Summary
Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.
Abstract
Terapias baseadas em células autólogas tem um passo mais próximo da realidade com a introdução de células-tronco pluripotentes induzidas. Células-tronco fetais, tais como o líquido amniótico e membrana células-tronco mesenquimais, representam um único tipo de células indiferenciadas com promessa em engenharia de tecidos e para reprogramação para iPSC para futuras intervenções pediátricas e células-tronco bancário. O protocolo aqui apresentado descreve um processo otimizado para a extração e cultivo primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco e gerando epissomal induzida por células-tronco pluripotentes dessas células em cultura totalmente quimicamente definida condições utilizando vitronectina recombinante humana e o meio de E8. Caracterização das novas linhas através da aplicação de métodos rigorosos – citometria de fluxo, imagem latente confocal, formação de teratoma e criação de perfil transcricional – também é descrita. As linhas recém-gerado expressam marcadores de células-tronco embrionárias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – Apesar de ser negativa para o marcador SSEA-1. As linhas de células-tronco formam os teratomas em camundongos scid-bege em 6-8 semanas e os teratomas contêm tecidos representativos de todas as três camadas germinativas. Perfil transcricional das linhas através da apresentação de dados de microarray de expressão global para um algoritmo de avaliação de pluripotência bioinformatic considera-se todas as linhas pluripotentes e, portanto, esta abordagem é uma alternativa atraente à experimentação animal. As novas linhas de iPSC prontamente podem ser usadas em experimentos a jusante, envolvendo a otimização da diferenciação e da engenharia de tecidos.
Introduction
A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) traz sobre potenciais terapias de substituição de células, doença e modelagem do desenvolvimento e drogas e triagem toxicológica1,2,3. Terapias de substituição conceitualmente pode ser alcançadas por injeção de célula, in vitro diferenciadas implantação de tecido (como patches cardíacas), ou guiada de regeneração por meio da engenharia de tecidos. O líquido amniótico (AFSC) e células-tronco da membrana (AMSC) também são uma excelente fonte de células para estas intervenções diretamente4,5,6,7 ou como uma população inicial de célula para reprogramação em pluripotência8,9,10,11,12.
Abordagens iniciais utilizados sistemas de cultura indefinido ou reprogramação métodos que exigem integração genômica de sucessão legal de constrói9,10,11,12. Um estudo mais recente empregado um meio livre de xeno, apesar de uma matriz de acessório de membrana basal menos definida (BMM) foi usada, para gerar iPSC de células epiteliais de líquido amniótico. No entanto, o ensaio de formação de teratoma não foi incluído no estudo junto com uma riqueza de dados moleculares e in vitro. Células epiteliais de líquido amniótico foram encontradas para ter um rendimento aproximadamente 8 vezes maior reprogramação quando comparado aos fibroblastos neonatais13. Em outro estudo, células-tronco mesenquimais do líquido amniótico também foram encontradas para ser reprogramado para iPSC com muita eficiência maior12.
Células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em representante de tecidos de todas as 3 camadas do germe e, portanto, têm o potencial mais amplo. Pacientes pediátricos poderiam beneficiar a colheita, reprogramação e engenharia de tecidos de suas células-tronco autólogas amnióticos fluidas pré-natal e haste de membrana amniótica células perinatal. Além disso, o nível relativamente baixo de diferenciação de células-tronco fetais (menores que as células estaminais adultas14,15) poderia teoricamente ajuda na abordando a observada retenção de viés epigenéticas de células de origem em iPSC16.
Aqui nós apresentamos um protocolo para reprogramação de líquido amniótico e membrana células-tronco de pluripotência em quimicamente definidos xeno-free E8 médio na recombinação vitronectina17 (VTN) usando plasmídeos epissomal18. A principal vantagem das células líquido e membrana amnióticos como fonte de células para reprogramação reside na sua disponibilidade pré e perinatal e, portanto, esta abordagem beneficiaria principalmente pesquisa em engenharia de tecidos pediátrica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo segue as orientações institucionais do Comitê de ética para a investigação humana. Consentimento por escrito do paciente foi obtido usando o líquido amniótico para pesquisa.
Este protocolo segue as políticas do Comité de uso da Universidade do Sul do Alabama e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais amniótica primária
-
Chapeamento de células de líquido amnióticos
- Obter um mínimo de 2,5 mL de líquido amniótico colhido no processo de amniocentese por um médico.
Nota: Todos os manipulação de células vivas e tecido deve ser executada em um gabinete de tecido-cultura estéril e deve ser utilizado equipamento de proteção pessoal apropriado. Familiaridade com a cultura de célula básica e técnica estéril é necessária. - Preparar amniótico fluido e membrana celular (AFMC) meio de cultura: meio basal EBM-2, 15% de soro fetal bovino (FBS), 20 ng/mL de bFGF, 25 ng/mL de EGF, 10 ng/mL do IGF. Para cultura de células-tronco principal membrana amniótica de fluidos, bem como amniótico, o médio deve ser complementado com solução de antibiótico antimicótico.
- No dia 0, misture 2,5 mL de líquido amniótico com 3,5 mL de meio de cultura AFMC e placa em um frasco T25. Incube a 37 ° C e 5% CO2 pelo menos 48 h intacta antes de verificar a presença de colônias.
- No dia 5, colônias de células aderentes devem estar presentes. Suavemente agitar o frasco para desalojar as células que totalmente não aderir ao fundo e detritos e vácuo-Aspire a mistura de fluido amniótico/médio gastava com uma pipeta Pasteur. Substitua com 5 mL de meio fresco AFMC.
- Cultura por mais 5 dias. Médio de mudança todos os dias, conforme descrito na etapa 1.1.4.
- Obter um mínimo de 2,5 mL de líquido amniótico colhido no processo de amniocentese por um médico.
-
Isolamento de células-tronco mesenquimais primárias de âmnio humana
- Obter a placenta logo que possível após o nascimento, no prazo de 24 h, o mais tardar, para maximizar a integridade celular. Cortar um segmento de2 cm 9 do âmnio, remover coágulos e lave em um tubo de centrífuga de 50 mL com 30 mL de PBS suplementado com solução de antibiótico antimicótico.
- Pique as membranas usando um par de bisturis multar os pedaços em um prato de cultura de tecidos estéreis de 10 cm. A digestão das membranas e a extração das células serão alcançados através de um sistema de dissociação de tecido. Siga o protocolo do fabricante.
Nota: as peças as mais finas do tecido após picagem, quanto maior o número de células recuperado após a digestão. - Transferir a massa de tecido de membrana picada usando as lâminas de bisturi no tubo de dissociação de um tecido e misture com 4,7 mL de meio RPMI 1640. Misture as enzimas de dissociação (ver Tabela de materiais).
- Montar os tubos para o Dissociador de tecido e execute o programa "h_tumor_01". Incube os tubos a 37 ° C em uma plataforma de balanço por 30 min.
- Além disso, diluir as suspensões com 35 mL de RPMI 1640 e aplicar um filtro de µm 70 colocado sobre um tubo de centrífuga de 50 mL coleção.
- Centrífuga para min 5 a x 200 g à temperatura ambiente, descarte sobrenadante, resuspenda o pellet em 5 mL de RPMI 1640, contar as células usando um hemacytometer e placa em uma densidade de 10.000 células/cm2 nos vasos de cultura de tecidos tratados com recém preparada AFMC suplementado com solução de antibiótico antimicótico.
Nota: Em caso de digestão incompleta, pequenos pedaços de tecido estará presentes e células únicas será escassas. Spin para baixo novamente e a pelota toda a placa para um balão aferido de T75.
-
Cultura de primário AFSC e AMSC
- Colônias de passagem de AFSC/AMSC aspirando vácuo gasto médio com uma pipeta Pasteur e adicionar 2 mL de enzima de desprendimento de célula para o balão. Incube a 37 ° C, durante 5-8 min.
- Toque no frasco para ajudar a desalojar as células e misturar a suspensão com igual volume de meio AFMC (antibiótico-antimicótico suplemento não deve ser necessário a partir de agora). Centrifugar a 200 g de 4-5 min.. remover o sobrenadante usando ou um pipeta Pasteur de vidro ou simplesmente através da inversão do tubo e o esvaziamento-lo em um recipiente de resíduos.
- Apertar a parte inferior do tubo de centrífuga para quebrar acima a pelota em uma suspensão de célula única na gota de líquido restante e misture com meio AFMC de chapeamento. Placa T-balões em uma densidade entre 2.500 e 5.000 células/cm2.
- Médio de mudança todos os dias. Não as linhas de celular, além da passagem 6 cultura. Para fins de reprogramação, use como baixa uma passagem possível.
- Prepare estoques congelados de AFSC e AMSC como back-ups usando meio de congelação. Colheita de culturas usando uma enzima de desprendimento de célula, centrifugar 200g por 4 ° C por 5 min.
- Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e apertar a parte inferior do tubo para singularizar as células a pelota. Resuspenda em meio de congelamento completo em uma densidade de 1 × 106/mL e alíquota em cryovials. Guarde em um recipiente frio durante a noite a-80 ° C. Mova para o nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
2. reprogramação em pluripotência
- Obter os plasmideos reprogramação
- Compra os plasmideos reprogramação através de um repositório de plasmídeo sem fins lucrativos. É necessário um contrato de transferência de Material.
- Transformar os plasmideos em células competentes de Escherichia Coli e isolar o plasmídeo usando um kit de extração comercial do plasmídeo. Siga as instruções do fabricante.
- Medir a concentração de Plasmideo DNA utilizando um espectrofotômetro. Aponta para uma alta concentração de plasmídeo resultante, idealmente cerca de 1 µ g / µ l para evitar a diluição da amostra durante do transfection.
- Medir as concentrações dos Plasmideos individuais usando um espectrofotômetro UV e alíquota-los individualmente.
- Misture 3 µ g, 3 µ g e 2 µ g de EN2K, ET2K e M2L plasmídeos, respectivamente. Esta é a solução de plasmídeo a reprogramação. A quantidade de solução de plasmídeo é suficiente para transfect 1 x 106 células. Prepare vários tais alíquotas.
- Armazenar todas as alíquotas a-80 ° C.
- Preparar as placas de cultura de destino
- Revestir uma placa de 6 com vitronectina – adicione 1 mL de tampão de diluição vitronectina em cada poço e misturar em 40 µ l de solução-mãe VTN (1 µ g/cm2). Deixe em temperatura ambiente (RT) ou na incubadora a 37 ° C por 1h.
- Vácuo-Aspire a solução com uma pipeta Pasteur e substitua por 2 mL do meio AFMC em cada poço. Armazenar a 37 ° C até que as células estão a ser chapeado.
Nota: Importante: médio a AFMC utilizado nesta etapa não deve conter qualquer antibióticas ou antimicótico soluções.
- Culto de colheita principal AFSC/AMSC
Nota: Expanda AFSC/AMSC na cultura suficiente para fazer estoques congelados em um número de passagem baixa e escreve um balão T-75 para reprogramação. Desde como poucos como 100.000 células são suficientes para um experimento, visam colheita cerca de 500.000 células para compensar as perdas e se otimização dos parâmetros de transfeccao ou as condições de cultura diferentes devem ser testados.- O mais cedo possível em uma passagem baixa, colha a AFSC/AMSC usando mistura de enzima de desprendimento celular conforme descrito na etapa 1.3.1 a 1.3.2. Depois que as células têm sido centrifugadas, prossiga para a próxima etapa.
- Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS e misture bem para lavar os componentes do soro. Conte as células usando um hemacytometer. Ajuste a densidade da célula a 100.000/mL de PBS e alíquota para tubos de 1,5 mL microcentrifuge. Isso garante apenas um mínimo tempo de contato entre as células e o buffer usado para transfeccao.
- Coloque o tubo de microcentrifugadora em cima de tubos de poliestireno de 5ml (como adaptadores, permitirá centrifugação em um rotor de balanço regulares) e centrifugar x 200g por 4 min à temperatura ambiente. Inverter os tubos e descartar o sobrenadante para um contentor de resíduos. Não utilize um rotor de ângulo fixo.
- Execute uma etapa de centrifugação adicional a 200 x g por 3 min à temperatura ambiente. Isso permitirá que o restante líquido das paredes do tubo para coletar no fundo. Aspire cuidadosamente com tudo isso usando uma pipeta de 200 µ l.
- Transfecção com reprogramação plasmídeos
- Para reprogramação experimentos, um sistema de transfeccao (ver Tabela de materiais) será usado para entregar a reprogramação plasmídeos dentro das células. Coloque dicas de transfeccao, tubos de transfeccao, buffer de ressuspensão e eletrolítica reserva dentro do gabinete de cultura de tecidos. Os reagentes são mantidos em RT até que eles são abertos, em seguida, eles são armazenados a 4 ° C.
Nota: Nós usamos a versão de 10 µ l do kit. - Mova o dispositivo de transfeccao fechar para que a sua estação de tubo pode ser colocada diretamente dentro do gabinete. Encher um tubo de transfecção com 3 mL de tampão eletrolítica e montar o tubo para a estação, empurrando-a até dentro da ranhura.
- Leve o plasmídeo reprogramação alíquotas de solução preparadas na etapa 2.1.5 fora do armazenamento-80 ° C e permitir-lhes a descongelar no RT na cultura do armário.
- No dispositivo de transfeccao, selecione os seguintes parâmetros de transfeccao: 950 V, 40 ms e 1 pulso.
- Resuspenda o pellet contendo 100.000 células no buffer de ressuspensão 10 µ l. Trabalhar rapidamente deste ponto desde ressuspensão buffer é ligeiramente tóxico e um tempo de exposição maior resulta em uma menor viabilidade celular.
- Misture em 1/10 da solução de reprogramação do plasmídeo (a alíquota de solução foi preparada para um total de 1 x 106 células).
- Monte uma ponta de transfeccao na pipeta do transfection.
- Aspire a suspensão de células para a ponta do transfection cuidadosamente, evitando a formação de bolhas de ar. Se observam-se bolhas, expulsar a suspensão e repita a aspiração. Bolhas de ar impedirá do transfection.
- Insira a pipeta de transfeccao transfeccao e pressione o botão "START" na tela do dispositivo do transfection. Aguarde a mensagem de tela informando sobre o sucesso do transfection e retire a pipeta do tubo imediatamente.
- Expulse a suspensão em 1 bem da placa-alvo 6-bem preparada na seção 2.2. Misture no meio de uma vizinha bem e distribuir a suspensão igualmente em ambos os poços (a densidade celular resultante será 50.000/poço).
- Repita o transfeccao para todos os tubos de microcentrifuga contendo AFSC/AMSC individualmente. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
- Para reprogramação experimentos, um sistema de transfeccao (ver Tabela de materiais) será usado para entregar a reprogramação plasmídeos dentro das células. Coloque dicas de transfeccao, tubos de transfeccao, buffer de ressuspensão e eletrolítica reserva dentro do gabinete de cultura de tecidos. Os reagentes são mantidos em RT até que eles são abertos, em seguida, eles são armazenados a 4 ° C.
- Cultura da AFSC/AMSC transfectada
- Cultura das células transfectadas para 2-5 dias. Em seguida, alterne para reprogramação médio consistindo de E8 suplementado com 100 µM de butirato de sódio no dia 3.
Nota: Passagem secundária pode ser realizada para evitar o crescimento excessivo da fonte AFSC/AMSC. No entanto, a passagem irá desativar a opção para calcular a eficiência de reprogramação corretamente se este parâmetro for de interesse. - Altere o meio de reprogramação todos os dias para todos os dias por 10 dias. Mude o meio todos os dias do dia 10.
- Cultura das células transfectadas para 2-5 dias. Em seguida, alterne para reprogramação médio consistindo de E8 suplementado com 100 µM de butirato de sódio no dia 3.
- Colheita manual das colônias totalmente reprogramadas para expansão clonal
- Totalmente reprogramadas colônias aparecem em torno do dia 14. Permita colônias expandir em tamanho e se tornar compacto. Eles podem ser manualmente e transferidos para placas frescas logo em dia 15 e 16.
- 1 h antes do procedimento de colheita, revestimento de placas de 24 poços com 8 µ l de VTN em 300 µ l de tampão de diluição vitronectina por alvéolo (1 µ g/cm2) e incube a RT ou 37 ° C. Substitua a solução E8 meio sem butirato de sódio.
- Selecione colônias de tamanho suficiente (idealmente mais de 400 µm de diâmetro) em uma cultura estéril do armário. Pode ser usado um microscópio de contraste de fase ou um estereomicroscópio.
- Para a colheita, será usado um microscópio de imagem LCD colocado no armário desde que seu monitor elimina a necessidade de oculares. Esterilize o estágio de microscópio com etanol a 70%.
- Usando um microscópio de cultura de células de contraste de fase regular, selecione, marque e anote o número de colónias a ser escolhido. Isso é importante ter certeza de que o tempo não é desperdiçado para este processo durante a colheita real.
- Preencha um número de tubos PCR que é igual ou maior que o número de colónias a ser escolhido com 30 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) em PBS. Colónias serão colocadas para estes tubos para dissociação parcial antes do chapeamento.
- Plano para escolher 5 colônias de cada vez as chapas com uma pipeta de 10 µ l definida como 2 µ l. colocar a ponta da pipeta na posição inclinada na borda de colônia e cuidadosamente e gradualmente raspar toda a colônia fora da superfície. Imediatamente, aspirar toda a colônia para a ponta da pipeta e transferi-lo para um dos tubos de PCR preparados com EDTA.
- Repita com as restantes 4 colônias. Incube a RT por 4-6 min.
- Pipetar a suspensão e descer suavemente usando uma ponta de pipeta maior para a colônia se dividem em grupos menores. Evite a criação de uma suspensão de célula única.
- A suspensão da placa diretamente em um alvo bem de uma placa de 24 preparado na etapa 2.6.2. Repeti com as restantes colónias.
- Repita as etapas 2.6.6 através de 2.6.10 se mais de 5 colônias são para ser escolhido mas não escolher mais de 5 colônias de cada vez. Incube a 37 ° C e 5% de CO2.
- Expansão clonal e maturação de iPSC
- Permita colônias crescer e tornar-se compacto. 3-6 dias são suficientes. O meio de cultura mudam diariamente. Use entre 400 µ l e 1 mL de meio de E8 com base na densidade celular.
- Poços da placa de 24 poços com uma densidade suficiente de colônia serão expandidos em placas 6-boas. 1 h antes de passagem, revestir as placas de 6-poços com VTN (como na etapa 2.2.1). Em seguida, substitua a solução no poço com 2 mL do meio de E8 por bem.
- Aspirar o gasto médio dos poços de fonte usando uma pipeta de 1 mL e substituir com 300 µ l de 0,5 mM EDTA para lavar. Aspirar imediatamente usando a mesma ponta da pipeta e substituir com 300 µ l de 0,5 mM EDTA novamente e, em seguida, incubar a RT por 5 min. Aspire utilizando uma pipeta de 1 mL de líquido.
- Definir a pipeta de 1 mL de capacidade, montar uma dica de largo diâmetro 1 mL nele e aspire o meio E8 do alvo bem na ponta. Lave a cultura de iPSC de fonte com um fluxo de médio porte.
- Transferi a suspensão para o destino bem e pipetar subindo e descendo várias vezes para quebrar acima colônias em aglomerados de células de 20-50. Certifique-se que ser distribuídos uniformemente no poço pelo suave balançar e tremer a placa e incubam a 37 ° C e 5% de CO2.
- Mude o médio diariamente e passagem a cada 3 a 4 dias. Qualquer diferencia colônias podem ser marcadas sob o microscópio de contraste de fase e removido usando a ponta da pipeta na cultura do armário. Isto permite a propagação seletiva da cultura de iPSC puro de alta qualidade.
- 1 h antes de passagem, revestir os poços de uma placa de 6-poços com VTN como na etapa 2.2.1. Em seguida, substitua a solução com 2 ml do meio de E8 por bem.
- Rotina de passagem é semelhante a inicial passagem feito usando 0.5 mM EDTA (etapas 2.7.2 para 2.7.5). Substitua o gasto médio em um poço de uma placa de 6 com 1 mL de EDTA para lavar e descartar.
- Adicione 1 mL de EDTA e incubar a RT por 5-7 min para dissociação parcial. Otimizar o tempo de incubação se necessário, certificando-se de uma suspensão de ao redor 20 - a 50-célula aglomerados é produzido. Evite a dissociação em células únicas.
- Descartar a solução de EDTA e aspirar 1 mL do meio de E8 usando uma pipeta de 1 mL do alvo em uma ponta da pipeta de largo diâmetro.
- Lavar a cultura de iPSC de fonte com um fluxo do meio de E8 repetidamente até que uma parte desejada dele foi lançada da superfície e transferir para o alvo bem. Esta parte representa a proporção de divisão (por exemplo, 1/8 da cultura podem ser transferidos para um rácio de 1:8.)
- Passagem a cada 3-4 dias. Permitir que as linhas de iPSC amadurecer-se pelo cultivo-os pelo menos 15 passagens antes de usá-los em experimentos a jusante
3. caracterização e confirmação de pluripotência
Nota: Consulte os arquivos complementares para obter detalhes sobre citometria de fluxo e microscopia confocal.
-
Ensaio de formação de teratoma
- Para determinar a capacidade de iPSC de se diferenciarem em tecidos representativos de todas as três camadas germinativas, por ensaio de formação de teratoma, siga as políticas institucionais sobre cuidados com animais e uso, em frente a planear um prazo para a apresentação do protocolo apropriado documentos. A formação de teratoma em ratos leva entre 6-10 semanas.
- Cultura 4 poços de uma placa de 6 por linha de iPSC por 4 dias. O número aproximado de células injetadas em um flanco de um rato é de 0,5 a 1 x 106 células. Opcional: um extra bem pode ser dedicado para determinar um número representativo de célula em um poço por meio de dissociação unicelulares com uma enzima de desprendimento de célula e a contar.
- Calcular o volume da mistura E8/BMM as touceiras de iPSC serão suspenso em: ambos os flancos do mouse são injetados, cada um com 150 µ l de suspensão de moita. Três ratos são suficientes para testar a formação de teratoma de uma linha de iPSC. Incluem um extra de 150 µ l por agulha no volume resultante para compensar a perda de volume morto. 1 agulha por rato é usada. O volume total é, portanto, 3 * (150 µ l * 2 + 150 µ l) = µ l 1350
- Parcialmente dissocia as colônias de iPSC com EDTA como se fossem para ser passadas, conforme descrito nas etapas 2.7.8 para 2.7.10. É importante que as colônias ser dissociadas em aglomerados e não separadas em células únicas.
- Lavar fora das colônias de iPSC com 675 µ l de meio E8 (metade do volume calculado da etapa 3.3.3), usando uma dica de largo diâmetro. Transferi a suspensão de moita em um tubo de poliestireno de 5 mL. Coloque no gelo.
- Combine com 675 µ l de BMM. Manter a suspensão resultante no gelo até a injeção.
- Anestesiar os ratos para imobilizá-los usando o isoflurano. Isto deve ser realizado ou guiado por pessoal qualificado do viveiro.
- Vórtice o poliestireno 5ml tubo brevemente e aspire a suspensão de moita (450 µ l por rato) para seringa de um insulina equipado com uma agulha de 22g. 150 µ l de suspensão de célula Injecte por via subcutânea. Este volume contém aproximadamente 1 x 106 células (ver passo 3.1.2).
- Injecte 3 ratos por linha de iPSC. Segui a prática de cuidados de animais adequados para todos os procedimentos.
- Monitore a saúde dos ratos diariamente.
- Quando os teratomas alcançar um diâmetro de ponto de extremidade de 1,5 a 2 cm, eutanásia nos ratos, explantes os teratomas e armazená-los em solução de formalina para fixação de tecido por 24 h.
- Trazer os teratomas fixos para uma instalação de núcleo de histologia para hematoxilina eosina (H & E) coloração. Uma patologista vai nota a presença de tecidos de todas as três camadas germinativas.
Nota para cariótipo: Live iPSC culturas devem ser enviadas para especializada citogenéticos laboratórios para testes da integridade do cariótipo. É recomendável que este teste ser realizado cada 5 passagens.
-
Perfil transcricional
- Cultura 2 poços de uma placa de 6 por 3-4 dias para obter uma amostra de RNA. Utilize apenas culturas de alta qualidade, menor contaminação com diferenciação de células pode ser tratada por raspagem-los usando uma ponta da pipeta.
- Isole o RNA de culturas de iPSC usando um kit disponível comercialmente, seguindo o protocolo do fabricante. Enviamos amostras para uma instalação de núcleo especializado de genômica.
- Obter os perfis transcriptional globais das linhas de iPSC usando microarrays (ver Tabela de materiais para as opções com suporte) ou sequenciação do ARN.
- Envie arquivos de "*.idat" para avaliação de bioinformatic de pluripotência através de uma interface on-line no Instituto Coriell. Alternativamente, apresentar "*. cel" arquivos para identificação de bioinformatic tipo de células, incluindo células-tronco pluripotentes, através de uma interface on-line na Universidade Johns Hopkins. Consulte Tabela de materiais para obter detalhes sobre os tipos de dados, os ensaios individuais bioinformatic aceitam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Consentimento informado por escrito de pacientes foi obtido antes da colheita de líquido amniótico para fins de teste genético e dedicando uma pequena alíquota do líquido para pesquisa. Sem consentimento é necessário para o uso da membrana amniótica na pesquisa como a placenta representa resíduos médicos. Células-tronco de líquido e membrana amnióticos exibir propriedades típicas de mesenquimais, morfologicamente suas células são fusiformes e fase-brilhante. Após reprogramação, as células mesenquimais e epiteliais (MET) transição de submeter-se e adquirirem paralelepípedos, como morfologia e organização espacial das colônias, indicando Propriedades epiteliais. Esse processo é iniciado tão cedo quanto 48-72 h após a introdução de reprogramação epissomal plasmídeos. A ausência destas colónias por dia 5 de reprogramação indicaria fracasso do experimento. As células das colônias MET proliferam e como resultado, as colônias se tornar compactas, entre 5 e 14 dias. Compact MET colônias são compostas de células que não são individualmente facilmente perceptível (figura 1A). No próximo dia 14, totalmente reprogramadas colônias aparecem com células dispostas em uma monocamada, carregando proeminente, nucléolos e o núcleos facilmente discerníveis. Eles estão prontos para ser mecanicamente isolado e expandidas quando as colônias atingem um tamanho adequado e tornar-se compacta (figura 1B).
Totalmente e parcialmente reprogramadas colônias estão presentes nas culturas durante todo o período reprogramação, embora parcialmente reprogramadas colônias não necessariamente adquirir pluripotência completa. A Figura 2 mostra um representante fluxo cytometric análise da expressão de marcador de células-tronco embrionárias (ESC) em totalmente e parcialmente pluripotentes colônias e suas morfologias correspondentes. Pluripotência completa está associada com a expressão de Nanog, Oct4, Sox2, TRA antígenos e SSEA-4, enquanto expressão SSEA-1 é negativo19,20,21 (Figura 2A). Parcialmente as células pluripotentes, contudo, não expressam Nanog e TRA antígenos20 (Figura 2B). A expressão e a localização dos marcadores ESC deverão ser confirmados por immunocytochemical manchando e fotografada usando um microscópio de campo amplo ou confocal (Figura 3).
Uma confirmação funcional de pluripotência é alcançada, demonstrando a capacidade das linhas de iPSC para os teratomas formulário após injeção subcutânea das células em camundongos scid-bege. 6-8 semanas são necessários para os teratomas alcançar o tamanho de ponto de extremidade. H & E mancha dos tecidos e exame por um patologista é então realizada para confirmar a presença de representante de tecidos de todas as três camadas germinativas – neuroectoderma, endoderme e mesoderme (Figura 4A). Uma alternativa à experimentação animal é analisar a assinatura transcricional associada a pluripotência, abordagens genómicas como cDNA microarrays22,23. A proporção do perfil transcricional que sobrepõe-se com um de um pool de iPSC bem-estabelecida e ESC linhas então pode ser quantificada pelo software de avaliação de pluripotência bioinformatic on-line sob a forma de um terreno de dois classificadores – pluripotência e novidade (Figura 4B). Quanto maior a pontuação de pluripotência, mais a consulta iPSC linha assemelha-se as linhas estabelecidas. Uma pontuação alta novidade, no entanto, pode indicar desvios ou aberrações cromossômicas mesmo, apesar de uma alta de pluripotência Pontuação (tais como linhas de teratocarcinoma)22. Todas as linhas de iPSC geradas seguindo o protocolo aqui apresentado têm sido consideradas pluripotentes por citometria de fluxo, imagem, formação de teratoma e métodos de análise transcricional.
Figura 1: progressão morfológica das células durante a reprogramação. (A) o líquido amniótico e membrana células-tronco, que representam as células de origem para reprogramação, exibir uma morfologia típica de mesenquimal, alongada e fase-brilhante (à esquerda) até que elas experimentam a transição mesenquimais e epiteliais (MET) que leva à aquisição de propriedades epiteliais e formação de colônias com células de pedra, como godo (centro). Estas colônias proliferam e criar massas celulares irregulares de células MET (à direita). (B) em fases posteriores de reprogramação (a partir do próximo dia 14), colônias de células reprogramadas totalmente emergir – células individualmente discerníveis com núcleos proeminentes e nucléolos dispostos em monocamadas, com bordas bem definidas (centro) – e são presente ao lado de colônias MET que são mais numerosos (esquerda). Um clone maduro isolado totalmente reprogramado é retratado na direita. Barra de escala = 100 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fluxo cytometric análise da expressão de marcadores ESC em totalmente e parcialmente colônias de células reprogramadas (MET). (A) o perfil de expressão pluripotentes é positivo para Oct4, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81 e SSEA-4, enquanto negativo para SSEA-1. (B) parcialmente colônias de células pluripotentes – aqueles que têm sofrido MET mas não conseguiram avançar para completa pluripotência – são positivas para Oct4 e Sox2 mas Nanog, o TRA e SSEA antígenos estão ausentes. As morfologias associadas são incluídas para comparação lado-a-lado. Escala de barras = 200 µm e 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Confocal de imagem análise da expressão de marcadores ESC em iPSC de fluido amniótico maduro. Fatores de transcrição Oct3/4A, Nanog e Sox2 são localizadas nos núcleos enquanto TRA e SSEA antígenos são glicoproteínas localizadas na membrana. Barra de escala = 50 µm. imagens de maior ampliação (Mesclar 2 X) foram incluídas para Oct3/4, Nanog e Sox2 para melhor visualização de sua localização nuclear. Barra de escala = 25 µm. transmissíveis – imagens adquiridas na luz transmitida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: formação de Teratoma e criação de perfil transcricional no iPSC maduro de fluido e membrana amniótica. (A) Teratomas crescidos por via subcutânea em camundongos scid-bege contêm tecidos representativos de todas as três camadas germinativas (ampliação de 100 X). (B) os perfis de microarray de expressão global submetidos a pluripotência on-line software retornado um terreno de dois classificadores – pluripotência e novidade. Golo de pluripotência alta e baixa novidade scores - vermelhos nuvem - indicam um perfil de expressão de uma típica linha de iPSC/ESC. A nuvem azul representa uma área de aglomerado de células diferenciadas, enquanto a ténue nuvem azul representa uma área de cluster para parcialmente as células pluripotentes. O líquido amniótico (3 linhas) e iPSC de membrana (4 linhas) foram consideradas pluripotentes pelo teste. Uma linha ESC WA25 foi incluída como um controle e é identificada aqui com uma seta preta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A fase inicial de geração de iPSC de células estaminais fetais implica a extração de células de origem de tecidos fetais, sua cultura, expansão e introdução dos Plasmideos reprogramação epissomal. Esta fase é seguida de um período de cultura de cerca de 14-18 dias antes das primeiras colônias totalmente reprogramadas podem ser expandidas. A fase final é a maturação dos clones iPSC. A extração inicial de células-tronco membrana amniótica é conseguida por meio de uma digestão mecânica e enzimática combinada do âmnio. Nós achamos que um tempo de incubação de 30 min resultou em maior número de células extraídas com a mais alta viabilidade. O processo de digestão pode produzir pequenos pedaços de aglomerados de tecidos e células. Se a proporção destes em relação ao única células é alta, recomendamos chapeamento todos os grupos e células únicas dentro de um vaso, desde que todos podem contribuir para consequências das células aderentes. Chapeamento de células tronco de líquido amniótico é simples, como as células são apenas misturadas com meio de cultura e incubadas até colónias de células aderentes atingir um tamanho suficiente. Regular plasticware tratados com cultura de tecidos é perfeitamente adequado e não recomendamos superfícies de especialidade, mesmo que eles são destinados a cultura melhorada celular primária, desde que com estas observamos realidades e dificuldades com a passagem inferior processo.
O tronco de fluido e membrana amniótico células devem ser expandidas e estoques congelados, mas, o mais cedo possível, as células podem ser usadas como células fonte para reprogramação. A introdução dos Plasmideos epissomal dentro das células, o sistema de transfeccao usado aqui com os parâmetros de transfeccao conjunto para 950 V, com a finalidade de 40 ms e 1 pulso tem um desempenho muito bom, com todas as linhas tentada (finalmente com sucesso reprogramadas mais de 10 linhas). O principal sistema de entrega concorrente operam em um princípio semelhante não produziu uma experiência bem sucedida de reprogramação em nossas mãos.
As células transfectadas são semeadas em pratos vitronectina revestido em meio AFMC durante os primeiros 3-5 dias e, em seguida, o meio é alternado para E8 suplementado com butirato de sódio 100 µM. Isto aumenta a taxa de aquisição de pluripotência completo. Os primeiros sinais de transformação morfológica podem ser vistos logo em 48-72 h. Células de origem passam por MET e colônias de células com morfologia epitelial aparecem. Estes gradualmente proliferaram e tornar-se compacto. Um subconjunto das colônias adquirirá as características morfológicas de totalmente células estaminais pluripotentes – células individualmente discerníveis proeminentes núcleos e nucléolos, planas com fronteiras bem definidas, ao contrário das fronteiras difusos observadas colónias em parcialmente pluripotentes MET colônias. Após o momento da aquisição da pluripotência completa, as colônias de celular compactas MET adquirem núcleos proeminentes e as células individuais tornam-se perceptíveis ao criar um padrão único de morfológico. Para um olho treinado, este padrão é um sinal claro de reprogramação de sucesso. No entanto, para um investigador que carece de formação de cultura PSC, identificação das colônias que progrediram com êxito a pluripotência completa requer avaliação cuidadosa como clones MET e iPSC podem ser confundidos com outro. Figura 1 e Figura 2 fornecem exemplos de ambos. Se MET clones são colhidos em vez disso, análise de citometria de fluxo completo irá revelar o erro, e em particular, os antígenos TRA-1-60 e TRA-1-81 provavelmente estarão ausentes como mostrado na Figura 2. Com efeito, antígenos TRA anteriormente foram encontrados para ser marcadores de pluripotência rigorosas. No entanto, parcialmente pluripotentes MET células podem ser de interesse em pesquisa de câncer25.
Esta condição de cultura é qualidade inferior para a fonte de AFSC/AMSC e eventualmente, retardará sua proliferação e adquirirão uma alisador, fibroblasto, como morfologia. Células de origem formam tecidos que podem separar da superfície durante as fases posteriores da reprogramação, embora isso não afeta negativamente o processo de reprogramação. Pelo contrário, o processo às vezes leva a libertar espaço para as colônias reprogramadas, ao eliminar o material celular un-reprogramada indesejado. Moradia de tecidos podem ser descartados facilmente usando uma ponta de pipeta estéril, deixando parcialmente e totalmente pluripotentes colônias por trás, simplificando bastante a seleção manual a jusante.
Para a colheita manual das colônias totalmente reprogramadas, usamos um LCD de imagem de sistema, que pode ser colocado no gabinete de segurança, faltando partes salientes para fora que iria perturbar o fluxo de ar. Além deste sistema da imagem latente, nenhum equipamento especial é necessário que a colheita em si pode ser executada usando pipetas regulares. As colônias escolhidas são parcialmente dissociadas em solução de EDTA/PBS antes sendo banhado em poços de alvo a crescer como clones. Dependendo da linha e o clone, por diversas passagens, as culturas podem estar contaminadas com espontaneamente, diferenciando as células. Manipulação manual e passagem serial geralmente eliminam este problema. Clones crivados com extensa diferenciação devem ser descartadas, no entanto, clones preciosos podem ser salvo com vários graus de sucesso por meio de repetidas manual escolhendo das colônias pluripotentes, em vez de eliminação de diferenciar as células. Plasmídeos epissomal foram mostrados para levar cerca de 15 passagens para ser perdido completamente de iPSC26. Portanto, é aconselhável permitir que os clones a crescer durante pelo menos que o número de passagens antes de usá-los para aplicações a jusante e análises, com exceção de rotina de cariótipo e expressão do antígeno TRA. Expressão do antígeno TRA facilmente pode ser monitorado por citometria de fluxo, conforme descrito aqui no protocolo, desde que o ensaio só requer cerca de 200.000 células e pode ser realizado sempre que os pesquisadores estão em dúvida sobre se os clones cultivados estão mantendo pluripotência corretamente. Análise de citometria de fluxo da expressão marcador ESC não é considerado suficiente para confirmar a pluripotência em candidato linhas19.
Ensaio de formação de teratoma é o teste de padrão pluripotência conclusivo27. PSC cultivada em condições quimicamente definidas, xeno-livre são particularmente suscetíveis a dissociação induzida por morte e, portanto, injetá-las por via subcutânea como aglomerados é necessário para sua implantação bem sucedida de8,28. Após a injeção, geralmente 4-6 semanas são suficientes para o crescimento de xeno-enxertos para ser visível e antes da semana 8, só pode ser colhida, H & E-manchado e analisados. Bem-estar dos animal, custo e tempo teste períodos necessários são razões para o desenvolvimento de métodos alternativos. Análises genômicas combinado com avançado, abordagens de bioinformatic movidos a aprendizagem de máquina podem fornecer uma avaliação exata de perfis de expressão global. O custo de obtenção desses dados é comparável ao custo de ensaio de formação de teratoma, no entanto, a abordagem genômica é consideravelmente mais rápida e os animais não devem ser utilizados. Um tal ensaio é um de software de avaliação de pluripotência bioinformatic22. Ele é implementado como uma interface on-line (Tabela de materiais). A crescente popularidade e custo despencando de vontade de sequenciamento de RNA asseguram a continuidade desta abordagem. Uma alternativa para este software de pluripotência é disponível da Universidade Johns Hopkins23 (cellnet.hms.harvard.edu) e é baseada em uma abordagem semelhante e é capaz de aceitar dados de microarray para analisar a transcriptoma de amostras humanas. A vantagem deste software é que tem a capacidade de identificar não apenas as células-tronco pluripotentes, mas também células diferenciadas e, desde sua curadoria datasets foram derivada de tecidos primários, o nível de semelhança entre as células in vitro crescida / tecidos e tecidos in vivo podem ser determinados, proporcionando um excelente controle de qualidade para o desenvolvimento de protocolos de diferenciação ou de engenharia de tecidos. O teste tem a capacidade de classificar as consultas em 20 células diferentes ou tipos de tecido. Neste momento, requer dados de microarray, mas os autores estão trabalhando para expandir as opções de plataforma para RNA sequenciamento também.
Seguindo o protocolo apresentado, pesquisadores podem gerar linhas de iPSC de células-tronco de líquido e membrana amnióticos com uma altíssima reprodutibilidade no meio totalmente quimicamente definido e livre de xeno e usando um método de reprogramação não-integração. Estas linhas podem ser usadas em pesquisa básica para otimizar protocolos de diferenciação e, finalmente, na modelagem de doença, drogas tecido triagem ou pediátrico, estudos de engenharia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fonds Medizinische pesquisa na Universidade de Zurique, Forschungskredit da Universidade de Zurique, o NMS SCIEXCh sob bolsas 10.216 e 12.176, a sociedade Suíça de Cardiologia, a ciência nacional suíço Fundação sob concessão [320030-122273] e [310030-143992], o 7º programa-quadro, a válvula de vida, a Comissão Europeia sob concessão [242008], a Olga Mayenfisch Foundation, Fundação EMDO, a concessão de start-up 2012 do Hospital da Universidade de Zurique, e financiamento interno do Instituto de câncer de Mitchell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette - transfection pipette Neon device - transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
