Ce travail décrit la standardisation d'une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d'un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C'est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l'iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.
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Article de méthode
Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été l'une des méthodes de choix pour isoler les populations enrichies de cellules germinales testiculaires de mammifères. Actuellement, il permet de discriminer jusqu'à 9 populations de cellules germinales murines à haut rendement et à la pureté. Cette résolution élevée en matière de discrimination et de purification est possible en raison de changements uniques dans la structure et la quantité de la chromatine pendant la spermatogenèse. Ces motifs peuvent être capturés par cytométrie de flux de cellules germinales mâles colorées avec des colorants fluorescents liés à l'ADN tels que Hoechst-33342 (Hoechst). Voici une description détaillée d'un protocole récemment développé pour isoler les cellules germinales testiculaires de mammifères. En bref, des suspensions de cellules individuelles sont générées à partir du tissu testiculaire par dissociation mécanique, doublement colorées avec Hoechst et iodure de propidium (PI) et traitées par cytométrie en flux. Une stratégie de verrouillage en série, y compris le choix des cellules vivantes (PI négatif) avec une teneur différente en ADN (intensité Hoechst), iS utilisé lors du tri FACS pour discriminer jusqu'à 5 types de cellules germinales. Ceux-ci incluent, avec des puretés moyennes correspondantes (déterminées par évaluation microscopique): spermatogonie (66%), spermatocytes primaires (71%) et secondaires (85%) et spermatides (90%), séparés en rond (93%) et allongés (87%) sous-populations. L'exécution de l'ensemble du flux de travail est simple, permet d'isoler 4 types de cellules simultanément avec la machine FACS appropriée et peut être effectuée en moins de 2 h. Étant donné que le temps de traitement réduit est crucial pour préserver la physiologie des cellules ex vivo , cette méthode est idéale pour les études à haut débit en aval de la biologie des cellules germinales masculines. En outre, un protocole normalisé pour la purification multispécifique de cellules germinales de mammifères élimine les sources méthodologiques de variables et permet d'utiliser un seul ensemble de réactifs pour différents modèles animaux.
Introduction
Compte tenu de l'absence d'un système in vitro représentatif de la progression de la spermatogenèse et de la présence d'une grande hétérogénéité cellulaire chez les testicules, les études sur la biologie des cellules germinales masculines nécessitent des techniques robustes pour isoler les populations enrichies de types de cellules spécifiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été largement utilisé à cet effet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , car il fournit un rendement et une pur....
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Protocole
Toutes les procédures décrites ci-dessous ont respecté les règlements du comité des études animales de l'Université de Washington à St. Louis.
1. Préparations pour le protocole de dissociation mécanique
- Pré-mouiller une cartouche de désagrégation de tissu jetable de 50 μm pour la dissociation d'un testicule murin entier.
REMARQUE: cette cartouche jetable de désagrégation de tissu contient des micro-lames conçues pour couper des tissus et un treillis métallique immobile avec environ 100 trous hexagonaux. Différentes tailles de maille pour cartouche de désagrégation tissulaire sont disponibles pour....
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Résultats
Suspensions cellulaires simples de la dissociation mécanique du tissu testiculaire
La figure 2 compare les suspensions de cellules individuelles obtenues par dissociation mécanique du tissu testiculaire de souris dans différentes conditions. Les échantillons obtenus en traitant du tissu frais, non colorés ( Figure 2A ) ou colorés avec Hoechst ( Figur.......
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Discussion
Compte tenu de la dynamique de la chromatine hautement conservée pendant la spermatogenèse chez les mammifères, l'objectif de ce travail était de développer un protocole pour isoler les cellules germinales masculines dans différents stades de différenciation de différents tissus testiculaires de mammifères ( figure 1 ). L'un des principaux obstacles à l'application d'un flux de travail unique à différents modèles animaux est la nécessité d'ajustements spécifiques aux esp.......
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel.
Remerciements
Les auteurs remercient l'hôpital Hillside Animal (St. Louis, MO) pour les testicules de chien; Jason Arand et le laboratoire du Dr Ted Cicero à l'Université de Washington à St. Louis (WashU) pour fournir des testicules de rat et Brianne Tabers pour aider à la collecte; Jared Hartsock et Dr. Salt's Lab à WashU pour les testicules de guinée; Et le Dr Michael Talcott à la Division de la médecine comparée chez WashU pour les testicules miniatures de porc. Les auteurs reconnaissent également le Alvin J. Siteman Cancer Center à la Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St. Louis, MO, pour l'utilisation de Siteman Flow Cytometry....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4 % paraformaldéhyde | VWR | #15710 | 4 % PFA, Pour la fixation des cellules triées |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588 ; | Système de dissociation testiculaire |
| 1X Dulbecco modifié Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, pour la dissociation des testicules |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Cartouche de désagrégation pour la dissociation des testicules |
| Sérum fœtal bovin | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, pour la collection FACS |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, Pour la coloration FACS |
| 40 et micro ; Filtre à cellules m | GREINER BIO-ONE# | 89508-342 | Pour la dissociation des testicules |
| 100x 15 mm | boîte de Pétri Falcon | #351029 | Pour la dissection des testicules |
| 5 mL Tubes à fond rond en polypropylène | Falcon | #352063 | Pour la collection FACS |
| 1,5 mL Tubes Eppendorf | VWR | #20170-650 | Pour la collection FACS |
| 3 mL seringue inutile | BD Biosciences | #309657 | Pour la dissociation des testicules |
| 50 mL tube conique | MIDSCI | Pour la dissociation des testicules ; | |
| Iodure de propidium | Invitrogen | #L7011 | PI, Pour la coloration FACS |
| Trieur de cellules MoFlo Legacy | Beckman Coulter | #ML99030 | Pour FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | Pour FACS |
| Saline tamponnée au phosphate | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, Pour la microscopie |
| Lame de verre microscopique | Fisher Scientific | #12-544-4 | Pour la microscopie |
| Lamelle en verre | Fisher Scientific | #12-548-87 | Pour la microscopie |
| Pipette de transfert jetable (3 mL) | Samco Scientific | #225 | Pour la dissociation des testicules |
| DNase I | Roche | #10104159001 | Pour la dissociation des testicules |
| Lame chirurgicale en acier au carbone | Miltex | #4-111 | Pour la dissection des testicules |
| Compteur de cellules automatisé Countess | Invitrogen | #C10227 | Pour le comptage automatique des cellules |
| Solution de bleu de trypan (0,4 %) | Sigma | #T8154 | Pour la coloration de la viabilité |
Références
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
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Réimpressions et autorisations
