Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwit-eiwitinteractie zijn belangrijk voor het begrip cellulaire signalering cascades en herkenbare roman traject onderdelen en eiwit dynamiek. De meerderheid van cellulaire activiteiten vereist fysieke interactie tussen proteïnen. Te analyseren en kaart van deze interacties, werden verschillende experimentele technieken evenals bioinformatica tools ontwikkeld. Autophagy is een mobiele recycling mechanisme waarmee de cellen om te gaan met andere stressoren, met inbegrip van nutriënten ontbering, chemicaliën en hypoxie. Om signalering autophagy-gebeurtenissen beter te begrijpen en te ontdekken van nieuwe factoren die regelen van eiwitcomplexen in autophagy, trad we eiwit-eiwit interactie schermen. Validatie van de resultaten van deze screening vereist het gebruik van immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken. In dit systeem, specifieke autophagy-gerelateerde eiwit-eiwitinteractie die we ontdekt werden getest in Neuro2A (N2A) en HEK293T cellijnen. Details over de technische procedures die zijn uitgelegd in deze gevisualiseerde experiment papier.
Inleiding
Macroautophagy (autophagy, hierin) is een mechanisme van cellulaire spanning die wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van bulk cytoplasma, eiwitten en organellen in dubbele membraan blaasjes autophagic blaasjes genoemd. Door de fusie van de buitenste laag van het dubbele membraan, autophagic blaasjes en hun lading zijn geleverd aan lysosomen en daarin1gedegradeerd. Autophagy treedt op basale laag in alle soorten van de cellen en alle organismen, homeostatische functies zoals de aantasting van het eiwit en organel (b.v., mitochondriën) omzet. Onder omstandigheden leiden tot cellulaire stress, zoals honger, autophagy is snel upregulat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. immunofluorescentie
- HEK293T handhaven menselijke embryonale nier cellen in DMEM hoge glucose medium en N2A muis neuroblast cellen in DMEM lage glucose medium, een 5% CO 2-bevochtigde incubator bij 37 ° C. Aanvulling van de voedingsbodems met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderen (FBS) serum, antibiotica (50 U/mL penicilline, 50 µg Mo/mL streptomycine), en L-glutamine (2 mM).
- Loskoppelen de cellen met behulp van 0,25% trypsine. Eerst Verwijder het medium van de cultuur van de cel dan de cellen met 10 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wassen en incubeer met 1 mL trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min. Inactivate trypsi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In Figuur 1 een voorbeeld van een mede-localisatie wordt resultaat verkregen met behulp van dit protocol weergegeven. Een figuur uit onze recente papier wordt8gepresenteerd. Hier, werd endogene RACK1 eiwit gekleurd in het groen, terwijl endogene LC3 werd gekleurd in rood. De gele punten die worden waargenomen in de samengevoegde afbeeldingen geven aan sites van overlap tussen de groene en rode signalen. Dus vertegenwoordigen de gele stippen de gedeeltelijke co lokalis.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Immunoprecipitation en immunofluorescentie technieken zijn cruciaal voor de studie van eiwit-eiwitinteractie. Hoewel deze twee technieken vaak gebruikt worden en gevestigde, verscheidene criteria moeten worden overwogen om te definiëren van de kwaliteit van de experimenten tijdens het gebruik van deze technieken.
Eerste, primaire antilichamen die worden gebruikt in deze tests moet specifiek voor de proteïnen van belang. Om hiervoor te zorgen, shRNA knockdowns of knock-out cellen gebruiken om t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de wetenschappelijke en technologische onderzoek Raad van Turkije (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, de Sabanci Universiteit. SEB en NMK worden ondersteund door een TUBITAK BIDEB 2211 beurs voor Ph.D. studies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (hoge glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (lage glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumercic Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
Referenties
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
