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Neuroscience

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56092

Summary

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Abstract

Il AWESAM (un low-costo easy stellate unstrocyte metodo) protocollo comporta un modo veloce, semplice e poco costoso per generare grandi quantità di in vivo-piace monocolture di astrociti di topo e di ratto : Le cellule cerebrali possono essere isolate da diverse regioni del cervello, e dopo una settimana di coltura delle cellule, cellule non-astrocytic sono scrollate di dosso inserendo i piatti di cultura su un agitatore per 6 h nell'incubatrice. Gli astrociti rimanenti sono quindi attraversati in nuove piastre con un mezzo di Astrocita-specifici (chiamato NB + H). NB + H contiene basse concentrazioni di eparina-legante EGF-like growth factor (HBEGF), che viene utilizzato al posto del siero in mezzo. Dopo essere cresciuto in NB + H, gli astrociti AWESAM hanno una morfologia stellare e processi impercettibili e funzionalità. Inoltre, questi astrociti hanno più in vivo-come l'espressione genica di astrociti generati dai metodi precedentemente pubblicati. CA2 + imaging, dinamiche della vescicola e altri eventi vicino la membrana possono essere studiati così nello bene processi astrocytic in vitro, ad esempio, utilizzando cellule vive confocale o microscopia TIRF. In particolare, gli astrociti AWESAM inoltre esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione simile a astrociti in vivo.

Introduction

Astrociti influenzano la funzione del cervello attraverso supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità e comunicazione intercellulare - che sono tutti meccanismi che centro attorno i processi astrocitari sottili. Il protocollo AWESAM descritto qui permette lo studio di questi processi senza interferenze da parte di neuroni e glia altri, che è utile per esempio, perché l'espressione di molte proteine e anche di Ca2 + segnalazione si sovrappongono in tutto cellula cerebrale diversa tipi. Inoltre, questo metodo supera i limiti delle tecniche precedentemente disponibili. In particolare, il nostro protocollo prevede in vivo-come morfologia (astrociti stellari con sottili processi) e l'espressione genica in un veloce, facile e modo a buon mercato.

Morfologia delle cellule, espressione genica e molti altri processi normativi sono direttamente influenzati dall'ambiente. In una piastra di coltura, si riferisce a fattori rilasciati dalle cellule circostanti, ma anche il mezzo in cui le cellule sono cresciute. Per gli astrociti, HBEGF precedentemente è stata segnalata per indurre una morfologia stellari1 ma è stato anche trovato per-differenziare gli astrociti2. Tuttavia, concentrazioni più basse di HBEGF più successivamente sono state utilizzate per la generazione di più nel vivo-come astrociti come identificato tramite sequenziamento di RNA in due differenti protocolli3,4. Inoltre, la morfologia del astrocyte cambia con la composizione media, indipendentemente dal protocollo4: Neurobasal medio con una bassa concentrazione di HBEGF è ottima per la coltivazione di astrociti stellari, mentre altre composizioni medie (ad es., contenenti siero DMEM) produrre cellule poligonali (anche negli astrociti appena isolati di immunopanning).

Il protocollo AWESAM sormonta gli svantaggi delle precedenti tecniche per la coltivazione del astrocyte monocolture4. Tecniche precedenti per la coltivazione di monocolture Astrocita presentano i seguenti svantaggi: morfologia poligonale, che è inconsueta che gli astrociti stellari in vivo (MD metodo)5; la lunghezza e il costo del protocollo (preparazione astrociti da prende le cellule staminali pluripotenti indotte tre mesi e richiede molti reagenti, compresi costosi fattori di crescita)6; la bassa quantità di materiale (metodo immunopanning)3; e la de-differenziazione degli astrociti e requisito di una matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. al contrario, fornisce il protocollo AWESAM: in vivo-come la morfologia (astrociti stellari con sottili processi); un veloce, facile e a buon mercato metodo; grandi quantità di materiale; e di più nel vivo-come espressione genica rispetto a immunopanned e astrociti di MD. Inoltre, cultura 2D consente lo studio di segnalazione di Ca2 + e riciclaggio in sottili processi e in eventi vicino la membrana della vescicola (ad es., microscopia TIRF non è possibile in 3D culture).

Il metodo di MD è stato ampiamente utilizzato dalla sua pubblicazione nel 19805, che offre una tecnica semplice e veloce per monocolture Astrocita poligonale. In breve, il metodo di MD comporta crescita cellule cerebrali misto nel siero fetale di vitello (FCS)-contenente DMEM, seguita da agitazione passaggi che arricchiscono per gli astrociti (come tutte le altre cellule di cervello tipi staccano dal piatto) e ulteriormente cultura sullo stesso supporto. DMEM completate con FCS è utilizzato per molti altri tipi di cellule, che vanno dai fibroblasti e adipociti a linee cellulari tumorali differenti, tutti condividono la morfologia poligonale esibita da astrociti MD nella cultura. Fino al primi anni 20007, piccolo pensiero era stato rilasciato ai media su misura per gli astrociti, in particolare per favorire la loro tipica morfologia stellare trovato in vivo. Un protocollo pubblicato nel 2011 raggiungere tale morfologia stellare: chiamato il metodo immunopanning, impiega medium senza siero, ottimizzato per la coltura di astrociti3. Utilizzando questo metodo, le cellule cerebrali di recente isolate sono esposti a una serie di piatti rivestiti con anticorpi destinati a proteine di superficie delle cellule di tipo-specific cella, per arricchire per gli astrociti. Nonostante il più in vivo-come profilo di morfologia ed espressione dei astrocytes immunopanned, la maggior parte degli studi in vitro si basa ancora sul metodo Astrocita MD. Il metodo di MD è semplice e veloce, mentre il metodo di immunopanning comprende più lunghe e complesse fasi il primo giorno della cultura (ad esempio lunghi periodi di digestione degli enzimi, attenta stratificazione delle soluzioni di diversa densità, immunopanning stesso, e diversi centrifugazione passi - tutto prima di placcatura). Tuttavia, utilizzando il mezzo più specializzato, il metodo AWESAM offre sia la velocità del metodo MD e lo in vivo-come la morfologia del protocollo immunopanning.

Nel complesso, il protocollo AWESAM è utile per studiare più in vivo-come astrociti in 2D monocolture isolate da neuroni e glia altri (come precedentemente caratterizzati4 immunostainings, immunoblots e sequenziamento di RNA). Esso consente lo studio dei processi astrocitari sottili e fornisce grande accessibilità per la visualizzazione di Ca2 + segnalazione spontanea ed eventi vicino la membrana (ad es., ripreso da microscopia TIRF).

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti qui sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere animale tedesco.

Nota: La linea temporale e i passaggi principali del protocollo sono illustrati nella Figura 1.

1. preparati

  1. Preparare le seguenti soluzioni.
    1. Preparare DMEM + per la coltura di astrociti MD poligonali: DMEM con 10% FCS, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.
    2. Preparare NB + H per la coltura di astrociti stellari: neurobasal medio con 5 ng/mL HBEGF, 1x supplemento B-27, integratore di glutammina x 1, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.
      Nota: Le aliquote di più alte concentrazioni di HBEGF possono essere preparate e conservate a-20 ° C per essere aggiunto al mezzo quando necessario.
    3. Preparare il supporto di dissezione (10 mM HEPES in HBSS).
    4. Preparare aliquote di 6-7 mL di tripsina-EDTA 0,05% e 6-7 mL 0,25% tripsina-EDTA in provette da 15 mL. Questi possono essere conservati a-20 ° C e scongelati a bagnomaria a 37 ° C.
  2. Il giorno prima di iniziare il protocollo, cappotto piatti di coltura del tessuto-trattati di 10 cm con 5 mL di 0,04% polyethylenimine (PEI) ogni.
  3. Il giorno successivo, rimuovere il PEI e lavare i piatti con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere 12 mL di DMEM + ad ogni piatto e pre-equilibrare nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per almeno 30 min prima celle di placcatura.
  4. Preparare l'area di dissezione: In una cappa a flusso laminare dissezione, posizionare due 10cm di Petri riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio. Per ogni area del cervello ad essere isolato (ad es., corteccia, ippocampo), preparare un 15-tubo riempito di 14 mL liquido di dissezione e tenere sul ghiaccio. Spray strumenti di dissezione (forbice, Dumont #3 e #5 pinze) con etanolo al 70% e posto accanto al microscopio di dissezione nella cappa.

2. rat o dissezione del cervello del Mouse

Nota: Entrambi i topi e ratti possono essere utilizzati. Gli animali più vecchi di P8 possono anche essere utilizzati (abbiamo testato fino a P12), ma rimuovendo le meningi diventerà sempre più difficile. Inoltre, il rendimento delle celle e salute diminuirà, poiché le cellule cerebrali da più vecchi animali avranno formato intricati processi e connessioni che possono rompersi durante la dissociazione del tessuto, che conduce alla morte aumentata delle cellule. Corticale preparazioni sono descritte qui, ma possono essere utilizzati anche altre regioni del cervello.

  1. Posto 0.05% tripsina-EDTA in bagnomaria a 37 ° C.
  2. Eutanasia di animali (ratti incinti per E19 cuccioli o animali di P0-P8) alzando lentamente la concentrazione di CO2 e isolare i cervelli. La procedura seguente richiede una tecnica sterile.
  3. Se lavora con tessuto embrionale, innanzitutto rimuovere gli embrioni dall'utero e aprire i sacchi embrionali, quindi immediatamente tagliato le teste con le forbici. Quando tutti i capi sono tagliati fuori, trasferirli nel mezzo di dissezione pre-raffreddata.
    1. Una volta che le teste sono sommersi nel mezzo, aprire il cranio (entrambi sono molto morbidi in animali giovani) e pelle con forcipe e pizzico fuori il cervelletto. Leva con attenzione il resto del cervello fuori dal cranio.
      Nota: Due-quattro E19 embrioni resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.
  4. Per i cuccioli appena nati o più anziani, tagliare le teste con le forbici e isolare i cervelli di medialmente tagliando la pelle in linea retta dalla parte posteriore della testa fino alla punta del naso. Tirare la pelle da parte e accuratamente tagliata il cranio sinistra e destra, poi ascensore le ossa fino. Tagliare il cervelletto, e leva il resto del cervello fuori dal cranio.
    Nota: Due o tre cuccioli di P0-P8 resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.
  5. Separare la corteccia dalla struttura sottostante del midbrain. Collocare la pinza entro la fessura longitudinale tra gli emisferi, quindi spostare la pinza tra le strutture del midbrain corteccia di un emisfero (perpendicolare alla fenditura longitudinale) pizzicare ogni emisfero gratis.
  6. Utilizzando le pinze, rimuovere tutte le meningi da ogni emisfero (e l'ippocampo), quindi separare ippocampi. Se gli astrociti ippocampali sono necessari, è possibile spostare ogni ippocampo in una provetta da 15 mL riempita con 14 mL di terreno di dissezione su ghiaccio.
  7. Rimuovere ulteriori aree dalla corteccia di ciascun emisfero se regioni specifiche sono necessari (ad es., corteccia frontale). Tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per la generazione di astrociti in pezzi non più grande di 1 mm3. Raccogliere tutti i pezzi di tessuto corticale in un tubo separato 15 mL riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio.

3. tessuto digestione e dissociazione

  1. Una volta che tutti i pezzi di tessuto sono raccolti, attendere per loro di stabilirsi sul fondo del tubo, quindi aspirare tanto supporto, per quanto possibile.
  2. Aggiungere 2-3 mL di tripsina EDTA 0,05% utilizzando una pipetta sierologica e incubare le provette in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.
    Nota: Rilasciare tutti tripsina-EDTA dalla pipetta a mescolare i pezzi di tessuto e permettono di depositare ancora rapidamente.
  3. Aspirare accuratamente la tripsina-EDTA, lasciando pezzi di tessuto in come poco liquido possibile, nella parte inferiore del tubo.
  4. Aggiungere 5 mL di mezzo di dissezione pre-raffreddata per lavare via il restante tripsina-EDTA. Pipettare al lato della parte superiore del tubo per ottenere i pezzi di tessuto di miscelazione.
  5. Aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto in come poco liquido possibile. Ripetere questo passaggio di lavaggio con il mezzo di dissezione pre-raffreddata altre due volte.
  6. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1 mL di DMEM + (riscaldato a temperatura ambiente) utilizzando un puntale di 1.000 µ l e triturare il tessuto pipettando su e giù senza introdurre bolle.
    Nota: È importante evitare la produzione di bolle, come questo può cambiare il pH della soluzione, a cui gli astrociti sono molto sensibili.
  7. Collocare un colino di cella di 100 µm nell'apertura di un tubo da 50 mL e pre-bagnato il filtro con 4,5 mL di pre-raffreddata DMEM +.
  8. Pipettare 1 mL di sospensione di tessuto dissociata sul filtro cella e aggiungere un altro 4,5 mL pre-raffreddato DMEM + per lavare le cellule attraverso il filtro delle cellule.

4. cellula placcatura per arricchimento di astrociti di passaggio

  1. Contare le celle, ad esempio, da diluire 10 µ l della sospensione delle cellule con 10 µ l di blu di trypan e pipettaggio il mix su un emocitometro.
  2. Piastra di 500.000 cellule in 12 mL DMEM + per ogni piatto di 10 cm.
    Nota: DMEM + è utile per la crescita astrocytic, tanto più rispetto per i neuroni o microglia. Durante l'agitazione, le forze fisiche che agiscono sulle lamelle di vetro all'interno di pozzi sono molto più forti di quelli che agiscono sui piatti 10 cm (senza lamelle). Se le cellule sono scossi su piastre da 24 pozzetti, diventano insalubri o morire. Solo piastra astrociti su piastre da 24 pozzetti dopo l'agitazione.
  3. Mantenere colture cellulari nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per sette giorni.
  4. Il giorno 6, il giorno prima agitazione e passaggio di cellule, preparare le piastre rivestite con PEI cultura come descritto nel passaggio 5.

5. cellule di passaggio

  1. Il giorno prima di passaggio, cappotto piastre per colture cellulari con 0,04% PEI.
    1. Per immunocitochimica, trasduzione virale o trasfezione di plasmide, utilizzare piastre 24 pozzetti o 6 pozzetti (ciascuno contenente un sterilizzato 12 mm o 25 mm vetrino coprioggetti, rispettivamente).
    2. Sterilizzare le lamelle di vetro tramite incubazione in etanolo al 70% per almeno 1 h, quindi lavare tre volte in acqua deionizzata, distillata prima di mettere i coprioggetti nei pozzetti.
    3. Aggiungere almeno 70 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 12mm in piastre da 24 pozzetti e 600 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 25mm in piastre da 6 pozzetti.
    4. Per Western blot o l'analisi di RNA-Seq, i piatti di 10cm già contenente le celle dopo la dissezione possono continuare ad essere utilizzati. Piatti solo bisogno di essere scosso, quindi le cellule vengono lavate con PBS 1X e trattate con NB + H (non si trasferiscono a nuovi piatti).
  2. Il giorno in vitro (DIV) 7 dopo la dissezione, collocare i piatti di 10 cm con cellule in DMEM + su un agitatore di laboratorio nell'incubatrice e scuotere i piatti a 110 giri/min per 6 h.
  3. Lavare il PEI da lamelle rivestite con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere mezzo NB + H alle piastre (500 µ l per pozzetto per piastre da 24 pozzetti e 2 mL per pozzetto per piastre da 6 pozzetti). Pre-equilibrare le piastre nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 mentre tremano i piatti di 10 cm, o per almeno 30 min.
  4. 20-30 min prima della fine dello scuotimento 6h, pre-riscaldare 1 x PBS, DMEM + NB + H e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C nel bagno d'acqua.
  5. Dopo 6 h di agitazione, togliere i piatti di cultura shaker e sostituire immediatamente il mezzo (che contiene microglia, oligodendrociti e neuroni scosso-off) con 10 mL pre-riscaldati 1X PBS per ogni piatto.
    Nota: È importante aspirare immediatamente il vecchio mezzo contenente cellule indipendente per evitare le cellule non-astrocytic ricollegare.
  6. Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL pre-riscaldato tripsina-EDTA per ogni piatto. Incubare ogni piatto per 4 min in incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Se la preparazione dei campioni per Western blot o RNA-Seq, non aggiungere tripsina-EDTA. Al contrario, sostituire il PBS con 12 mL pre-riscaldati NB + H, dopo di che culture possono essere posizionate indietro nell'incubatrice.
  7. Aggiungere 5 mL pre-riscaldato DMEM + per la tripsina-EDTA 3 mL in ogni piatto, dispensare le cellule fuori il piatto utilizzando una pipetta sierologica di 5ml e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL.
    Nota: Pipetta direttamente dalla parte inferiore del piatto - il piano del piatto dovrebbe diventare più chiaro come staccano le cellule. Solo uso contenenti siero medio (al posto di DMEM +), come siero inattiva la tripsina.
  8. Centrifugare la sospensione cellulare a 3.220 x g a 20 ° C per 4 min.
  9. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL pre-riscaldati NB + H.

6. cella placcatura per finale Astrocyte culture

  1. Contare le celle.
  2. Piastra di 20.000 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (in 2 mL di terreno di NB + H per pozzetto) o 5000 cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti (in media 500 di NB + H di µ l per pozzetto).
  3. Mantenere le colture di cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 fino ad ulteriore trattamento o analisi.
  4. Cambio di mezzo il mezzo una volta a settimana.
    Nota: In ambienti basso-sostanza nutriente, astrociti interrompere proliferano ma qualsiasi restante microglia prolifereranno (sebbene nella nostra esperienza, nessun microglia apparvero nelle culture AWESAM). Lo scambio mezza il mezzo una volta a settimana previene arricchimento di qualsiasi microglia potenzialmente rimanenti8, e le monocolture rimangano sane per almeno tre settimane.

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Representative Results

Gli astrociti che sono co-coltivati con i neuroni e sviluppati in NB + medium appaiono stellari dopo 2 settimane di cultura (Figura 2). Oltre a NB + medio, gli astrociti co-coltivati sono anche esposti a fattori sconosciuti del neurone-derivato che probabilmente contribuiscono alla loro sopravvivenza e la morfologia. Al contrario, gli astrociti MD coltivati in DMEM + come monocolture (dopo aver agitato fuori altri tipi di cella prima del passaggio) appaiono poligonali dopo 2 settimane. Gli astrociti AWESAM coltivati in NB + H dopo l'agitazione, appaiono stellari con molti processi bene dopo 2 settimane di cultura.

Precedentemente abbiamo mostrato che il profilo di espressione di RNA dei astrocytes AWESAM è più vicino a quella di astrociti in vivo rispetto ai astrocytes MD e immunopanned4. In termini di espressione della proteina Astrocita-specifici, astrociti corticali esprimono alti livelli di ALDH1L1 e bassi livelli di GFAP in vivo12. Questo vale anche per gli astrociti AWESAM e immunostaining di ALDH1L1, come un enzima citoplasmatico, rivela dettagli più precisi rispetto alla proteina del citoscheletro GFAP (Figura 2B).

A parte l'espressione di RNA e proteine, astrociti in vivo mostrano spontanea Ca2 + (cioè, senza stimolazione esterna) di segnalazione, ma poligonale MD astrociti in vitro spesso richiedono la stimolazione a suscitare Ca2 + segnalazione, per esempio, con l'aggiunta di ATP o glutammato. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione in vivo, in corpi cellulari e processi impercettibili, che possono essere visualizzati da viralmente transducing cellule con il targeting per membrana Lck-GCaMP3 (Figura 3). Spontanee ondate di Ca2 + in tutto gli astrociti adiacenti anche verificano (Figura 3A). Astrocitari Ca2 + (Figura 3B) di segnalazione in microdomini e processi impercettibili possono essere analizzati usando freeware specifico di astrociti13.

Figure 1
Figura 1 : Protocollo timeline. Una linea temporale che mostra i passaggi principali del protocollo AWESAM, compreso il tempo necessario per eseguire queste operazioni su DIV0 (giorno della dissezione), DIV7 (giorno del passaggio) e cosa aspettarsi in momenti successivi. Casella verde illustra quando cellule possono essere raccolto come astrociti stellari, dove più leggero rispetto a tonalità più scure rappresentano meno contro più complessa morfologia stellare e maturità, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Medium determina morfologia. Schema (A) mostrando come morfologia Astrocita cambia quando co-coltivate con neuroni (come descritto in precedenza4) vs coltivata come monocolture e, a seconda del mezzo. Astrocita-specifica colorazione con contorni GFAP la morfologia stellare in co-colture e astrociti AWESAM e la morfologia poligonale negli astrociti MD. (B), GFAP etichette astrociti MD più fortemente di ALDH1L1 e ALDH1L1 (ma non GFAP) delinea i processi impercettibili degli astrociti AWESAM. Né monocoltura Astrocita esibisce il marcatore neuronale MAP2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Spontanea Ca2 + segnalazione negli astrociti. (A) AWESAM GCaMP-trasdotte astrociti espositivo spontanea Ca2 + eventi tutto reti di astrociti, compresi nei processi sottili (frecce). Un'onda di Ca2 + viaggia attraverso diversi astrociti da sinistra a destra in immagini da punti di tempo distinti, dove colore chiaro raffigura aree di alte concentrazioni di Ca2 + , e le aree nere rappresentano regioni extracellulari. Immagini sono state acquisite usando la microscopia confocal di cellule vive. (B) il Ca2 + concentrazioni cambiano nelle regioni color-coded in (A) nel corso del tempo, indicato come tracce di intensità di fluorescenza GCaMP che illustrano come Ca2 + segnalazione onda si diffonde attraverso diversi astrociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Quattro passi all'interno del protocollo sono fondamentali: 1) preparare la concentrazione di HBEGF e precisamente 5 ng/mL, poiché piccoli aumenti nella concentrazione possono condurre a culture immature, ad esempio, 10 ng/mL HBEGF de-differenziare astrociti4; 2) evita bolle nelle soluzioni che contengono il tessuto o le cellule, che possono cambiare il pH e ostacolare la salute di astrociti; 3) pre-riequilibranti media per raggiungere il pH ottimale e la temperatura per la crescita sani astrociti; 4) scambio solo metà il mezzo una volta a settimana perché qualsiasi restante microglia sono meno propensi a proliferare quando nutrienti sufficienti sono presenti e il mezzo è regolarmente scambiate8 (anche se nessun microglia sono stati trovati nelle culture AWESAM finora). Per quest'ultimo punto, è importante notare che fattori Astrocita-derivati nell'ambito della cultura non dovrebbero essere rimosso completamente, come essi potrebbero supportare proliferazione, differenziazione e sopravvivenza astrocytic.

È importante utilizzare DIV14 o più vecchie colture come la fonte di astrociti maturo (ma per la procedura di trasduzione o trasfezione, culture precedenti possono essere utilizzate) perché gli astrociti più giovani di DIV14 hanno ancora potenziale delle cellule staminali neurali9. Per trasduzione virale, colture di neuroni e astrociti trasformati su DIV7 miste (utilizzando virus adeno-associati) in modo efficiente express viralmente trasdotte GFP10. Per la transfezione di plasmide, vengono spesso utilizzati gli astrociti DIV10-DIV24 e proteine etichettate fluoroforo imaged 2-5 giorni più tardi11. Nella nostra esperienza, sia trasduzione virale e la transfezione di plasmide funzionano meglio se gli astrociti vengono trasdotti tra DIV9 e DIV14. L'efficienza di trasfezione e trasduzione dipendono il costrutto e il metodo, ma troviamo che l'efficienza di trasfezione è ~ 20% nelle monocolture Astrocita usando lipofectamine transfezione ed efficienza di trasduzione virus adeno-associato (AAV) è ~ 90% ( Vedi il nostro precedente lavoro4 per ulteriori dettagli, ad esempio, costrutto utilizzato). Quando transducing astrociti con particelle AAV e trasfezione di lipofectamine, possiamo almeno 5 e 2 giorni, rispettivamente, per l'espressione del costrutto. Prima di trasduzione o trasfezione, gli astrociti dovrebbero anche poter recuperare per almeno un giorno dopo il passaggio.

Inoltre, quando punti di preparazione culture per il confronto di espressione di RNA/proteine in tempi diversi, culture possono essere placcate a quote differenziate per raggiungere simili quantità di materiale, ad es., monocolture Astrocita devono essere raccolte presso DIV7 e DIV21 possono essere placcato a densità di 1 x 106 e 500.000 cellule per ogni piatto di 10 cm, rispettivamente. Ad esempio, il rendimento di lisato di intera proteina sarà intorno a 0,5 mg/mL su DIV14 al momento della raccolta dopo il placcaggio inizialmente 500.000 astrociti AWESAM su un piatto di 10 cm.

Il protocollo AWESAM rappresenta un modo veloce, semplice e poco costoso per gli astrociti di cultura in isolamento da neuroni ma con in vivo-come le caratteristiche di RNA e l'espressione della proteina, morfologia e Ca2 + segnalazione4, che finora è fornito da nessun altro protocollo. Gli astrociti AWESAM possono essere utilizzati per le analisi che sono tipiche per gli studi della coltura delle cellule, compreso immunocytochemistry, immunoblotting, analisi di espressione di RNA, microscopia TIRF e Ca2 + imaging4. In particolare, i recenti progressi in codificato geneticamente indicatori di Ca2 + consentono per la visualizzazione di processi astrocitari bene in maggiore dettaglio rispetto classica Ca2 + coloranti14. Segnalazione di CA2 + , assorbimento vescicolare ed esocitosi in processi astrocitari sottili e spessi è fisiologicamente rilevante, in quanto questi processi possono influenzare la funzione del cervello in termini di supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità, e comunicazione intercellulare. Il protocollo di AWESAM consente per lo studio dei processi astrocitari bene pertinenti per cervello fisiologia15 e malattia16,17, senza interferenze neuronali e con la grande accessibilità che in vitro forniture di cultura.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Riconosciamo che finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (7 ° PQ/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e il Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300054 warm in 37 ºC waterbath before use
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056 warm in 37 ºC waterbath before use
B-27 supplement Gibco 17504-044 50X stock
Glutamax Gibco 35050-061 100X stock
Penicillin / streptomycin Gibco 15070-063 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 without L-glutamine
DMEM Gibco 41966029
HBEGF Sigma 4643
HEPES Gibco 15630080
HBSS Gibco 14170112
FCS Gibco 10437028
PBS Gibco 10010049 1X
100 μm nylon cell strainer BD 352360
Trypan Blue Sigma T8154 
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Hera Cell 240i cell culture incubator
Laboratory shaker Heidolph Rotamax 120  use inside cell culture incubator
Centrifuge Eppendorf 5810 R 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Coltura <em>In Vivo</em>-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso
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Wolfes, A. C., Dean, C. CulturingMore

Wolfes, A. C., Dean, C. Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol. J. Vis. Exp. (131), e56092, doi:10.3791/56092 (2018).

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