Method Article

Inductie en diagnose van tumoren in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

DOI:

10.3791/55901

⸱

July 25th, 2017

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de vroege stadia van kanker vertoont getransformeerde mutante cellen cytologische abnormaliteiten, beginnen ongecontroleerde overgroei en weefselorganisatie progressief verstoren. Drosophila melanogaster is ontstaan ​​als een populair experimenteel model systeem in kankerbiologie om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Met name maken genetische hulpmiddelen voor Drosophila imaginale schijven (ontwikkelende epithelia in larven) het mogelijk om getransformeerde pro-tumorcellen in een normaal epitheliaal weefsel te creëren, een situatie die vergelijkbaar is met de initiële stadia van menselijke kanker. Een recente studie van tumorigenese in Drosophila vleugel-imaginale schijven heeft echter aangetoond dat tumorinitiatie afhankelijk is van de weefsel-intrinsieke cytoarchitectuur en de lokale micro-omgeving, wat suggereert dat het belangrijk is om de regio-specifieke vatbaarheid voor tumorigenische stimuli te overwegen bij het evalueren van tumorfenotypes in imaginal discs. Om fenotypische analyse van tumorprogressie te vergemakkelijkenOp imaginale schijven beschrijven we hier een protocol voor genetische experimenten die het GAL4-UAS-systeem gebruiken om neoplastische tumoren in vleugel-imaginale schijven te induceren. We introduceren verder een diagnose methode om de fenotypen van klonale laesies die in imaginale epithelia zijn geïnduceerd te classificeren, aangezien een duidelijke classificatie methode om verschillende stadia van tumorprogressie te discrimineren (zoals hyperplasie, dysplasie of neoplasie) niet eerder is beschreven. Deze methoden kunnen in grote mate van toepassing zijn op de klonale analyse van tumorfenotypes in verschillende organen in Drosophila .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitheliale weefsels zijn hoog georganiseerde systemen die het opmerkelijke homeostatische vermogen hebben om hun organisatie te behouden door de ontwikkeling en de omzet van cellen. Dit robuuste zelforganiserende systeem wordt echter progressief verstoord tijdens de tumorontwikkeling. Bij het begin van de tumorontwikkeling ontstaan ​​individuele mutante cellen die voortkomen uit oncogene activatie of tumor-suppressor gen inactivatie binnen een epitheliale laag. Wanneer deze getransformeerde "pro-tumorcel" een onderdrukkende omgeving ontwricht, epitheliale organisatie verstoord en ongecontroleerde proliferatie begint, vindt tumorigenese plaats 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vliegkruisen en kloneninductie

  1. Verwijder alle vliegen in de flesje 12 uur voordat u maagvliegen verzamelt.
  2. Verdoof de vliegen in de flesje door CO 2 -gas te injecteren en vliegen op een CO 2- vliegblok te plaatsen.
  3. Breng 10 tot 20 maagden en 10 mannetjes van het CO 2 vliegblok in een nieuwe injectieflacon en incubeer gedurende 1 dag bij 25 ° C.
  4. Breng deze vliegen in een nieuwe fles en incubeer gedurende 12 uur bij 25 ° C.
    OPMERKING: Verwijder de eerste injectieflacon aangezien maagden geen voldoende eieren op de eerste dag leggen.
  5. Voor enhancer-GAL4 lijnen, verwijder de volw....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een ​​neoplastische tumorvorming te demonstreren die door RNAi- gemedieerde nTSG-knockdown in Drosophila- vleugel-imaginale schijven werd geïnduceerd, werden drie verschillende GAL4-stuurprogramma's gebruikt om UAS-RNAi voor lgl of scrib uit te drukken : (1) sd-GAL4, die sterke UAS-expressie in de Vleugelzakje en milde expressie in de scharniergebieden ( figuur 2 en figuur 3A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het GAL4-UAS-systeem is een van de meest krachtige genetische hulpmiddelen voor gerichte genuitdrukking in Drosophila 26 en vergemakkelijkt de tumorcelinductie en -analyse in vivo 4 sterk . Dit systeem maakt het mogelijk om klonen te genereren die afbreking van tumoronderdrukkende genen of overexpressie van oncogenen binnen het epitheliale weefsel van wildtype, een situatie die sterk overeenkomt met de initiële stadia van menselijke kanker, waar getransfo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken J. Vaughen voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 en The Takeda Science Foundation Research Grant aan YT

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)Wako162-19321
TritonX-100Wako168-11805
FormaldehydeWako064-00406
bovine serum albuminSigmaA7906
normal goat serumSigmaG6767
mounting medium, VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
mouse-anti-Dlg 4F3Developmental Studies Hybridoma Bank4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3A6B4, RRID:AB_5797803 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3B8D12, RRID:AB_5797813 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank5H7B11, RRID:AB_5797793 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulinDevelopmental Studies Hybridoma BankAA4.3, RRID:AB_579793dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 PhalloidinMolecular probesA22283dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546Molecular probesA11030dilute in PBTG, 1:400
NameCompanyCatalog NumberComments
Fly strains
sd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#8609recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#26796recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAiVienna Drosophila RNAi center#51247
UAS-scrib-RNAiVienna Drosophila RNAi center#105412
UAS-RasV12Bloomington Drosophila Stock Center#64196
UAS-Yki3SABloomington Drosophila Stock Center#28817
hsFLPBloomington Drosophila Stock Center#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)Bloomington Drosophila Stock Center#4780recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#5428X chromosome
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#6658third chromosome
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24650second chromosome
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24651third chromosome
vkg-GFPMorin et al. 2001GFP protein trap

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  3. Struhl, G., Basler, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Imaginal DiscsGAL4 UAS SystemTumor InductionTumor DiagnosisConfocal MicroscopyImageJ AnalysisFlip out GAL4Heat Shock InductionClonal Lesion ClassificationTumor Progression Staging

Related Articles