Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.
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Artigo de método
Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre
Neste artigo
Resumo
Resumo
Terapias baseadas em células autólogas tem um passo mais próximo da realidade com a introdução de células-tronco pluripotentes induzidas. Células-tronco fetais, tais como o líquido amniótico e membrana células-tronco mesenquimais, representam um único tipo de células indiferenciadas com promessa em engenharia de tecidos e para reprogramação para iPSC para futuras intervenções pediátricas e células-tronco bancário. O protocolo aqui apresentado descreve um processo otimizado para a extração e cultivo primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco e gerando epissomal induzida por células-tronco pluripotentes dessas células em cultura totalmente quimicamente definida condições utilizando vitronectina recombinante humana e o meio de E8. Caracterização das novas linhas através da aplicação de métodos rigorosos – citometria de fluxo, imagem latente confocal, formação de teratoma e criação de perfil transcricional – também é descrita. As linhas recém-gerado expressam marcadores de células-tronco embrionárias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – Apesar de ser negativa para o marcador SSEA-1. As linhas de células-tronco formam os teratomas em camundongos scid-bege em 6-8 semanas e os teratomas contêm tecidos representativos de todas as três camadas germinativas. Perfil transcricional das linhas através da apresentação de dados de microarray de expressão global para um algoritmo de avaliação de pluripotência bioinformatic considera-se todas as linhas pluripotentes e, portanto, esta abordagem é uma alternativa atraente à experimentação animal. As novas linhas de iPSC prontamente podem ser usadas em experimentos a jusante, envolvendo a otimização da diferenciação e da engenharia de tecidos.
Introdução
A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) traz sobre potenciais terapias de substituição de células, doença e modelagem do desenvolvimento e drogas e triagem toxicológica1,2,3. Terapias de substituição conceitualmente pode ser alcançadas por injeção de célula, in vitro diferenciadas implantação de tecido (como patches cardíacas), ou guiada de regeneração por meio da engenharia de tecidos. O líquido amniótico (AFSC) e células-tronco da membrana (AMSC) também são uma excelente fonte de células para estas intervenções diretamente4....
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Protocolo
O protocolo segue as orientações institucionais do Comitê de ética para a investigação humana. Consentimento por escrito do paciente foi obtido usando o líquido amniótico para pesquisa.
Este protocolo segue as políticas do Comité de uso da Universidade do Sul do Alabama e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais amniótica primária
-
Chapeamento de células de líquido amnióticos
- Obter um mínimo de 2,5 mL de líquido amniótico colhido no processo de amniocentese por um médico.
Nota: Todos os manipulação de células vivas e tecido deve s....
- Obter um mínimo de 2,5 mL de líquido amniótico colhido no processo de amniocentese por um médico.
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Resultados
Consentimento informado por escrito de pacientes foi obtido antes da colheita de líquido amniótico para fins de teste genético e dedicando uma pequena alíquota do líquido para pesquisa. Sem consentimento é necessário para o uso da membrana amniótica na pesquisa como a placenta representa resíduos médicos. Células-tronco de líquido e membrana amnióticos exibir propriedades típicas de mesenquimais, morfologicamente suas células são fusiformes e fase-brilhante. Após reprogramação, as células.......
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Discussão
A fase inicial de geração de iPSC de células estaminais fetais implica a extração de células de origem de tecidos fetais, sua cultura, expansão e introdução dos Plasmideos reprogramação epissomal. Esta fase é seguida de um período de cultura de cerca de 14-18 dias antes das primeiras colônias totalmente reprogramadas podem ser expandidas. A fase final é a maturação dos clones iPSC. A extração inicial de células-tronco membrana amniótica é conseguida por meio de uma digestão mecânica e enzimática combinada do âmnio. Nós a.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fonds Medizinische pesquisa na Universidade de Zurique, Forschungskredit da Universidade de Zurique, o NMS SCIEXCh sob bolsas 10.216 e 12.176, a sociedade Suíça de Cardiologia, a ciência nacional suíço Fundação sob concessão [320030-122273] e [310030-143992], o 7º programa-quadro, a válvula de vida, a Comissão Europeia sob concessão [242008], a Olga Mayenfisch Foundation, Fundação EMDO, a concessão de start-up 2012 do Hospital da Universidade de Zurique, e financiamento interno do Instituto de câncer de Mitchell.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Dissociação de Tumor, humano | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | sistema de dissociação de tecido, kit de reagentes, inclui tubos de dissociação de tecido e enzimas de dissociação de tecido |
| gentleMACS Dissociador | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | sistema de dissociação de tecido, dissociador |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Bisturi Descartável No. 10, Estéril, Embalado Individualmente, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µ filtros de célula m | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 médio | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| plataforma de balanço | VWR | 40000-300 | |
| Tubos de centrífuga de 50 ml | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 meio basal | Lonza | CC-3156 | meio basal para meio AFMC |
| FGF 2 Humano (expresso em E. coli, não glicosilado) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, suplemento para AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, suplemento para meio AFMC |
| LR3 Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-1 Recombinante Humano | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, suplemento para AFMC médio |
| Soro Fetal Bovino, qualificado para células-tronco embrionárias | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | para AFSC / AMSC primário, para AFSC / AMSC de rotina não deve ser necessário, não use em meio para células transfectadas! |
| Solução de desprendimento celular Accutase | StemCell Technologies | 07920 | enzima de desprendimento celular |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | meio de congelamento completo |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | para isolamento de plasmídeo |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, fatores de reprogramação Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, fatores de reprogramação Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, fatores de reprogramação c-Myc+LIN28 |
| Espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop 2000c | Thermo-Fisher | ND-2000C | espectrofotômetro |
| Neon® Sistema de transfecção Sistema de transfecção | Thermo-Fisher | MPK5000 | componentes: Pipeta Neon - pipeta de transfecção Dispositivo Neon - dispositivo de transfecção |
| Neon® Sistema de Transfecção 10 µ Kit L | Kit de consumíveis Thermo-Fisher | MPK1025 | para o Sistema de Transfecção de Néon, contém: Ponta de néon - ponta de transfecção Tubo de néon - tubo de transfecção R - tampão de ressuspensão E - tampão eletrolítico |
| Stemolecule™ Butirato de Sódio | StemGent | 04-0005 | potenciador de moléculas pequenas de reprogramação |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 |
| Vitronectina XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, concentração de estoque 250 µ g/ml, usado para revestimento a 1 µ g/cm2 em tampão de diluição de vitronectina (CellAdhere) |
| CellAdhere™ Tampão de diluição | StemCell Technologies | 07183 | tampão de diluição de vitronectina |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | diluir com PBS a 0.5 mM antes de usar |
| EVOS® Sistema de Imagem FL | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | Sistema de microscópio de imagem LCD |
| CKX53 Microscópio Invertido | Microscópio de cultura de células de contraste de fase | Olympus | |
| Pierce™ 16% Formaldeído (w/v), Livre de metanol | Thermo-Fisher | 28908 | diluir a 4% com PBS antes de usar, diluído pode ser armazenado a 2-8 ° C por 1 semana |
| Tampão de permeabilização Perm III | BD Biosciences | 558050 | , resfrie a -20 ° C antes de usar |
| Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | controle de isotipo para Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | controle de isotipo para Sox2 |
| Mouse anti-humano Oct3/4 (Isoforma Humana A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-humano Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-humano Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| IgGM de camundongo, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | controle de isotipo para TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | controle de isotipo para TRA-1-81 |
| Mouse anti-humano TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-humano TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | controle de isotipo para SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Controle de Isotipo, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | controle de isotipo para SSEA-4 |
| Camundongo anti-humano SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Camundongo anti-humano SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-camundongo IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use a uma diluição de 1:600 ou otimize ainda mais |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use a uma diluição de 1:600 ou otimize ainda mais |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | solução estoque 10 mM, dilua ainda mais para 1:12.000 para uma solução de trabalho |
| Corning® Matrigel® Fator de crescimento reduzido, | camundongos corning | 356231 | matriz de membrana basal (BMM) |
| scid-bege, fêmeas | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | kit de isolamento de RNA |
| Frascos T-25, | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 tratados com cultura de tecidos, Thermo-Fisher tratados com cultura de tecidos | |||
| Prato de cultura de tecidos Nunc™ | Thermo-Fisher | 12-567-650 | Placa de cultura de tecidos de 10 cm |
| Placas de 6 poços, tratadas com cultura de tecidos | Câmara de contagem Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer (hemacitômetro) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Recipiente de Congelamento | Thermo-Fisher | 5100-0001 | recipiente de congelamento |
| Tubos FACS, Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo, | Tubos de | 352058 | 5 ml Tubos |
| Eppendorf, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml |
| Tubos de PCR, 200 µ l | Pontas de pipeta Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| , 100 a 1250 µ l | Thermo-Fisher | 02-707-407 | pontas estreitas de 1 mL ponteiras |
| de pipeta, 5 a 300 µ l | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| , 0.1 a 10 µ l | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| pontas de pipeta de diâmetro largo, 1000 µ l | VWR | 89049-166 | com pontas de 1 mL de diâmetro largo |
| Thermo-Fisher | 13-678-20A | ||
| etanol, misturador | de vórtice Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| VWR | 10153-842 | ||
| lamínula com câmara, vidro borossilicato de 8 poços, 1,5 mm | Thermo-Fisher | 155409 | utensílios de cultura de grau confocal com fundo de vidro |
| VWR | 82002-366 | agulhas 22G | |
| Thermo-Fisher | 22-253-260 | ||
| Solução de formalina, tamponada neutra, fixação de 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | de teratomas explantados |
| Microarray de expressão Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | , suportado por PluriTest, descontinuado pelo fabricante |
| Placa de matriz do genoma humano PrimeView U219 | de expressão de 901605 | Thermo-Fisher | (anteriormente marca Affymetrix), em breve será suportado pelo PluriTest |
| GeneChip™ Genoma Humano U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | microarray de expressão (anteriormente marca Affymetrix), suportado pela CellNet, em breve será suportado pelo PluriTest |
| PluriTest® | O Coriell Institute | www.pluritest.org, serviço gratuito de avaliação bioinformática da pluripotência, aceita dados de microarray - arquivos *.idat da plataforma HT-12 v4, em breve suportará dados de microarray U133, U219 e sequenciamento de RNA | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, serviço gratuito para identificação bioinformática do tipo de célula, incluindo células-tronco plutitentes, com base em dados de microarray U133 - arquivos *.cel, em breve suportarão RNA dados de sequenciamento |
Referências
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell....
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Reimpressões e permissões
