Method Article

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージングウテロのエレクトロポレーション

DOI:

10.3791/55886

⸱

July 25th, 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

子宮内でエレクトロポレーションは、発生中のマウス胚の大脳皮質における放射状移動のプロセスを研究するための迅速かつ強力なアプローチである。これは、半径方向移動の異なるステップを記述し、このプロセスを制御する分子メカニズムを特徴付けるのに役立っている。マイニングするニューロンを直接的かつ動的に分析するためには、時間の経過とともに追跡されなければならない。このプロトコールは、 子宮内のエレクトロポレーションと器官型のスライス培養および経時的な共焦点画像化を組み合わせたワークフローを記述しており、放射状に移動する皮質ニューロンの直接的検査および動的分析が可能である。さらに、移動速度、速度プロファイル、および半径方向の変化など、移動するニューロンの詳細な特徴付けが可能である。本方法は、救助実験と同様に、喪失および機能獲得によって、放射状に移動する皮質ニューロンにおける目的の遺伝子の機能的分析を行うために容易に適合させることができる。時間経過移動ニューロンの画像化は、かつて確立された最先端技術であり、ニューロン移動障害のマウスモデルにおける大脳皮質の発達を研究するための有力なツールである。

Introduction

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新皮質は、認知機能、感情機能、および感覚運動機能の主要な部位である。それは、脳の表面に平行に向けられた6つの水平な層で構成されています。発達中、背側終脳の外側壁の前駆細胞は、突起表面に放射状に移動し、層タイプ特異的なニューロンの同一性を獲得する突起ニューロンを生じる。心室/脳室区域（VZ / SVZ）で生成された後、これらのニューロンは過渡的に多極となり、移動を遅らせる。中間ゾーン（IZ）に短時間滞在した後、両極性モルフォロジーに切り替え、放射状グリア骨格に付着させ、皮質プレート（CP）への放射状配向移行を続ける。最終的な標的投影に到達すると、ニューロンは、放射状グリアプロセスから分離し、層特有の同一性を獲得する。ニューロン移動の異なる段階に影響を与える遺伝子の突然変異は、リッスンなどの重度の皮質奇形を引き起こし得るephalyまたは白質heterotopia 1、2。

子宮内エレクトロポレーションではげっ歯類の胚3、4の脳の発達に神経前駆細胞をトランスフェクトするために迅速かつ強力な手法です。この技術により、発達中のニューロンにおけるそれらの機能を研究するために、目的の遺伝子をノックダウンおよび/または過....

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Protocol

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すべての実験手順は、動物福祉委員会（RegierungspräsidiumTübingen）によって承認され、ドイツ動物福祉法およびEU指令2010/63 / EUに従って実施された。

1. Uteroエレクトロポレーション

  1. マイクロインジェクション針
    1. ボックスフィラメント（2.5mm×2.5mm）を備えたマイクロピペットプラーおよび以下のプログラムを使用して、ホウケイ酸ガラス細管（外径：1.0mm、内径：0.58mm、長さ：100mm）をマイクロインジェクション針に引っ張る：HEAT：540、PULL ：125、VELOCITY：20、DELAY：140。RAMPテスト（HEAT値：RAMP + 25）を実行して、個々のフィラメントのHEAT値を決定します。
    2. 胚の日（E）13.5以下で注射するための20〜30μmのチップサイズを得るために、38°の角度および高回転速度の中間の微小針で、より古い胚で注射するために30〜40μmステージ。保管のために、チップへの損傷を防ぐために粘土を模造したボックスまたはペトリ皿に針を固定する。
  2. プラスミドDNA溶液
    1. エンドトキシンを含まないマキシ調製キットを使用して、製造者の指示に従って、蛍光レポータータンパク質（ 例えば、 GF....

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Results

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以前は、 子宮の電気穿孔によるBcl11aの遺伝子欠損は、晩年生まれの上層投射ニューロンの放射状移動を損なうことを示しています10 。 Cre-IRES-GFPを含むDNAプラスミドベクターのエレクトロポレーションは、条件付きBcl11a flox / flox脳11においてBcl11aを効率的に欠失させた。電気穿孔の3日後にE14.5電気穿孔脳を分析したところ、ほとんどのコントロールニューロンはCPに移行したが、多くのBcl11a変異ニューロンはIZおよびVZ / SVZの移動経路に沿って失速した。さらに、 Bcl11a欠損時にIZに特異的なバイポーラ細胞を犠牲にして多極細胞の数が増加することを見出し、分極の欠陥を示唆した10 。

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Discussion

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放射状移動は、新皮質発達における重要なプロセスである。このプロセスの異なる工程に影響を与える遺伝子の変異は、滑脳症と白質heterotopia 1、2を含む重篤な皮質奇形を引き起こす可能性があります。我々は最近、若い移動する皮質突起ニューロンにおいて発現されるBcl11aが、放射状移動において役割を果たすことを示した。我々は、エレクトロポレーションされた脳の急性皮質切片における移動ニューロンの経時的共焦点イメージングを使用して、移動するニューロンにおけるBcl11aの遺伝子欠失が分極および移動の欠陥を引き起こすことを直接実証した。経時変化シリーズを使用して、個々のニューロンの移動経路を追跡し、速度プロファイル、平均移動速度、および移動方向を含む、移動するニューロンの特定のパラメータを計算した10 。

このプロトコルは、分子を研究する際の重要なアプローチを記述する半径方向の移動における機構。短いヘアピン.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示することはない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちはJacqueline Andratschke、Elena Werle、Sachi Takenaka、Matthias Tobererに優れたテクニカル・アシスタンス、そしてVictor Tarabykinに有益な議論をしてくれたことに感謝します。この作業は、Deutsche ForschungsgemeinschaftのSB（BR-2215）への助成によって支えられました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
イソフルランアボット研究所 506949Forene
6ウェルプレートコーニング351146
12ウェルプレートコーニング351143
非吸収性外科用縫合糸EthiconK890H3/8 円、13 mm、テーパーポイント
マイクロ アドソン鉗子ファインサイエンスツール11018-12鋸歯状、長さ:12 cm
細かいハサミファインサイエンスツール14063-09側面に角度をつけて、長さ:9 cm
Mathieu ニードルホルダーFine Science Tools12510-14炭化タングステン、長さ:14 cm
先端の細かい鉗子Fine Science Tools11370-40ストレート、11 cm
Vannas Tübingen 春はさみファイン サイエンス ツール15005-08角度付き、9.5 cm
リング鉗子ファイン サイエンス ツール11103-09OD: 3mm、内径、2.2 mm、長さ: 9 cm
HBSS (10X)Gibco14180046
L-グルタミンGibco25030081
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140122
馬用血清Gibco
BMEGibco41010026
ホウケイ酸ガラス 毛細血管ハーバード装置30-00161.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
麻酔システムハーバード Apparaus72-6471
麻酔室ハーバード Apparaus34-0460
フルオサーバー フィルター キャニスターハーバード Apparaus34-0415
低融点アガロース Invitrogen16520100
振動ブレードミクロトームライカVT1200 S
蛍光実体顕微鏡ライカM205 FA
実体顕微鏡ライカM125
倒立蛍光組織培養顕微鏡ライカDM IL LED
共焦点レーザー走査型顕微鏡ライカTCS SP5II
ハイブリッド検出器ライカHyD
対物レンズ、40倍/0.60NAライカ11506201
顕微鏡温度制御システムライフイメージングサービスキューブ、レンガ&ボックス
細胞培養インサートミリポアPICM0RG50
マイクログラインダーナリシゲEG-45を面取りするための38°deg;角度を使用します
。052-0500-900Picospritzer III
carprofenファイザー アニマルヘルスNDC 61106-8507リマジル
emdedding moldPolysciences18986-1
エンドトキシンフリープラスミド マキシキットQiagen12362
ファストグリーンSigma F7252
ラミニンSigmaL2020
poly-L-リジンシグマP5899
HEPESシグマH4034
D-グルコースシグマG6152
塩化カルシウムシグマC7902
硫酸マゲンシウムシグマM2643
重炭酸ナトリウムシグマS6297
方形波エレクトロポレーターソニデルCUY21EDIT
5 mmプラチナディスク電極付きピンセットSonidelCUY650P5
マイクロピペットプーラーSutter InstrumentP-97
ボックスフィラメントSutter InstrumentFB255B2.5 mm x 2.5 mm
マイクロスプーンスパチュラVWR231-0191185 mm x 5 mm
ガラス底皿、50 mmWorld Precision InstrumentsFD5040-100
26050088は、マイクロインジェクターパーカーハニフィン 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuron....

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