,3-butaandiol dehydrogenase activiteit verloor, accumuleert hoge niveaus van acetoïne in cultuurbouillon. Acetoïne wordt gebruikt als additief ter verbetering van de smaak van voedsel 8 . Wanneer budA , die codeert voor a-acetolactaatdecarboxylase, gemuteerd wordt, komt 2-ketogluconzuur op in de bouillon. 2-ketogluconzuur wordt gebruikt voor de synthese van erythorbinezuur (isoascorbinezuur), Een antioxidant gebruikt in de voedingsindustrie 9 . 2-ketogluconzuur is een tussenproduct van de glucose oxidatie pathway; In deze route, gelegen in de periplasmatische ruimte, wordt glucose geoxideerd naar gluconzuur en vervolgens verder geoxideerd naar 2-ketogluconzuur. Gluconzuur en 2-ketogluconzuur geproduceerd in de periplasma kunnen naar de cytoplasma worden vervoerd voor verdere metabolisme. De accumulatie van 2-ketogluconzuur is afhankelijk van zure omstandigheden, en hogere luchttoevoeging bevordert 2-ketogluconzuurproductie 10 . Gluconaat dehydrogenase, gecodeerd door gad , Katalyseert de omzetting van gluconzuur aan 2-ketolguconzuur. De gad mutant van K. pneumoniae produceerde hoge niveaus gluconzuur in plaats van 2-ketogluconzuur, en dit proces is ook afhankelijk van zure omstandigheden. Gluconzuur is een bulk organisch zuur en wordt gebruikt als additief om de eigenschappen van cement 1 te verhogen1. Glucoseoxidatie naar gluconzuur wordt gekatalyseerd door glucose dehydrogenase. Xylose is ook een geschikt substraat van glucose dehydrogenase. Wanneer xylose als substraat wordt gebruikt, produceert K. pneumoniae xylonzuur 12 .
Chemische productie met behulp van biomassa als grondstof is een heet onderwerp in de biotechnologie 13 . De belangrijkste componenten van biomassa zijn cellulose, hemicellulose en lignine. Deze macromoleculaire verbindingen kunnen echter niet direct door de meeste micro-organismen (waaronder K. pneumoniae ) worden gecategoriseerd . Cellulose en hemicellulosen in de biomassa moeten gehydrolyseerd worden naar glucose en xylose en kunnen dan door micro-organismen worden gebruikt. De aanwezigheid van lignine in lignocellulosen creëert een beschermende barrière die biomassa hydrolyzering door enzymen voorkomt. Zo wordt een voorbehandelingsproces dat lignine en hemicellulosen verwijdert en de kristalliniteit van cellulose vermindert, altijd uitgevoerd tijdens het gebruik van biomassa door microorganisms. Er zijn veel voorbehandelingsmethoden ontwikkeld: zuur-, alkaline-, ammoniak- en stoomvoorbehandelingen zijn gebruikelijk.
Bamboe is overvloedig in tropische en subtropische gebieden en is een belangrijke biomassa-bron. Hier worden de bereiding van bamboehydrolysaat en chemische productie met behulp van bamboehydrolysaat gepresenteerd
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van bamboehydrolysaat
- Voeg 5 g bamboe poeder toe aan 40 ml van een NaOH oplossing om een uiteindelijke concentratie van 10% (g / g) in een 250 ml fles te bereiken. Gebruik een reeks NaOH oplossingen variërend van 0,05 M tot 0,50 M in stappen van 0,05 M.
- Incubeer het mengsel gedurende 60 minuten bij 60 ° C of 100 ° C in een waterbad. Incubeer bij 121 ° C in een autoclaaf.
- Na incubatie laat het mengsel 4 uur bij kamertemperatuur staan. Verwijder dan de supernatant. Voeg 100 ml zoet water toe en meng.
- Herhaal deze was 5-6 keer, tot de pH van het supernatant 6,8 bereikt. Gebruik de verkregen vaste stof voor de volgende stap van enzymatische hydrolyse.
- Voor hydrolyse past 50 ml van het bovenstaande mengsel op op pH 5,0 met 98% H2S04. Voeg dan 0,5 ml 200 filterpapieractiviteit (FPU) / ml cellulase toe.
OPMERKING: De uiteindelijke verhouding van cellulase naar bamboe shOuld 20 FPU per 1 g bamboe. - Incubeer het mengsel gedurende 36 uur bij 50 ° C in een shaker.
OPMERKING: Na hydrolyse blijft er een beetje vast in het mengsel. - Verkrijg een duidelijk hydrolysaat door centrifugeren bij 7,690 xg gedurende 5 minuten.
- Kwantificeer de glucose-, xylose- en andere chemicaliën met een hogedruk vloeistofchromatografesysteem uitgerust met een brekingsindex detector en een fotodiode array detector. Gebruik een HPX-87H-kolom (300 mm x 7,8 mm) en een mobiele fase van 5 mM H2SO4-oplossing bij een debiet van 0,8 ml / min 12 .
- Voor een groot volume hydrolysaatbereiding meng 2 kg bamboepoeder en 18 L van 0,25 M NaOH in een 30-L roestvrijstalen tank.
- Incubeer de tank bij 121 ° C in een autoclaaf gedurende 60 minuten. Na incubatie, was het mengsel met 40 liter water in een 60 liter plastic tank. Herhaal deze was 5 keer.
- Gebruik water om het totale gewassen bamboe aan te passen aan een volume van 20 L.Pas de pH van het mengsel op op 5,0 met 98% H2S04.
- Enzymatisch hydrolyseer het mengsel in een gemodificeerd schudwaterbad, uitgerust met een mechanische roerder om ervoor te zorgen dat het mengsel goed verdeeld is. Voeg 200 ml 200 FPU / ml cellulase toe en incubeer het mengsel gedurende 36 uur bij 50 ° C.
- Na hydrolyse centrifugeer het mengsel bij 4,700 xg gedurende 10 minuten.
2,3-Butandiol Productie door Wildtype K. pneumoniae
- Gebruik 3 liter bamboehydrolysaat als oplosmiddel voor middelgrote bereiding.
- Bereid een fermentatiemedium dat 4 g / l maïs steilvloeistof bevat, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 en 0,2 g / L MgS04. Pas de pH van het medium aan op neutraal met 2,5 M NaOH. Gebruik een 5-L bioreactor die 3 liter autoclaaf fermentatiemedium bevat voor fermentatie.
- Gebruik K. pneumoniaeCellen opgeslagen in een koelkast met een temperatuur van -80 ° C.
- Voor de zaadkweek incuberen een 250 ml fles die 50 ml Luria-Bertani (LB) medium overnacht bij 37 ° C bevat, onder schudden bij 200 rpm. Gebruik LB-medium dat 10 g / l trypton, 5 g / l gist extract en 10 g / L NaCl bevat.
OPMERKING: De celdichtheid van de zaadkweek moet OD 2 bereiken (optische dichtheid bij 600 nm). - Eén flesje van 50 ml van de zaadkweek in de bioreactor inoculeer. Houd de cultuur bij pH 6,0 en 37 ° C. Gebruik een luchtaanvullingssnelheid van 2 L / min en een agitatietempo van 250 rpm, wat een microaerobe conditie creëert.
- Verzamel 5 ml monsters elke 2 uur tijdens de fermentatie en analyseer ze met hogedrukvloeistofchromatografie om de chemische concentraties in de bouillon 4 te bepalen .
- Controleer de alkali die bij de bioreactor online is toegevoegd met MFCS / DA.
OPMERKING: Organische zuren worden geproduceerd in het fermentatieproces, aNaOH wordt toegevoegd om de kweek pH stabiel te houden. Het volume van toegevoegde alkali vertegenwoordigt de hoeveelheid geproduceerd zuur. Wanneer de alkali-toegevoegde lijnplaataus, is het proces afgewerkt, hetzij door de uitstoot van koolstofbron of de cel dood.
- Controleer de alkali die bij de bioreactor online is toegevoegd met MFCS / DA.
3. R -acetoïne Productie door de budC Mutant van K. pneumoniae
- Bereid een medium voor acetoïneproductie op met 4 g / l maïs steilvloeistof, 2 g / L (NH4) 2S04, 3 g / L natriumacetaat, 0,4 g / L KCl en 0,1 g / L MgS04.
- Gebruik K. pneumoniae-ΔbudC voor de productie van R- acetoïne. Herhaal stappen 2.4-2.5.
OPMERKING: budC codeert 2,3-butaandioldehydrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC verliest de 2,3-butaandiol dehydrogenase activiteit en produceert R- acetoïne in plaats van 2,3-butaandiol. - Houd de cultuur bij pH 6,0 en 37 ° C. Gebruik een luchtaanvullingssnelheid van 4 L / min en een agitatioN snelheid van 450 rpm, een aërobe conditie.
OPMERKING: De zuurstofaanvulling is hoger dan die van 2,3-butandiolproductie. - Analyseer de monsters zoals in stap 2.6.
4. 2-Ketogluconzuurproductie door de BudA Mutant van K. Pneumoniae
- Gebruik voor 2-ketogluconzuurproductie hetzelfde medium als voor de productie van R- acetoïne.
- Gebruik K. pneumoniae-ΔbudA voor 2-ketogluconzuurproductie. Herhaal stappen 2.4-2.5.
OPMERKING: BudA codeert voor a-acetolactaat decarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA verliest de a-acetolactaat-decarboxylase-activiteit en produceert 2-ketogluconzuur, met behulp van glucose als een substraat.
OPMERKING: 2-ketogluconzuursynthese is een zure conditie-afhankelijke werkwijze. Er is een tweetrapsfermentatie ontwikkeld voor 2-ketogluconzuurproductie 10 ; In de eerste fase wordt de zaadkweek in de bioreactor ingeënt. - Behoud de cultuur bij pH 7,0 en 37 ° C. Gebruik een luchtaanvullingssnelheid van 4 L / min en een ruzie van 500 rpm.
OPMERKING: Bij deze omstandigheden groeien cellen zeer snel (de celdichtheid bereikt OD 7 in ongeveer 4 uur). Vervolgens gaat de fermentatie naar de tweede fase, gedurende welke de kweek pH afneemt tot 5,0. Geen zuur wordt toegevoegd; De in de kweek geproduceerde organische zuren leiden natuurlijk tot de pH-afname. In deze zure omstandigheden stopt de celgroei, maar 2-ketogluconzuur wordt gesynthetiseerd en verzamelt in de bouillon. - Analyseer de monsters zoals in stap 2.6. Gebruik van het hydrolysaat van bamboe als de koolstofbron.
OPMERKING: De glucose in het medium wordt omgezet in 2-ketogluconzuur, en de xylose wordt omgezet in xylonzuur. Zo wordt een mengsel van 2-ketogluconzuur en xylzuur verkregen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol werd het bamboe voorbehandeld met behulp van alkali. De optimale incubatieparameters - een temperatuur van 121 ° C en 0,25 M NaOH - werden bepaald in Figuren 1 en 2 . Het voorbehandelde bamboe werd enzymatisch gehydrolyseerd en de glucose- en xyloseconcentraties verkregen in het hydrolysaat werden gemeten. Hogere temperaturen bevoorde zich suikerproductie, dus 121 ° C werd gekozen als de optimale temperatuur. De glucose en xylose geproduc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
K. pneumoniae behoort tot het geslacht Klebsiella in de familie Enterobacteriaceae . K. pneumoniae wordt wijd verspreid in natuurlijke omgevingen zoals bodem, vegetatie en water 14 . De wildtype K. pneumoniae stam gebruikt in dit onderzoek werd geïsoleerd uit de bodem en wordt gebruikt voor 1,3-propandiolproductie 15 . K. pneumoniae en mutanten van deze soort produceren veel chemicaliën onder verschillende omstandighede...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie 21576279, 20906076) en het KRIBB Research Initiative Programme (KGM2211531).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| autoclaaf | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| roerder | IKA | RW 20 | |
| waterbadschudder | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| hogedruk vloeistof chromatograaf systeem | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboe poeder | gekocht van de provincie Zhejiang, China | maashoogte, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
Referenties
- Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
- Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
- Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
- Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
- Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
- Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
- Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
- Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
- Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
- Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
- Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
- Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
- Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
- Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
- Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
- Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
- Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
