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Genetics

Xenopus में CRISPR/Cas9-आधारित Leapfrogging के लिए मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/56035
Automatic Translation
1
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन उत्परिवर्ती लाइनों बनाने के लिए तकनीकी बाधाओं मुद्रा । Leapfrogging मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण के साथ जीनोम संपादन के संयोजन के लिए जंगली प्रकार germline उत्परिवर्तनों ले जाने जानवरों बनाने के द्वारा घातकता को दरकिनार । Leapfrogging F1 जनरेशन में homozygous null म्यूटेंट की कुशल पीढ़ी को भी परमिट देता है । यहां ट्रांसप्लांटेशन स्टेप का प्रदर्शन किया जाता है ।

Abstract

जीनोम संपादन द्वारा उत्परिवर्ती लाइनों के निर्माण के कई जीवों में आनुवंशिक विश्लेषण में तेजी लाने है । CRISPR/Cas9 तरीकों अफ्रीकी पंजे मेंढक, Xenopus, जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक पुराना मॉडल जीव में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है । CRISPR/Cas9-लक्षित mutagenesis के साथ homozygous उत्परिवर्ती लाइनों को बनाने के लिए पारंपरिक प्रजनन योजनाएं कई बार लेने वाली और श्रमसाध्य कदम हैं । उत्परिवर्ती भ्रूण के निर्माण की सुविधा के लिए, विशेष रूप से जीन है कि embryogenesis के लिए आवश्यक है दस्तक के साथ जुड़े बाधाओं को दूर करने के लिए, एक नई leapfrogging बुलाया विधि विकसित की गई थी । इस तकनीक को Xenopus भ्रूण की मजबूती leverages "कट और पेस्ट" embryological तरीकों । Leapfrogging कुशलता से मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) के हस्तांतरण का इस्तेमाल-mutagenized दाता भ्रूण PGC-ablated wildtype भाई बहनों में । इस विधि wildtype दैहिक कोशिकाओं है कि एक उत्परिवर्ती germline ले के साथ chimeric जानवरों बनाने के द्वारा आवश्यक जीन के कुशल उत्परिवर्तन के लिए अनुमति देता है । जब दो च0 पशुओं "फायनान्शियल प्रत्यारोपण" ले (यानी, उत्परिवर्ती रोगाणु कोशिकाओं) परस्पर है, वे homozygous, या यौगिक heterozygous, नल एफ1 भ्रूण, इस प्रकार एक पूर्ण पीढ़ी के लिए phenotypic डेटा प्राप्त करने के समय की बचत का उत्पादन । Leapfrogging भी मातृ प्रभाव जीन का विश्लेषण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो एफ के लिए दुर्दम्य रहे है0 phenotypic विश्लेषण निंनलिखित CRISPR/Cas9 mutagenesis । इस पांडुलिपि विवरण leapfrogging की विधि, कैसे सफलतापूर्वक PGC ट्रांसप्लांटेशन प्रदर्शन करने पर विशेष जोर के साथ ।

Introduction

कैसे जीनोटाइप encodes phenotype जीव विज्ञान में एक प्रमुख सवाल है मेंडेल कानूनों की पुनर्खोज के बाद से किया गया है । जीन की भूमिकाओं की समझ, उनके विनियमन और जीन नेटवर्क के भीतर बातचीत, और इनकोडिंग उत्पादों के कार्यों के लिए नए जीव विज्ञान और उंनति रोग राज्यों को उजागर करने के लिए उपकरण प्रदान करने का वादा किया । आधे से अधिक एक सदी के लिए1, अफ्रीकी पंजे मेंढक, Xenopus, बुनियादी जीव विज्ञान और जैव चिकित्सा में विषयों की एक विस्तृत विविधता पर अध्ययन के लिए एक अग्रणी मॉडल, विकास के आनुवंशिक नियंत्रण सहित किया गया है । ऐतिहासिक, Xenopus पर सबसे अधिक शोध allotetraploid मेंढक, एक्स. laevisका इस्तेमाल किया है, लेकिन हाल ही में, इसके diploidy के कारण, एक्स tropicalis एक amphibian आनुवंशिक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । पूरा जीनोम दृश्यों दोनों Xenopus प्रजातियों2,3से इकट्ठा किया गया है । "मेंढक समुदाय" एक मोड़ पर अब है, जहां बुनियादी जीनोम संशोधन प्रौद्योगिकी जीन समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, वस्तुतः पर होगा । programme CRISPR/Cas9 endonucleases अत्यधिक कुशल जीन के mutagenesis बनाया है, biallelic के अधिकांश कोशिकाओं में संभव उत्परिवर्तन के साथ पशु4,5,6,7, 8,9,10,11. ये अध्ययन, भट्टाचार्य एट अल द्वारा रेखांकित किया । १२ आणि Shigeta एट अल. 13, पता चला है कि कई जीन के समारोह एफ0 मोज़ेक पशुओं में mutagenesis द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं; हालांकि, Cas9-sgRNA-microinjected भ्रूण अक्सर कार्य (LOF) के अपूर्ण हानि के कारण चर phenotypes प्रदर्शित करते हैं । अधिक महत्वपूर्ण है, उत्परिवर्ती लाइनों की पीढ़ी के कुछ अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक लाभप्रद है-विशेष रूप से जब जीन है कि एक मातृ mRNA योगदान है अध्ययन । मातृ mRNAs और प्रोटीन, और epigenetics पर उनके प्रभाव, embryogenesis14,15,16में एक विस्तारित अवधि के लिए जारी रहती है, कई जीन के प्रारंभिक विकासात्मक योगदान प्रदान दुर्दम्य च0 िरा. इसलिए, अंय LOF approaches आवश्यक हैं ।

जब उत्परिवर्ती लाइनों बनाने की मांग, homozygous LOF भ्रूण प्राप्त करने के लिए पथ कई बाधाओं है । सबसे पहले, कुशल mutagenesis biallelic उत्परिवर्तनों का उत्पादन करने के लिए वंचित किया जा सकता है क्योंकि आवश्यक जीन कार्यों के नुकसान के लिए यौन परिपक्वता के लिए जीवित रहने की विफलता में परिणाम, एक व्यवहार्य लाइन के उत्पादन के साथ हस्तक्षेप । एक आम समाधान है Cas9-sgRNA की राशि का सावधान अनुमापन दिया । यहां, लक्ष्य के लिए घातकता को कम करने के बीच एक संतुलन हासिल करते हुए भी germline mutagenesis दक्षता अधिकतम है । एक दूसरी समस्या मानक प्रजनन योजना से उत्पंन होती है, जहां phenotypic विश्लेषणों को एफ2 पीढ़ी तक आस्थगित किया जाता है । मानक दृष्टिकोण का उपयोग करना, यौन परिपक्व च0 पशुओं कि germline के माध्यम से उत्परिवर्ती alleles संचारित एफ1 heterozygous "वाहक" है, जो तो यौन परिपक्वता के लिए हो रहे है उत्पादन को पार कर रहे हैं । दो च1 heterozygotes तो 25% की उंमीद Mendelian आवृत्ति पर एफ2 उत्परिवर्ती भ्रूण उत्पादन पार कर रहे हैं । इस प्रकार, प्रजनन के दो पीढ़ियों उत्परिवर्ती phenotypes के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । उत्परिवर्ती जानवरों या तो homozygotes या यौगिक heterozygotes (यानी, दो अलग उत्परिवर्ती alleles, जो माता पिता के एफ1 परस्पर में इस्तेमाल किया जानवरों के पादी पर निर्भर करता है युक्त संतति) हो सकता है ।

इन बाधाओं रोगाणु कोशिकाओं है, जो leapfrogging17बुलाया एक नई विधि पर निर्भर को परिष्कृत प्रोग्राम nuclease-मध्यस्थता mutagenesis द्वारा दूर किया जा सकता है । Leapfrogging दो मुख्य घटक है: (1) कैस के microinjection sgRNA, या nuclease-sgRNA परिसरों के साथ एक साथ mRNA (या, सिद्धांत, TALENs या जस्ता फिंगर nucleases में) एकल सेल मंच पर कुशलतापूर्वक mutagenize भ्रूण जीनोम, द्वारा पीछा किया (2) wildtype सहोदर भ्रूण में PGCs के प्रत्यारोपण, जहां अंतर्जात PGCs हटा दिया गया । जब दोनों कदम कुशल हैं, उत्परिवर्ती रोगाणु कोशिकाओं के साथ पूरा germline प्रतिस्थापन प्राप्त किया जा सकता है । Blackler 1960 के दशक में है कि Xenopus PGCs देर neurula और जल्दी tailbud चरणों में भ्रूण के बीच प्रत्यारोपण किया जा सकता है प्रदर्शन18,19। leapfrogging के लिए, Blackler के दृष्टिकोण ब्लासटुला चरण17में प्रत्यारोपण प्रदर्शन द्वारा संशोधित किया गया था, जब PGCs भ्रूण20,21के वनस्पति पोल में स्थानीयकृत रहे हैं । ट्रांसप्लांटेशन से पहले gastrulation दो मुख्य लाभ है । पहला, प्रत्यारोपण के engraftment और बाद में सामान्य विकास के लिए और अधिक कुशल जब प्रत्यारोपण ब्लासटुला मंच (अप्रकाशित टिप्पणियों) पर किया जाता है पाया गया था । दूसरा, ब्लासटुला प्रदर्शन करके चरण प्रत्यारोपण शीघ्र ही zygotic प्रतिलेखन के बाद शुरू हो गया है, एक विकासात्मक जीन उत्परिवर्तनों से उत्पंन होने वाली घातकता से बचने कर सकते है कि gastrulation बाधित या कि अंयथा विकृत देर neurulae के लिए सीसा । PGC प्रत्यारोपण-असर ("leapfrogged") भ्रूण यौन परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे हैं, और इन एफ के बीच परस्पर0 जानवरों का प्रदर्शन किया है कि, कई मामलों में, एफ1 संतति के १००% प्रदर्शन LOF phenotype (सबसे यौगिक जा रहा है heterozygotes), लक्षित उत्परिवर्तनों के साथ पूरा germline प्रतिस्थापन का संकेत है ।

उम्मीद की जा रही है कि leapfrogging Xenopusमें आनुवंशिक दृष्टिकोण में तेजी लाएगा । Leapfrogging भी मातृ प्रभाव जीन (अप्रकाशित टिप्पणियों) के LOF विश्लेषण के लिए "होस्ट स्थानांतरण" विधि22 के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। वर्तमान प्रकाशन में, विधि का विस्तृत वर्णन, विशेष रूप से PGC प्रत्यारोपण पर ध्यान केंद्रित करते हुए, x. tropicalis में प्रस्तुत किया गया है ( x. laevisके लिए छोटे संशोधनों के साथ) । PGCs के प्रत्यारोपण यहां का प्रदर्शन किया है इस प्रौद्योगिकी के अंय प्रयोगशालाओं के लिए एक और अधिक तेजी से हस्तांतरण की सुविधा के लिए Xenopusके साथ काम कर रहे । इस विधि के सिद्धांतों में सफल होना चाहिए अन्य उभयचर (जैसे, urodeles), और जीव-पद्धति में विशिष्ट संशोधनों के लिए आवेदन के लिए अनुमति देनी चाहिए कई अन्य जानवरों जिसमें कुशल mutagenesis पूरा किया जा सकता और PGCs आसानी से प्रत्यारोपण कर रहे हैं ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन के उपयोग की समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. PGC प्रत्यारोपण के लिए तैयारियां

  1. पहले वर्णित23के रूप में विच्छेदन उपकरण तैयार करें ।
    नोट: भौं बाल चाकू सर्जरी प्रदर्शन करते हुए भ्रूण को स्थिर करने के लिए एक बाल पाश की सहायता से चीरा बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. भौं बाल और बाल छोरों borosilicate ग्लास पाश्चर पिपेट है कि पहली बार एक लौ में तैयार किया गया है और thinned भाग पर टूट गया है में चिपके हुए हैं ( चित्र 1aदेखें, ऐरोहेड) अधिक निपुणता के लिए एक छोटा, संकरा टिप (चित्र 1b) बनाने के लिए जब सर्जरी प्रदर्शन ।
  2. पहले बताई गई कार्यविधियों का उपयोग करते हुए sgRNAs जनरेट करें24 ।
    नोट: संक्षेप में, लघु डीएनए sgRNAs के लिए कोडिंग टेंपलेट्स 5 ' भोजी T7 प्रवर्तकों, जो annealed है और "में भरा" एक त्रुटि से मुक्त, thermostable डीएनए पोलीमरेज़ युक्त अतिव्यापी deoxyoligonucleotides का उपयोग कर बनाया जाता है । इन विट्रो में sgRNA संश्लेषण प्रतिक्रियाओं रात भर के लिए कई घंटे के लिए मशीन कर रहे हैं (इस्तेमाल किया किट पर निर्भर करता है). प्रतिक्रियाओं DNAse-इलाज के लिए टेंपलेट को दूर कर रहे हैं । sgRNAs phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और अमोनियम एसीटेट/isopropanol वर्षण के मानक तरीकों से शुद्ध कर रहे हैं, किट निर्माता के निर्देश के अनुसार24।
  3. शीघ्र ही microinjections प्रदर्शन से पहले, Cas9-sgRNA परिसरों पहले denaturing द्वारा तैयार ~ २५० sgRNA के एक 3 µ एल कुल मात्रा में RNAse-नि: शुल्क (diethylpyrocarbonate-इलाज) एच2ओ पर 60-65 ° c के लिए 5 मिनट के लिए, बर्फ पर 5 मिनट के लिए त्वरित ठंडा द्वारा पीछा किया । कुछ सेकंड के लिए sgRNA केंद्रापसारक, 1 µ g/µ एल Cas9 प्रोटीन के 1 µ l जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन जटिल गठन को बढ़ावा देने के लिए ।
    नोट: इस मशीन के बाद, ट्यूब बर्फ पर रखा जा सकता है, जबकि microinjection के लिए भ्रूण की तैयारी ।
  4. X. tropicalis भ्रूण द्वारा इन विट्रो निषेचन मानक तरीकों का उपयोग कर, के रूप में पहले वर्णित के रूप में25प्राप्त करें । De-जेली25,26 10 मिनट के बाद में भ्रूण निषेचन ।
    नोट: निषेचन के समय माना जाता है के बाद शुक्राणु निलंबन अंडे में जोड़ा जाता है और पकवान 1/9thX मार्क संशोधित रिंगों (एमएमआर)26के साथ बाढ़ आ गई है । के लिए X । tropicalis25, X laevisके विपरीत, 3% cysteine मुक्त आधार (एचसीएल साल्टनहीं ) युक्त 1/9 डी में de-जेली प्रदर्शन, पीएच 7.8-8.0 करने के लिए समायोजित, 1/9 में एकाधिक बहाकर द्वारा पीछा किया एमएमआर । एक agarose करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण (1%)-कमरे के तापमान पर 1/
  5. तुरंत भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए एक 1% agarose लेपित एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एमएमआर युक्त पकवान इंजेक्ट किया जाएगा ।
  6. 1-सेल स्टेज पर सुई । Xenopus microinjection विधियों के विस्तृत विवरण के लिए26,27 संदर्भ देखें ।
    1. पशु पोल में एक ही साइट पर एक भ्रूण सुई, Cas9 के 4 nL-sgRNA परिसर के साथ (अंतिम राशि = 1 Cas9 के एनजी और ~ २५० sgRNA के स्नातकोत्तर; देखें चर्चा)24. इंजेक्शन साइट हीलिंग के 10-20 मिनट के बाद, एक agarose-लेपित 1/9 डिग्री सेल्सियस पर एमएमआर और मशीन युक्त पकवान को भ्रूण हस्तांतरण । इसके अलावा अनइंजेक्शन भाई भ्रूण कि भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं के रूप में सेवा करेंगे की एक डिश बनाएं ।
  7. पेट्री प्लेटें (६० mm) है कि एक ~ 5 मिमी-1% की मोटी परत शामिल तैयार agarose 0.3 x एमएमआर में किया, अगर x. tropicalis, या 1x एमएमआर में प्रत्यारोपण कर रहा है एक्स. laevisके लिए ।
    1. बनाने के लिए एक 3 एक्स 4-अच्छी तरह से मोल्ड (एक ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट काटने के द्वारा बनाई गई) पिघला हुआ agarose में जब प्लेटें डालने (देखें चित्रा 1C और D) । मोल्ड पकड़ो पेट्री पकवान एक अंगूठी से जुड़ी एक क्लैंप का उपयोग कर agarose कठोर है जब तक के नीचे से ऊपर कई मिलीमीटर ।
    2. इसके अतिरिक्त, 1% agarose की एक पतली परत के साथ कुओं कोटिंग द्वारा व्यक्तिगत भ्रूण घर के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली बनाने 1/
      नोट: संस्कृति माध्यम इन कुओं को जोड़ा 1/एमएमआर ५० के साथ पूरक है गेन्तमयसीं सल्फेट के µ जी/

2. PGCs की रोपाई

  1. जब भ्रूण बस Nieuwkoop तक पहुंचने और फेबर28 ब्लासटुला स्टेज 9 (चित्रा 2a), ~ ४.५ h बाद निषेचन (hpf) एक्स tropicalisके लिए, उंहें 25 डिग्री सेल्सियस मशीन से हटाने और उंहें एक अतिरिक्त के लिए कमरे के तापमान को equilibrate करने की अनुमति ०.५ एच.
  2. 5 hpf पर ट्रांसप्लांटेशन शुरू करने के लिए (चित्रा 2 बी), एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें एक PGC दाता भ्रूण हस्तांतरण (Cas9-sgRNA के साथ इंजेक्शन के लिए ६० mm agarose) अवसाद युक्त पकवान (१.७ चरण में बनाया) 0.3 x एमएमआर में (या 1x एमएमआर अगर एक्स laevisका उपयोग कर) । यह भी एक इंजेक्शन सहोदर भ्रूण, भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ता हस्तांतरण, इस डिश के लिए ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि इन भ्रूण में से प्रत्येक की पहचान भ्रमित नहीं कर रहे हैं ।
  3. मैंयुअल रूप से प्रत्येक भ्रूण से vitelline लिफाफे निकालें संदंश का उपयोग कर और दोनों भ्रूण बारी इतनी है कि उनके वनस्पति डंडे दृश्य में है और शल्य चिकित्सा के लिए सुलभ ।
    नोट: भ्रूण के मैनुअल डी-vitellination का विवरण पहले26बताया गया है ।
  4. एक भौं बाल चाकू के तेज टिप का प्रयोग, प्राप्तकर्ता भ्रूण के वनस्पति पोल पर एक वर्ग के आकार में चार उथले चीरा, क्षेत्र के अंदर, जहां भविष्य की बोतल कोशिकाओं है कि मार्क blastopore फार्म होगा । बस सतह के नीचे, भ्रूण में भौं बाल चाकू की नोक डालने के द्वारा चीरा बनाओ, और बाल पाश के साथ भ्रूण स्थिर जबकि ऊपर टुकड़ा करने की क्रिया आंदोलनों बनाते हैं ।
    नोट: चित्रा 2 एक भ्रूण के वनस्पति विचार से पता चलता है आधा घंटे के अंतराल पर 4.5-7.0 hpf से सेल आकार दिखाने के लिए और जहां बोतलों कोशिकाओं फार्म (धराशायी सफेद सर्कल) का आकलन करने के लिए एक गाइड प्रदान करने के लिए । उद्देश्य जहां धराशायी काले बॉक्स संकेत दिया है चीरा बनाने के लिए है ।
  5. एक बार वर्ग के चार पक्षों चीरा द्वारा delineated हैं, समान काटने गति का उपयोग करने के लिए blastocoel मंजिल की दूरी के लगभग 1/3 1/2 की गहराई तक पहुंचने के लिए भौं बाल चाकू के साथ प्रत्येक चीरा गहरा ।
  6. (वनस्पति सतह के समानांतर) एक क्षैतिज बनाने के द्वारा प्राप्तकर्ता भ्रूण (चित्रा 3 और बी) से वनस्पति ऊतक explant नि: शुल्क गहरी वनस्पति क्षेत्र में कटौती (ओं) ।
    नोट: PGC-युक्त वनस्पति explant का आकार लगभग 0.4-0.45 mm प्रति पक्ष और गहराई में 0.25-0.3 mm है । प्राप्तकर्ता भ्रूण से यह वनस्पति explant अब जरूरत नहीं है और इसलिए अलग से निर्धारित किया जाना चाहिए खारिज कर दिया जाएगा ।
  7. जल्दी से काम कर रहे, इस प्रक्रिया को दोहराने (2.4-2.6) PGC दाता भ्रूण पर एक इसी तरह के आकार के प्रत्यारोपण के लिए वनस्पति ऊतक टुकड़ा बनाने के लिए ।
    नोट: यह कम देरी के साथ इस दूसरे विच्छेदन के लिए प्राप्तकर्ता भ्रूण के लिए समय को कम करने के लिए अपने खुले घाव चंगा महत्वपूर्ण है ।
  8. एक बार PGCs युक्त ऊतक दाता भ्रूण से हटा दिया जाता है, भौं बाल चाकू और बाल पाश का उपयोग करने के लिए प्राप्तकर्ता भ्रूण में निर्मित खोलने में स्थिति में इस explant चाल ।
    नोट: दाता भ्रष्टाचार के आंतरिक सतह प्राप्तकर्ता भ्रूण के इंटीरियर का सामना करना पड़ रहा होगा । यह आवश्यक नहीं है पृष्ठीय-ventral के झुकाव और प्राप्तकर्ता भ्रूण के साथ भ्रष्टाचार के बाएं सही कुल्हाड़ियों मैच ।
  9. भौं बाल चाकू की शाफ्ट की लंबी बढ़त का प्रयोग करें, भ्रष्टाचार की सतह के समानांतर आयोजित, धीरे प्राप्तकर्ता भ्रूण की वनस्पति सतह में खोलने में भ्रष्टाचार को दबाएं ।
  10. एक बार भ्रष्टाचार रखा गया है, एक hairloop या एक भौं बाल चाकू का दस्ता धीरे agarose सतह भर में दाता भ्रूण के "लोथ" स्लाइड और एक agarose अवसाद में उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि लोथ के खुले घाव थोक तरल का सामना करना पड़ रहा है । यदि नहीं, तो इस अभिविन्यास को प्राप्त करने के लिए भ्रूण को घुमाने के लिए भौं बाल चाकू का उपयोग करें ।
  11. प्राप्तकर्ता भ्रूण स्लाइड, जगह में भ्रष्टाचार चिकित्सा के साथ, एक आसंन अवसाद में और इसी तरह यकीन है कि भ्रष्टाचारी वनस्पति पोल ऊतक थोक तरल सामना करना पड़ रहा है ।
  12. इस प्रक्रिया को दोहराएँ (कदम 2.1-2.11) दाता और प्राप्तकर्ता भ्रूण की एक और जोड़ी का उपयोग कर एक और प्रत्यारोपण बनाने के लिए/लोथ जोड़ी; इन खाली करने के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि एक संकेतन के लावे और प्रत्यारोपण के मिलान जोड़े का ट्रैक रखने के भ्रूण असर पड़ता है । दाता लावे का प्रत्यारोपण PGCs में Cas9-sgRNA-प्रेरित mutagenesis की दक्षता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में किया जाएगा, जो प्रत्यारोपण-असर पशुओं तक आसानी से नहीं परख सकता है (कदम ३.३, नीचे देखें, और चर्चा ).
  13. प्रत्यारोपण बनाने जारी रखें जब तक भ्रूण लगभग जल्दी गेसट्रुला चरण 10 है, जो लगभग ६.५ hpf में एक्स tropicalis (देखें चित्रा 2E) है तक पहुंचने ।

3. पोस्ट-भ्रूण की देखभाल चिकित्सा

नोट: भ्रष्टाचार के भीतर जगह में चंगा ~ 30 मिनट, और यह सेल से कुछ जर्दी मलबे का निरीक्षण करने के लिए सामांय है lysis (चित्रा 3सी) भ्रूण से ।

  1. एक बार चंगा, एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए बहुत धीरे एक agarose-लेपित 24 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं को अवसाद से भ्रूण हस्तांतरण । रिसाव स्थानांतरण के दौरान द्रव मिश्रण द्वारा (चित्रा 3 डी) हटा दिया जाएगा ।
    1. भ्रूण को घुमाएं ताकि वे वनस्पति-पोल ऊपर, थोक समाधान का सामना करना पड़ रखा है । फिर, बगल के कुओं में दाता लावे और भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं जगह भ्रूण जोड़े का ट्रैक रखने में सहायता करने के लिए; यह जानकारी रिकॉर्ड है ।
  2. रात भर संस्कृति के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए भ्रूण युक्त 24-खैर प्लेट स्थानांतरण ।
    नोट: अगले दिन, भ्रूण tailbud चरणों में पहुंच गया होगा ।
  3. भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं को agarose-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों को साफ करने के लिए ले जाएं 1/9 एमएमआर गेन्तमयसीं सल्फेट के ५० µ जी के साथ पूरक/एमएल, के साथ 1 भ्रूण प्रति अच्छी तरह से । दाता लावे कि इन भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ताओं से मेल का एक स्पष्ट रिकॉर्ड बनाए रखें ।
  4. पीसीआर amplicons5,17,24 या पीसीआर amplicons पर निर्भर है कि अन्य तरीकों का उपयोग करके mutagenesis दक्षता का आकलन करने के लिए ( चर्चादेखें), अलग-०.२ मिलीलीटर पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों के लिए ले जाएं । १०० µ l lysis बफर24 युक्त proteinase K (PK) द्वारा दोहराया अप-एंड-डाउन pipetting एक P200 पिपेट का उपयोग करके में अधिकांश मध्यम और homogenize निकालें ।
  5. ५६ डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण lysis24 प्रदर्शन करने के लिए 6 ज के लिए रात भर के लिए PK पाचन की अनुमति । 10 मिनट के लिए 90-95 ° c के लिए यह हीटिंग द्वारा PK निष्क्रिय, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए जल्दी ठंडा करने के बाद । प्रत्यक्ष सैंज डीएनए sequencing24के लिए लघु amplicons प्राप्त करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं बीज के लिए आगे की सफाई चरणों के बिना lysates का प्रयोग करें । lysates-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: कई दिनों के भीतर, tadpoles खिला चरणों (लगभग चरण 45-46) तक पहुंच जाएगा और planktonic पाउडर (सीरा माइक्रोन) का निलंबन खिलाया जा सकता है ।
  6. के बाद ~ 1 सप्ताह, संस्कृति माध्यम के दैनिक परिवर्तन के साथ सफाई बनाए रखने के लिए और माइक्रोबियल वृद्धि को कम करने, ड्रिप प्रवाह के साथ एक परिसंचारी जलीय प्रणाली में छोटे टैंकों को tadpoles चाल । कम mutagenesis दक्षता के साथ tadpoles से अत्यधिक कुशलता से mutagenized PGCs के साथ tadpoles अलग करने के लिए sequencing डेटा का उपयोग करें । एक बार कायापलट पूर्ण होने पर froglets को प्रयोगशाला में प्रौढ़ जलीय प्रणाली में ले जाएं ।
    नोट: राष्ट्रीय Xenopus संसाधन (समुद्री जीव विज्ञान प्रयोगशाला, वुड्स होल, MA) द्वारा विकसित आहार टैडपोल खिला29 और वयस्क मेंढक रखरखाव30के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं ।

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Representative Results

प्रत्यारोपण के बाद, CRISPR/Cas9 mutagenesis की प्रभावकारिता का गुणात्मक निर्धारण पशुपालन में प्रयास को विकसित करने के लिए और यौन परिपक्वता के लिए पशुओं को बनाए रखने से पहले किया जाना चाहिए । क्योंकि पशुओं फायनान्शियल प्रत्यारोपण ले जा रहे है दैहिक wildtype और germline सीधे माप के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल है, दाता भ्रूण के लावे की बचत महत्वपूर्ण हो जाता है । लावे से डीएनए विश्लेषण mutagenesis की हद है कि प्रत्यारोपण germline17में होता है के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है ।

mutagenesis की सफलता का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण जीनोमिक क्षेत्र को लक्षित किया जा रहा फैले पीसीआर amplicons सीधे अनुक्रम करने के लिए है । यह विशेष रूप से महंगा और अक्षम हो जाता है अगर एक के लिए कई जानवरों से अनेक व्यक्तिगत-क्लोन डीएनए टुकड़े अनुक्रम चाहता है । इसके बजाय, अनुक्रमण amplicons लक्ष्य स्थल पर विषम, के रूप में वे आनुवंशिक रूप से मोज़ेक भ्रूण से प्राप्त कर रहे हैं, प्रत्येक भ्रूण में mutagenesis दक्षता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है19। chromatograms के दृश्य जंगली प्रकार अनुक्रम (चोटियों) लक्ष्य अनुक्रम और चोटियों के ऊपर से पता चलता है हो "तले" (यानी, कई कुर्सियां प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड स्थिति में प्रदर्शित होने के लिए इसी चोटियों की सह घटना) के बहाव Cas9-catalyzed डबल किनारा तोड़ने की साइट । इस तरह के प्रोफाइल के उदाहरण ब्लिट्ज एट अलका आंकड़ा एस में पाया जा सकता है । 17. इन तले चोटियों द्वारा प्रतिनिधित्व mutagenesis की हद के सटीक quantitation एक अनुक्रम अपघटन एल्गोरिथ्म, ज्वार (https://tide-calculator.nki.nl/)31का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । व्यक्तिगत भ्रूण स्क्रीनिंग इस तकनीक का उपयोग कर विश्वास है कि प्रत्येक भ्रूण ठीक से इंजेक्शन और mutagenesis के लिए लक्षित था देता है । इस तरह के एक फ्लोरोसेंट टैग dextran के रूप में एक अनुरेखक, सफल इंजेक्शन24 की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी स्थापित करने में सहायता कर सकते हैं कि एक टैडपोल वास्तव में प्रत्यारोपित ऊतक (अप्रकाशित डेटा) ले जा रहा है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि औपचारिक संभावना है कि एक फ्लोरोसेंट dextran के साथ Cas9 के साथ coinjection-sgRNA Cas9 mutagenesis दक्षता बदल सकता है नहीं पता लगाया गया है । किसी भी "leapfrogged" खराब या unmutagenized दाताओं से प्रत्यारोपण युक्त भ्रूण को खारिज किया जा सकता है ।

Leapfrogging मानक आनुवंशिक प्रजनन योजनाओं में एफ2 पीढ़ी के विश्लेषण के लिए आवश्यकता को दरकिनार, एफ1 भ्रूण में कुशल phenotypic विश्लेषण की अनुमति देकर । जब मानक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए आवश्यक जीन रूपांतरित होना, सावधान Cas9 के अनुमापन-sgRNA खुराक संस्थापक भ्रूण की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, एक कम mutagenesis दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप. इस मानक योजना से च0 पशु जीवित तो wildtypes के साथ पार कर रहे है व्यवहार्य एफ1 भ्रूण, जो वाहकों की पहचान के लिए जांच की जाती है प्राप्त करते हैं । अंत में, इन च1 heterozygotes यौन परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे है और परस्पर homozygous F2 उत्परिवर्ती phenotypes प्रदर्शित व्यक्तियों को प्राप्त करने के लिए । इसके विपरीत, क्योंकि leapfrogging है कि जानवरों के उत्परिवर्ती alleles के साथ अपने germlines की पूरी प्रतिस्थापन है पैदा करता है, इन f0 पशु पार एफ1 पीढ़ी में उत्परिवर्ती phenotypes पैदा करता है । ब्लिट्ज एट अल । 17 की रिपोर्ट है कि एफ0 के बहुमत टायरोसिनेस (tyr) लोकस, जो melanocytes और रेटिना की रंजकता के लिए आवश्यक है पर लक्षित जानवरों की, १००% germline संचरण दिखाया (के साथ पार करने से मापा tyr-/-दाता के albino पशु) उत्परिवर्ती जीनोम व्युत्पन्न ( चित्रा 4a-बी और 1 तालिकादेखें) । इस प्रकार, परस्पर दो leapfrogging द्वारा उत्पादित पशुओं homozygous या यौगिक heterozygous उत्परिवर्ती एफ1 भ्रूण उपज होगा ।

इसी तरह के परिणाम17 homeobox में उत्परिवर्तनों को लेकर एफ0 leapfrogged पशु goosecoid (gsc) जीन के (डीएनए बंधन homeodomain एंकोडिंग) द्वारा प्राप्त किया गया ( चित्रा 4a, सी एच) देखें । Knockdowns ऑफ Gsc एक्सप्रेशन का उपयोग करते हुए morpholino antisense oligonucleotides में एक्स. laevis ने सुझाव दिया कि पूर्वकाल सिर३२के पूर्ण विकास के लिए Gsc जीन आवश्यक है, और Cas9-sgRNA इंजेक्शन tadpoles भी दिखाएँ भ्रूण घातक phenotypes१७. हालांकि, leapfrogged च0 पशु, दैहिक जंगली प्रकार जा रहा है, व्यवहार्य और मजबूत कर रहे हैं, और एफ1 परस्पर समान LOF के साथ भ्रूण का उत्पादन किया एक्स laevis knockdowns17में प्रकाशित उन लोगों को phenotypes । इन आंकड़ों में morpholino phenotype का आनुवंशिक मंडन प्रदान किया गया, साथ ही सिद्धांत का एक प्रमाण है कि leapfrogging भ्रूण घातक phenotypes को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक सामग्री । (क) Borosilicate ग्लास पाश्चर पिपेट जल्दी भ्रूण पर microsurgery के लिए भौं बाल चाकू और बाल छोरों बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । बाहर एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर गिलास ड्राइंग बालों के सम्मिलन के लिए एक संकरा अंत के लिए अनुमति देता है । लाल ऐरोहेड अनुमानित स्थिति है जिस पर कांच तोड़ने के लिए निशान । (ख) एक भौं बाल चाकू (ऊपर) और बाल पाश (नीचे), तेजी से सुखाने गोंद के साथ पिपेट में तय की एक उदाहरण । (ग) एक ९६-well पीसीआर प्लेट के एक हिस्से के लिए 1% agarose मोल्ड के आसपास जमना (agarose 0.3 X या 1x एमएमआर में किया जाता है की अनुमति देकर एक agarose प्लेट में अवसादग्रस्तता बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, पर निर्भर करता है कि ट्रांसप्लांटेशन एक्स tropicalis में किया जा रहा है या X. laevis, क्रमशः) । agarose की मोटाई ~ 5 मिमी है, 3-4 mm-गहरे कुएं के साथ । (D) प्रत्यारोपण के लिए एक agarose प्लेट का एक उदाहरण, 12 अवसादग्रस्तताओं के साथ, जैसा कि पैनल सीमें दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: देर ब्लासटुला के दौरान वनस्पति पोल के प्रारंभिक गेसट्रुला चरणों और विच्छेदन के लिए रणनीति के लिए आकृति विज्ञान । (क-च) Xenopus tropicalis भ्रूण आधे घंटे के समय अंतराल पर वनस्पति दृश्य में दिखाए जाते हैं, ब्लासटुला चरण 9 (४.५ hpf) की शुरुआत से जल्दी गेसट्रुला चरण ~ १०.२५ (7 hpf) । 5 hpf से पहले, blastomeres बड़े और अधिक आसानी से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं । सफेद, धराशायी सर्कल gastrulation के दौरान बोतल सेल गठन की उंमीद की स्थिति के निशान है, जो पैनल में पृष्ठीय पक्ष (ऊपर) पर शुरुआत बनाने देखा जा सकता है (ई और एफ) । leapfrogging के लिए, चार चीरा एक वर्ग के भीतर बना रहे हैं, काले डैश्ड लाइनों द्वारा चित्रित, एक अंतिम कटौती के साथ ऊतक की सतह के समानांतर बनाया (सचित्र नहीं) वनस्पति explant को मुक्त करने के लिए. स्केल बार = ४०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्यारोपण । (क) वनस्पति PGC-युक्त ऊतक को हटाने के बाद एक ~ ५.५ hpf भ्रूण का एक उदाहरण । काला डैश्ड बॉक्स और सफेद डैश्ड सर्कल आरेख 2में दिखाए गए के समान सापेक्ष आयाम होते हैं । (ख) पैनल ए, भीतरी सतह का सामना कर रहे दर्शक में भ्रूण से निकाले गए वनस्पति explant, प्रति पक्ष लगभग 0.4-0.45 मिमी और गहराई में 0.25-0.3 मिमी है । (ग) प्रत्यारोपित वनस्पति ऊतक के साथ एक भ्रूण । छवि का अधिग्रहण किया गया था ~ प्रत्यारोपण के बाद 10 मिनट । (घ) प्रत्यारोपण के बाद 30 मिनट, वनस्पति ऊतक जगह में चंगा किया है देखा जाता है (भ्रूण के ऊपर एक भौं बाल चाकू के साथ घूमता कोमल एक भंवर है कि दूर पैनल सीमें देखा मलबे बह बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था) । 25 डिग्री सेल्सियस पर 1/9 एमएमआर और मशीन के लिए स्थानांतरण के बाद, सबसे भ्रूण gastrulation पूरा सामान्य रूप से । स्केल बार = ४०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एफ0 leapfrogging द्वारा उत्पादित पशुओं से Germline संचरण । (क) leapfrogging के लिए, दो जीनों को CRISPR/Cas9, टायरोसिनेस (ऊपर) और goosecoid (नीचे) द्वारा निशाना बनाया गया. tyr जीन एक एन टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड (सपा, लाल छायांकन) के लिए कोडिंग अनुक्रमण (नीला छायांकन) के भीतर4,5 लक्षित किया गया था, जबकि gsc जीन में कोडिंग अनुक्रम के भीतर17 लक्षित किया गया था homeobox (लाल छायांकन), जो दो exons के बीच विभाजित है की शुरुआत । unमराठीमध्ये 5 ' व 3 ' exonic क्षेत्रे अनछायांकित आहेत. (ख) सभी १६० च1 tadpoles से (यह भी देखें तालिका 1) एक सहवास का एक leapfrogged च0 नर (LF1) और एक albino (tyr-/ मादा थे albino, संकेत है कि leapfrogged नर से संपूर्ण germline गया था tyr उत्परिवर्ती रोगाणु कोशिकाओं के साथ प्रतिस्थापित । इनसेट सामान्य रेटिना और melanocyte रंजकता के साथ एक जंगली-प्रकार टैडपोल से पता चलता है । (C-H) च1 दो एफ0 leapfrogged Xenopus लक्ष्यीकरण homeobox जीन gscके बीच एक परस्पर से व्युत्पंन भ्रूण । लगभग 2/3 भ्रूण केआरडीएस gscके लिए phenotypically उत्परिवर्ती थे, सिर (ई एच) के पूर्वकाल जनचेतना की डिग्री अलग किया जा रहा phenotype के साथ. म्यूटेंट में से आधे या तो cyclopic थे या एकदूसरे की जगह आंखें (च) थीं, जबकि दूसरे हाफ में अंधा (एच) थे. Genotyping ने इन homozygotes या यौगिक heterozygotes को दिखाया. जंगली प्रकार phenotype (सी, डी) दिखा भ्रूण के 1/3rd या तो homozygous जंगली प्रकार या heterozygotes थे । सीटू संकरण में otx2 के लिए (forebrain, midbrain, और आंखों का एक मार्कर), egr2 (hindbrain rhombomeres के एक मार्कर 3 और 5, और तंत्रिका शिखा की एक धारा), और hoxb9 (रीढ़ की हड्डी का एक मार्कर) से पता चलता है कि नुकसान का gsc फ़ंक्शन केवल पूर्वकाल भाग को otx2 डोमेन को प्रभावित करता है । इन आंकड़ों ब्लिट्ज एट अल से reproduced रहे हैं । 17 . जीव की कंपनी से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पार पुरुष महिला albino जंगली प्रकार कुल % Albino
1 LF1 tyr-/ १६० 0 १६० १००
2 lf2 tyr-/ १४८ 0 १४८ १००
3 tyr-/ LF3 ४०९ 0 ४०९ १००
4 tyr-/ LF4 0 ५१९ ५१९ 0
5 tyr-/ LF5 २२३ 0 २२३ १००
6 LF6 tyr-/ ४९३ ७०३ ११९६ ४१.२
7 tyr-/ LF7 1 ९४ ९५ १.१
8 tyr-/ LF8 १२५ 0 १२५ १००
9 tyr-/ LF9 0 ४१७ ४१७ 0
10 tyr-/ LF10 २५२ 0 २५२ १००

तालिका 1: फायनान्शियल प्रत्यारोपण द्वारा कुशल germline प्रतिस्थापन टायरोसिनेसमें उत्परिवर्तनों ले जाने । लक्ष्यीकरण टायरोसिनेस, प्रत्यारोपण-दोनों लिंगों के जानवरों का असर प्राप्त किया गया । इन जानवरों albinos, जो homozygous है के साथ पार कर रहे थे tyr-/-, उत्परिवर्ती alleles के germline संचरण की दक्षता के लिए परीक्षण करने के लिए, और च1 भ्रूण है कि दिखाया एल्बिनिज्म का प्रतिशत टैडपोल मंच पर परख की गई थी । "पुरुष" और "मादा" लेबल वाले स्तंभों में प्रविष्टियों का संकेत है कि कौन सा पेरेंट या तो tyr-/या leapfrogging (वामो) से व्युत्पंन परीक्षण पशु है । एक पार albino phenotype दिखाने के भीतर भ्रूण का प्रतिशत "% albino के तहत संकेत दिया जाता है." ध्यान दें कि फायनान्शियल प्रत्यारोपण के साथ 10 जानवरों के 6 उत्परिवर्ती alleles के साथ पूरा (१००%) प्रतिस्थापन दिखाया । इस तालिका ब्लिट्ज एट अल से reproduced है । 17, अनुमति के साथ ।

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Discussion

यह रिपोर्ट PGCs युक्त वनस्पति ऊतक के प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. PGCs के प्रत्यारोपण के जीनोम के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है संपादन प्रौद्योगिकियों (जैसे, CRISPR/Cas9) एक जानवर के germline को संशोधित करने के लिए जबकि आनुवंशिक रूप से जंगली प्रकार के रूप में अपने दैहिक ऊतकों के लगभग सभी को बनाए रखने. leapfrogging सफल होने के लिए, वहां महत्वपूर्ण कारकों की एक संख्या के लिए प्रदर्शन प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने से पहले विचार कर रहे हैं ।

उत्परिवर्ती alleles के साथ germline की पूरी प्रतिस्थापन सुनिश्चित करने के लिए, यह सिफारिश की है कि एक पहले sgRNAs की vivo दक्षता में निर्धारित करता है । अनुभव पता चलता है कि ज्यादातर sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) या CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) द्वारा डिजाइन कुशल जब २५० स्नातकोत्तर/ हालांकि, कुछ मामलों में, यह उच्च सांद्रता का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है (उदा, ब्लिट्ज एट अल17द्वारा प्रकाशित gsc sgRNA, आवश्यक ~ 1 एनजी/ लक्ष्य साइट के mutagenesis की दक्षता का आकलन आवश्यक है और ज्वार का उपयोग एक मात्रात्मक मूल्यांकन31परमिट । जबकि विधि यहां पर बल दिया पीसीआर amplicons के प्रत्यक्ष सैंज अनुक्रमण का उपयोग करता है (F0 भ्रूण में उत्परिवर्ती alleles की आबादी का प्रतिनिधित्व), कई अंय तरीकों इस प्रयोजन के लिए जीनोम संपादन साहित्य में इस्तेमाल किया गया है । अंय कम करने वाली मध्यम लागत तकनीक है कि सामांयतः उपयोग किया जाता है टुकड़ा लंबाई बहुरूपता प्रतिबंध एंजाइमों३३ या Cas9/तलेन दरार साइटें३४, T7 endonuclease 1३५ और सर्वेयर के नुकसान का उपयोग कर विश्लेषण शामिल ३६ परख, heteroduplex गतिशीलता परख३७, उच्च संकल्प पिघल परख३८, केशिका ट्रो३९,४०द्वारा टुकड़ा विश्लेषण, और qPCR आधारित तरीकों४१, ४२.

एक दूसरे विचार लक्ष्य जीन के भीतर लक्ष्य स्थल स्थान का चुनाव है । के लिए एफ1 पीढ़ी में उत्परिवर्ती phenotypes के कुशल वसूली की अनुमति, यह पूरा LOF alleles के लिए मौका अधिकतम महत्वपूर्ण है । जब उत्परिवर्ती लाइनों के शास्त्रीय दृष्टिकोण का उपयोग कर यह एक आम रणनीति के पास Cas9 दरार को लक्षित करने के लिए कोडिंग क्षेत्रों के 5 ' अंत के पास है, प्रोटीन क्षेत्र कोडन की शुरुआत के पास समय से पहले अनुवाद समाप्ति बटोरना । एफ1 heterozygotes frameshift उत्परिवर्तनों के साथ की पहचान की जाएगी, और इन जानवरों को आगे काम के लिए चुना जाएगा क्योंकि वे शूंय alleles ले जाने की उंमीद कर रहे हैं । क्योंकि leapfrogging रणनीति F0 परस्पर, कोडिंग अनुक्रम के 5 ' अंत लक्ष्यीकरण के दृष्टिकोण अत्यधिक अक्षम होगा का उपयोग करता है । च0 भ्रूण मोज़ेक germlines है, और एफ1 म्यूटेंट की आबादी में परस्पर परिणाम है कि ज्यादातर17heterozygotes यौगिक हैं । के बाद से बड़े पैमाने पर विश्लेषण सत्यापित करता है कि, औसत पर, डबल-किनारा टूटता द्वारा उत्पादित उत्परिवर्तनों की उंमीद ~ 1/3rd में हैं-फ्रेम४३, सबसे एफ1 इस फैशन में उत्पादित भ्रूण एक के साथ कम से एलील होगा एक फ्रेम उत्परिवर्तन कि जंगली प्रकार गतिविधि बनाए रखने हो सकता है । इसलिए, एक अलग रणनीति सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि इन में भी इन-फ्रेम उत्परिवर्ती alleles अशक्त होने की संभावना है । लक्ष्यीकरण डबल किनारा प्रोटीन के भीतर तोड़ता है कि सामांय प्रोटीन समारोह के लिए आवश्यक है डोमेन को पूरा LOF (अशक्त alleles)17,४४के एक उच्च मौका में परिणाम की उंमीद है । परमाणु स्तर संरचना के लिए सावधान विचार (ओं) प्रोटीन डोमेन, जब उपलब्ध है, द्वितीयक संरचना के क्षेत्रों की पहचान में सहायता कर सकते है कि, यहां तक कि जब एक एमिनो एसिड युक्त में-फ्रेम विलोपन, डोमेन संरचना बाधित करने की संभावना हो सकती है ( उदा, ब्लिट्ज एट अल17द्वारा प्रकाशित gsc में Δ3bp उत्परिवर्तन) । CRISPR/Cas9 लक्ष्य साइट्स इन क्षेत्रों में पहचाना जा सकता है, तो एक सफलतापूर्वक नल alleles बनाने का एक उच्च मौका है । अधिक लचीले क्षेत्रों में उत्परिवर्तनों अभी भी कार्यात्मक प्रोटीन में परिणाम हो सकता है क्योंकि प्रोटीन माध्यमिक संरचनात्मक घटकों के बीच विलायक उजागर छोरों के भीतर छोटे विलोपन कम वांछनीय हैं ।

leapfrogging के लिए एक तिहाई विचार प्राप्तकर्ता भ्रूण से PGC हटाने की क्षमता है । इस कदम को पूरा germline प्रतिस्थापन सुनिश्चित करने के क्रम में कुशल होने की जरूरत है । यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि सभी भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं विधि द्वारा उत्पादित भ्रूण उनके PGCs की पूरी तरह से हटाने की है । पूरे माउंट सीटू hybridizations में PGC मार्कर के स्थानीयकरण में ब्लासटुला चरण भ्रूण में परिवर्तनशीलता दिखाएं । कई मामलों में, सभी या लगभग सभी संकेत वनस्पति भ्रूण के सबसे अंत के पास पाया जाता है और इसलिए यहां उल्लिखित सर्जरी द्वारा हटा दिया जाएगा (ब्लिट्ज एट अल.17 और प्रशस्ति पत्र उसमें) । हालांकि, कुछ भ्रूण blastocoel मंजिल के करीब कुछ कोशिकाओं में PGC मार्कर अभिव्यक्ति दिखाते हैं । रोगाणु प्लाज्म पहले निषेचन के बाद वनस्पति पोल पर coalesces और फिर जल्दी क्लीवेज के दौरान क्लीवेज furrows के साथ बह जाता है । कुछ रोगाणु प्लाज्म वनस्पति गोलार्द्ध के बीच में कोशिकाओं में वितरित हो सकता है और प्रभावी ढंग से प्रत्यारोपण कि blastocoel करने के लिए विस्तार का उपयोग कर के बिना हटा नहीं । हालांकि, यह भी ध्यान दें कि इन गहरी कोशिका मार्करों युक्त कोशिकाओं germline के लिए योगदान नहीं हो सकता है महत्वपूर्ण है, के रूप में microRNAs PGC mRNAs से दैहिक कोशिकाओं४५,४६स्पष्ट करने के लिए जाना जाता है । इन गहरी PGC मार्करों के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं दैहिक ऐसी मंजूरी के दौर से गुजर कोशिकाओं हो सकता है । तरीकों प्राप्तकर्ता भ्रूण से पूरा PGC हटाने सुनिश्चित करने के लिए वर्तमान में विकसित किया जा रहा है ।

अंत में, यह भी विचार करने के लिए कितने एफ0 जानवरों leapfrogging द्वारा उत्पंन करने के लिए महत्वपूर्ण है । जानवरों की एक चर संख्या के रूप में यौन परिपक्वता के लिए जीवित नहीं होगा, यह अनुशंसित है कि 20 से अधिक प्रत्यारोपण युक्त भ्रूण बनाया जाता है । यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त जीवित पशुओं के लिए आवश्यक हो जाएगा (1) कि दोनों लिंगों की पर्याप्त संख्या और प्राप्त किया जाएगा (2) कि इन एक पर्याप्त उच्च आवृत्ति पर उत्परिवर्ती alleles संचारित करने के लिए शोधकर्ता द्वारा की योजना बनाई विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो ।

प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, कुछ अभ्यास के साथ, amphibian embryologists कुछ अभ्यास के साथ PGC प्रत्यारोपण तकनीक मास्टर करने में सक्षम होना चाहिए । Leapfrogging संभव होना चाहिए, न केवल अन्य उभयचर में, बल्कि PGCs युक्त अन्य जीवों का भी है जो embryogenesis के प्रारंभिक दौर में व्यक्तियों के बीच आसानी से प्रत्यारोपित होते हैं.

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह कार्य राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य एवं मानव विकास संस्थान से अनुदान, 5R21HD080684-02 के सहयोग से किया गया । लेखक अपने सतत उत्साह और समर्थन के लिए केन चो शुक्रिया अदा करना चाहता है । लेखक भी अपने कैमरे के उपयोग के लिए ब्रूस ब्लमबर्ग स्वीकार करना चाहते हैं, रिबका Charney, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए, और शॉन McNamara और मार्सिन Wlizla राष्ट्रीय Xenopus संसाधन पर (RRID: SCR_013731), के लिए बहुमूल्य X. tropicalis खिला और पशु देखभाल परहेजों के बारे में बातचीत ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife Homemade
Hair loop Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass Fisher Scientific 13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) Elmer's Products, Inc. KG581 To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered Integrated DNA Technologies Custom ordered Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit Ambion/ThermoFisher AM1334 Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Chemical Co. D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal PNA Bio, Inc. CP01 Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates Falcon 351007
24-well plates Falcon 3047
L-Cysteine Sigma Chemical Co. C7352-100G Free base, not HCl salt
Proteinase K Roche 03 115 828 001 Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron sera Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers

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आनुवंशिकी अंक १३२ Xenopus जेनेटिक्स म्यूटेंट CRISPR/Cas9 तलेन जीनोम संपादन mutagenesis समारोह के नुकसान
<em>Xenopus</em> में CRISPR/Cas9-आधारित Leapfrogging के लिए मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण
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Blitz, I. L. Primordial Germ Cell… More

Blitz, I. L. Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus. J. Vis. Exp. (132), e56035, doi:10.3791/56035 (2018).

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