Summary
Lille ubiquitin-relaterede modifier (SUMO) familie proteiner er konjugeret med lysin rester af target proteiner til at regulere forskellige cellulære processer. Dette papir beskriver en protokol til påvisning af Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation på endogene og eksogene betingelser i humane celler.
Abstract
De posttranslationelle modifikationer af proteiner er afgørende for en ordentlig regulering af intracellulære signaltransduktion. Blandt disse ændringer er små ubiquitin-relaterede modifier (SUMO) en ubiquitin-lignende protein, som er kovalent tilknyttet lysin rester af en række mål proteiner til at regulere cellulære processer, som genet transskription, DNA reparation, protein interaktion og nedbrydning, subcellulært transport og signaltransduktion. Den mest almindelige metode til påvisning af protein SUMOylation er baseret på den proteinekspression og -oprensning af rekombinante tagged proteiner i bakterier, giver mulighed for en in vitro- biokemisk reaktion som er enkel og egnet til adressering mekanistiske spørgsmål. Men på grund af kompleksiteten af processen med SUMOylation i vivo, det er mere udfordrende at registrere og analysere protein SUMOylation i celler, især når under endogene betingelser. En nylig undersøgelse af forfatterne af dette dokument fremgik at endogene Retinoblastom (Rb) protein, en tumor suppressor, der er afgørende for den negative regulering af cellecyklus progression, specielt SUMOylated på den tidlige G1-fase. Dette papir beskriver en protokol til registrering og analyse af Rb SUMOylation på både endogene og eksogene betingelser i humane celler. Denne protokol er passende for de phenotypical og funktionelle undersøgelse af SUMO-ændring af Rb, samt mange andre SUMO-målrettet proteiner, i humane celler.
Introduction
Præcis kontrol af cellecyklus progression i eukaryote celler er baseret på en stram regulerende netværk, som sikrer, at særlige begivenheder finder sted i en ordnet måde1,2. En af de centrale aktører i dette netværk er Retinoblastom (Rb) protein, det første klonede tumor suppressor1,3. Rb protein menes at være en negativ regulator af cellecyklus progression, især for G0/G1 S fase overgang, og tumor vækst4,5. Svigt af Rb funktion enten direkte fører til den mest almindelige intraokulært malignitet i børn, Retinoblastom, eller bidrager til udviklingen af mange andre typer af kræft5. Derudover er Rb involveret i mange cellulære veje herunder Celledifferentiering, kromatin remodellering og mitokondrier-medieret apoptose3,6,7.
Posttranslationelle ændringer spiller en central rolle i reguleringen af RB funktion8,9. Fosforylering er en sådan ændring, og det fører som regel til Rb inaktivering. I inaktiv G0 celler er Rb aktive med en lav fosforylering niveau. Som celler fremskridt gennem G0/G1 fase, er Rb sekventielt hyper-fosforyleret af en række cyclin-afhængig protein kinaser (CDKs) og cyclins, såsom cyclin E/CDK2 og cyclin D/CDK4/6, som inaktiverer Rb og fjerne dens evne til at undertrykke celle-cyklus relaterede gen expression4,10. RB kan også ændres ved små ubiquitin-relaterede modifier (SUMO)11,12,13.
SUMO er en ubiquitin-lignende protein, som er kovalent tilknyttet en række mål proteiner. Det er afgørende for forskellige cellulære processer, herunder celle cyklus regulering, transskription, protein cellulære lokalisering og nedbrydning, transport og DNA reparation14,15,16, 17 , 18. den SUMO konjugation pathway består af dimerisk SUMO E1 aktiverende enzymet SAE1/UBA2, enkelt E2 conjugating enzymet Ubc9, flere E3 ligases og SUMO-specifikke proteaser. Generelt, spirende SUMO proteiner skal behandles proteolytically for at generere den modne form. Den modne SUMO er aktiveret af E1 heterodimer og derefter overført til E2 enzym Ubc9. Endelig, den C-terminale glycin af SUMO er kovalent konjugeret til target lysin af et substrat, og denne proces er normalt lettet ved E3 ligases. SUMO protein kan fjernes fra den modificerede substrat af specifikke proteaser. En tidligere undersøgelse af forfatterne af dette papir afslørede, at SUMOylation af Rb øger sin binding til CDK2, fører til hyper-fosforylering på den tidlige G1-fase, en proces, der er nødvendige for celle cyklus progression13. Vi viste også, at tabet af Rb SUMOylation forårsager en nedsat celledelingen. Derudover blev det for nylig påvist, at SUMOylation Rb beskytter Rb protein fra proteasomal omsætning, hvilket øger niveauet af Rb protein i cellerne19. Derfor spiller SUMOylation en vigtig rolle i Rb funktion i forskellige cellulære processer. Til yderligere undersøgelse af funktionelle konsekvens og fysiologiske relevansen af Rb SUMOylation, det er vigtigt at udvikle en effektiv metode til at analysere SUMO status af Rb i humane celler eller væv, patient.
SUMOylation er en reversibel, yderst dynamisk proces. Det er således normalt svært at opdage de SUMO-modificerede proteiner helt endogene betingelser. Dette paper præsenterer en metode til påvisning af endogene Rb SUMOylation. Det viser endvidere, hvordan man kan opdage eksogene Rb SUMOylation af både vildtype Rb og dens SUMO-mangelfuld mutation11. Især beskrives Jacobs et al. en metode til at øge SUMO modifikation af et givet substrat specifikt af Ubc9 fusion-rettet SUMOylation (USB-Flashdrev)20. Baseret på denne metode, beskriver denne protokol hvordan man kan analysere den tvungne SUMOylation Rb og dets funktionelle konsekvenser. Hundredvis af SUMO substrater er blevet beskrevet tidligere og flere formodede SUMO substrater er blevet identificeret fra mange proteom-baserede assays, kan denne protokol anvendes til at analysere SUMO-ændring af disse proteiner i humane celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. påvisning af endogene Rb SUMOylation på den tidlige G1-fase
- celle kultur og cellecyklus synkronisering.
- Vedligehold HEK293 celler i vækstmediet indeholdende Dulbecco ' s ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 1% Pen-Strep og 10% føtal bovint serum (FBS) ved 37 ° C og 5% CO 2 i en inkubator.
- Synkroniserer HEK293 cellerne i G0 fase.
- Grev HEK293 celler ved hjælp af en hemocytometer og frø ~1.5 x 10 7 celler i en 15 cm parabol med 25 ml vækstmediet i 24 timer før behandling. Efter at have nået et sammenløb af 70% - 80%, aspirat, medium og vaske cellerne to gange med 5 mL forvarmet fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Tilsættes 25 mL DMEM indeholdende 1% Penicillin-Streptomycin og inkuberes celler ved 37 ° C for 72 h. vaske cellerne off plade ved hjælp af 3 mL iskold PBS. Overføre cellerne ind i en ny 5 mL tube.
- Er underlagt en lille del af celler cellecyklus analyse ved flowcytometri (trin 1.2), indsamle de resterende hovedparten af cellerne ved centrifugering ved 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur, og derefter gemme dem i en ultra-lavere temperatur fryseren indtil analyse af Rb SUMOylation.
- For at opnå G1-fase celler, i slutningen af synkroniseringsprocessen G0 fjerne DMEM og tilføje tilbage frisk vækstmedium, således at HEK293 cellerne til at genindtaste celle cyklus. Derefter indsamle cellerne på forskellige G1 faser (tidlig G1: 30 min. G1: 2 h) til cellecyklus analyse og yderligere SUMO assay.
- Synkroniserer HEK293 cellerne ved S fase ved hjælp af metoden dobbelt-thymidine blok.
- Vokse HEK293 celler til et confluency på 50% og vask celler med forvarmet PBS. Derefter tilføje vækstmediet suppleret med 2,5 mM thymidine til 18 h (første blok).
- Fjerne den thymidine-holdige medium, og derefter cellerne vaskes to gange med forvarmet PBS. Tilføj frisk vækstmedium for 14 h at frigive cellerne.
- Kassere medium med en pipette og tilføje vækstmediet suppleret med 2,5 mM thymidine for en anden 18 h (anden blok) før udførelse af en analyse af cellecyklus og Rb SUMOylation.
- For the G2/M synkronisering, plade ~1.5 × 10 7 HEK293 celler til et 15 cm parabol med 25 mL vækstmediet i 24 timer. Derefter tilsættes nocodazole til medium, indtil en endelig koncentration på 400 ng/mL er opnået. Endelig Inkuber celler til 16 h før udførelse af analyse af cellecyklus og Rb SUMOylation.
- Celle cyklus analyse ved flowcytometri.
- Det synkroniserede HEK293 genopslæmmes i PBS, og derefter løse cellesuspension med iskold 70% ethanol i 2 timer på 4 ° C. Bemærk, at minimere celle klyngedannelse, tilføje cellesuspension dråbevis til den iskolde 100% ethanol til en endelig koncentration af 70% ethanol mens blidt vortexing.
- Centrifugeres celler i 5 min på 500 x g, så omhyggeligt supernatanten og cellerne vaskes to gange med PBS. Gentag trinnet centrifuge.
- Tilføje 500 µL PBS indeholdende 50 µg/mL nukleinsyre pletten propidium Iodid, 0,1% Triton X-100 og 1 µg/mL RNase A til cellerne og bland godt. Inkuber celler for 15 min. ved 37 ° C.
- Gemme prøver ved 4 ° C indtil analyse ved flowcytometri.
- Immunoprecipitation af endogene protein, Rb.
- Forbered HEK293 cellelysater.
- Lyse de synkroniserede HEK293 celler ved forsigtigt at suspendere dem i 1 mL iskold radio-immunoprecipitation analyse (RIPA) lysisbuffer (tabel 1) indeholdende frisk tilføjet 20 mM N-Ethylmaleimide, en isopeptidase-hæmmer, der kunne blokere SUMO proteaser og stabilisere SUMO konjugater.
- Yderligere homogeniseres celler på isen af Dounce homogenisering, ultralydbehandling eller blot passerer gennem 10 gange gennem en 21 G kanyle fastgjort på en 2 mL sprøjte. Altså Ruger celler på is i 5 min.
Bemærk: Den anioniske detergent sodium dodecyl sulfat (SDS) i RIPA buffer er afgørende for senere bestemmelse af Rb-SUMO, da det kunne fjerne det uspecifikke SUMO signal, der er afledt fra non-kovalente samspillet mellem Rb protein og andre ikke-Rb SUMO-arter.
- Centrifugeres cellelysater ved 18.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. overføre analysere til nye 1.5 mL micro-centrifugeglas.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Proteiner kan opbevares ved-80 ° C i mindst 6 måneder. - For at forberede de senere vestlige skamplet input kontrol af hver prøve, gemme en lille del af den ovenfor beskrevne supernatanten til en ny tube og opbevares ved-80 ° C.
- Til de ovennævnte supernatanter, Tilføj 1 µg af uspecifik mus immunoglobulin G (IgG) af de samme arter og isotype som det monoklonale antistof Rb og 20 µL af 50% protein A/G-sepharose gylle. Derefter inkuberes i 1 time ved 4 ° C med blide rotation.
- Centrifugeres prøver på 3.000 x g i 3 min. ved 4 ° C. omhyggeligt indsamle analysere uden at forstyrre perlerne, og overføre dem til nye 1.5 mL micro-centrifugeglas. Til hver af prøverne, tilsæt 5 µL Rb primære antistof og 40 µL af 50% protein A/G-sepharose gylle. Derefter inkuberes natten over ved 4 ° C med blide rotation.
- Saml perlerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 3 min. ved 4 ° C, og fjern forsigtigt supernatanten af pipettering. Bemærk, at for at undgå perle tab, ikke Aspirér perler tør.
- Vaske perlerne fire gange med 1 mL af RIPA buffer. Hver gang, blande rør godt ved rotation dem ved 4 ° C i 15 min. Saml perlerne ved lav hastighed centrifugering ved 3.000 x g i 3 min. ved 4 ° C og derefter skille sig af med supernatanter.
- Efter at fjerne supernatanter fra den sidste vask, genopslæmmes perler i 30 µL 1 x sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) indlæsning buffer (tabel 1) og bland godt.
- Incubate rør ved 100 ° C i en varme blokere for 10 min. derefter centrifugeres prøver på 12.000 x g til 1 min til pellet perlerne. Omhyggeligt indsamle analysere uden at forstyrre perlerne, og overføre dem til 1.5 mL micro-centrifugeglas.
- Analysere prøver af 4% - 20% gradient SDS-PAGE gel og vestlige duppes eller gemme dem på-20 ° C til senere brug.
- Forbered HEK293 cellelysater.
2. Analyse af 6XHis-mærkede eksogene Rb SUMOylation i humane celler
- celle kultur og Transfektion.
- Frø ~ 6 × 10 6 HEK293 celler i en 10 cm parabol og inkuberes i 24 timer i vækstmediet normal celle kultur betingelser at erhverve 75-85% sammenflydende celler. Før Transfektion, fjerne vækstmediet og tilføje 6 mL af forvarmet nedsat serum medium (Se Tabel af materialer) og derefter placere retterne tilbage i inkubatoren.
- For Rb konstitutiv SUMOylation assay, tilføje 15 µg 6XHis-tagged Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT og Ubc9-C93S plasmider i 500 µL nedsat serum medium i 1.5 mL micro-centrifugeglas, henholdsvis.
- Til at analysere SUMO-konjugering wild type Rb og dens SUMOylation-defekt mutant, mix 10 µg af enten 6XHis-tagged Rb-WT eller Rb-K720R plasmid sammen med normal god landbrugspraksis-SUMO1 (10 µg) i 500 µL nedsat serum medium i 1.5 mL micro-centrifuge rør 13.
- i mellemtiden i en separat rør, Bland 50 µL Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) i 500 µL nedsat serum medium, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Fuldt kombinere de to separate rør beskrevet ovenfor, og der inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Tilføj Transfektion reagens/plasmid komplekser til cellerne og fortsat kultur for 8 h på 5% CO 2 og 37 ° C.
- Erstatte nedsat serum medium med vækstmediet, og Inkuber celler under normale dyrkningsbetingelser for 48 h efter Transfektion.
- Nikkel affinitet pull ned af 6XHis-mærkede Rb protein.
- Lyse de transfected HEK293 celler og uddrag de samlede proteiner som beskrevet afsnit 1.3.1.
- Centrifugeres cellelysater ved 18.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. omhyggeligt indsamle analysere og overføre dem til ren rør.
Bemærk: Protein kan indefryses på dette punkt mere end 6 måneder på-80 ° C. - For at forberede de senere vestlige skamplet input kontrol af hver prøve, gemme en lille del af analysere beskrevet ovenfor til en ny tube og opbevares ved-80 ° C.
- Vask 25 µL af 50% nikkel nitrilotrieddikesyre syre (Ni-NTA) Agarosen perler med RIPA bufferen to gange i en 1.5 mL micro-centrifugerør for hver prøve. Saml perlerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 3 min. ved 4 ° C.
- Tilføje 1 M imidazol til hver prøve at opnå en endelig koncentration på 10 mM. Tilføj derefter hver prøve at røret indeholdende rede Ni-NTA Agarosen perlerne.
- Ruger perlerne og lysates i 2 timer ved 4 ° C med blide rotation. Spin perler på 3.000 x g i 3 min. ved 4 ° C, og fjern forsigtigt analysere af pipettering. For at undgå perle tab, ikke Aspirér perler tør.
- Vaske perler med 1 mL af wash buffer indeholdende 20 mM imidazol (tabel 1). Hver gang, blande rør godt ved rotation ved 4 ° C i 15 min. indsamle perler af spinning på 3.000 x g i 3 min. ved 4 ° C, og kassér analysere.
- Efter den sidste vask, tilføje 30 µL af eluering buffer indeholder 250 mM imidazol (tabel 1) til hver prøve og svip til at blande. Derefter inkuberes i 20 min. ved 4 ° C til elueres proteinerne.
- Mix hver prøve med 6 × SDS-PAGE loading bufferen (tabel 1). Altså Ruger rør ved 100 ° C i en varme blok i 10 min.
- Centrifuge på 12.000 x g til 1 min til pellet perlerne. Omhyggeligt indsamle analysere uden at forstyrre perlerne, og overføre prøverne til 1.5 ml micro-centrifugeglas. Prøverne kan analyseres af vestlige skamplet eller opbevares ved-20 ° C til senere brug.
3. Western Blot
- indlæse immunoprecipitation eller trække ned prøver fra de forrige trin på 4-20% gradient SDS-PAGE geler. Gennemføre elektroforese på 120 V på 90 min til at adskille proteiner.
- Overføre proteiner fra gel til en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran ved electroblotting på 300 mA i 90 min. ved 4 ° C ved hjælp af metoden tank overførsel. Blokere PVDF membran i blok buffer indeholdende 5% nonfat mælk (tabel 1) i 1 time ved stuetemperatur.
- Incubate membran med primær antistof i antistof fortynding buffer der indeholder 3% bovint serumalbumin (BSA) (tabel 1) natten over ved 4 ° C. Primære antistoffer, bruge en arbejdsgruppe koncentration på 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antistoffer) eller en fortynding på 1: 2000 (anti-Rb og anti-Tubulin antistoffer) eller 1:5,000 (anti-normal god landbrugspraksis og anti-hans antistof).
- Vaske membran 3 x til 10 min hver gang bruger 1 x tris-bufferet saltvand med Tween (TBST) buffer (tabel 1). Inkuber membran med arter specifikke peberrod Peroxidase HRP-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet 1:5,000 i blok buffer indeholdende 5% nonfat mælk (tabel 1). Vaske membran 3 x til 10 min hver gang ved hjælp af 1 x TBST buffer.
- Ruger membranen med forbedret kemiluminescens (ECL) arbejder løsning. Dække membran med plastfolie og udsættes for X-ray film afhængigt af styrken af signalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at registrere endogene Rb SUMOylation under cellecyklus progression, synkroniseres denne undersøgelse først HEK293 celler i fem forskellige faser i cellecyklus (G0, tidlig G1, G1, S og G2/M), som beskrevet i afsnittet protokol dette papir. Kvaliteten af synkronisering blev bekræftet ved hjælp af nukleinsyre pletten med propidium Iodid efterfulgt af flow flowcytometri analyse (figur 1). Næste, cellerne blev indsamlet og mængden af denatureringen RIPA buffer. SUMO proteaser inhibitor, N-Ethylmaleimide, blev tilføjet til en endelig koncentration på 20 mM til at bevare de indfødte SUMO signal under forsøgene. Efter immunoprecipitation af den endogene Rb arter under denatureringen betingelser til at blokere de non-kovalente uspecifik interaktion, og de følgende vestlige skamplet ved hjælp af et anti-SUMO1 antistof, tilstedeværelsen af SUMO signal var specifikt opdaget på den tidlig G1 fase (figur 2). Selv om den globale SUMOylation blev forbedret på fasen G2-S-M på tid punkt af Rb SUMOylation, havde det ikke ændret (figur 2, input panel). Dette resultat tyder på at SUMOylation Rb ikke er blot en konsekvens af ændrede globale SUMO konjugation aktivitet. Således, disse resultater viser, at protein immunoprecipitation og Western blot analyse beskrevet i denne hvidbog giver mulighed for påvisning af SUMOylation af den endogene Rb protein.
For at afsløre den tvungne SUMOylation Rb protein, denne undersøgelse genereres konstruere en konstitutiv SUMOylated Rb ved at fusionere Ubc9, den eneste SUMO E2 ligase, at dens C-terminal giver mulighed for effektiv og selektiv SUMOylation af Rb (fig. 3A). Tab af funktion mutation af Ubc9, C93S, er også smeltet til C-terminal på Rb at tjene som en kontrol (fig. 3A). For at styrke specificiteten af SUMO-Rb signal, blev ikke smeltet Ubc9 alene bygget så godt. Alle fire af hans markeret plasmider var transfekteret ind i HEK293 cellerne i 48 timer, før de var mængden i RIPA buffer suppleret med 20 mM N-Ethylmaleimide. Alle proteiner blev derefter underkastes en rage ned analyse, som beskrevet i afsnittet protokol dette papir. De eluted Rb proteiner blev analyseret af vestlige skamplet. Ubc9 instrueret fusion-SUMOylation af Rb blev fundet ved hjælp af et anti-SUMO1 antistof (fig. 3B, SUMO1 panel), der henviser til den Ubc9 defekte mutation, C93S, ikke at producere dette signal. Bemærk at den højeffektive SUMO-modifikation forårsaget af Ubc9-fusion fører til en højere molekylvægt band, der endda kan påvises direkte ved hjælp af Rb-antistof, og det svarer til SUMO signal (figur 3B, Rb panel). Desuden Ubc9 alene ikke forårsage nogen SUMO konjugering, yderligere bekræfter Rb-specifikke SUMOylation (fig. 3B).
Fordi SUMO1 er konjugeret med lysin 720 Rb protein11, for yderligere at analysere Rb SUMOylation, genereres denne undersøgelse en SUMO-mangelfuld mutation ved at erstatte denne lysin rester med en arginin (K720R). For at lette påvisning af SUMO-konjugation af de to proteiner, forbigående udtrykt Rb, blev en normal god landbrugspraksis-SUMO1 konstruktion tilføjet for at forbedre den intracellulære SUMO signal. Hans-tagged vildtype eller mutant Rb var Co transfected ind i HEK293 celler sammen med normal god landbrugspraksis-SUMO1, efterfulgt af rage ned analyse og analyse af Rb-SUMO1 konjugation kapacitet. Som bemærket, afskaffet K720R mutant helt SUMO-ændring af Rb, yderligere styrkelse af den foreslåede metode evne til at detektere Rb SUMOylation (figur 4).
Figur 1 : Validering af cellecyklus synkronisering assay ved flowcytometri. HEK293 celler blev kulturperler og synkroniseres på G0, tidlig G1, G1, S og G2/M faser i cellecyklus som beskrevet i denne protokol. Cellecyklus distributioner blev bestemt af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). De repræsenterede data viser et eksempel på den kvantitative analyse af FACS-analyse (n = 1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Rb er SUMOylated på tidlige G1 fase. HEK293 celler blev synkroniseret på forskellige faser i cellecyklus som beskrevet i denne protokol. Cellerne blev indsamlet og mængden i RIPA buffer suppleret med 20 mM N-Ethylmaleimide. Indgangskontrolmulighederne blev læsset på en 4-20% SDS-PAGE gradient gel, overføres og renset med anti-SUMO1 og anti-Tubulin, som angivet. De resterende cellelysater blev derefter udsat for immunoprecipitation ved hjælp af anti-Rb antistof på en fortynding af 1:200. De resulterende Elueringsvæskerne var adskilt af 4% - 20% SDS-PAGE gradient gel og immunoblotted ved hjælp af anti-SUMO1 antistof, og anti-Rb antistof. Dette eksperiment blev gentaget to gange med samme resultat. Dette tal er blevet ændret med tilladelse13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Detection SUMO-ændring af Rb-Ubc9 fusion protein. (A) Diagram over Ubc9 fusion-rettet SUMOylation (USB-Flashdrev) konstruktioner af Rb. (B) konstitutiv SUMOylation af Rb forårsaget af USB-Flashdrev. HEK293 celler forbigående transfekteret med hans-mærkede USB-Flashdrev konstruktioner var mængden i RIPA buffer med 20 mM N-Ethylmaleimide. Den samlede lysate af hver prøve blev inkuberet med Ni-NTA Agarosen perler til at trække ned hans markeret Rb-Ubc9 fusion proteiner eller Ubc9 (brugt som den negative kontrol), henholdsvis. De rensede proteiner var adskilt af 4% - 20% SDS-PAGE gradient gel og immunoblotted med anti-SUMO1 og anti-hans antistoffer. Hans-Rb: 6XHis tagged Rb-Ubc9 fusion proteiner; Hans-Ubc9: 6XHis tagged Ubc9 kun. RB-Ubc9: umodificeret Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hyper-fosforyleret Rb-Ubc9. Resultaterne vist i figuren er repræsentant for tre uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret med tilladelse13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . SUMO-mangelfuld K720R mutation reducerer SUMOylation Rb. HEK293 celler var forbigående Co transfected med de vilde type eller mutant Rb-hans konstruktioner sammen med normal god landbrugspraksis-SUMO1. Cellerne blev indsamlet og mængden i RIPA buffer suppleret med 20 mM N-Ethylmaleimide. En lille del af lysates var direkte analyseret af Western blot som kontrolelementet input. Resten af lysates var inkuberes med Ni-NTA Agarosen perler til at trække ned hans markeret Rb proteiner som beskrevet i denne protokol, og de var immunoblotted med anti-SUMO1 og anti-hans antistoffer. Bemærk at lysin til argininog mutation på 720 af Rb totallieret afskaffer SUMO modifikation af dette protein. Eksperimentet blev udført en gang med et lignende resultat som tidligere rapporteret11. Dette tal er blevet ændret med tilladelse13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Komponenter | Kommentarer |
| RIPA lysisbuffer | 50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1% natrium deoxycholate; 0,1% SDS | Tilføje protease hæmmer cocktail og N-ethylmaleimide umiddelbart før brug. |
| Vaskebuffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM imidazol | Bruges til Pull ned assay kun |
| Eluering Buffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM imidazol | Bruges til Pull ned assay kun |
| 6 x Loading bufferen | 0,5 M Tris, pH = 6,8; 30% glycerol; 10% SDS; 5% β-mercaptoethanol; 0,1% bromphenol blå | Opbevares ved-20 ° C |
| 10 x løb Buffer | 0,25 M Tris, pH 8,6; 1.9 M Glycin; 1% SDS | At gøre 1 x kører Buffer: blandes 100 ml 10 x løb Buffer med 900 mL ddH2O |
| 10 x overførsel Buffer | 0,25 M Tris, pH 8.3, 1.9 M Glycin | At gøre 1 x overførsel Buffer: blandes 100 mL 10 x overføre Buffer med 200 ml Methanol og 700 mL ddH2O |
| 10 x TBS Buffer | I 1 L i ddH2O: 24.08 g Tris pH 7,4; 80 g NaCl | At gøre 1 x TBST Buffer: blandes 100 mL 10 x TBS Buffer med 900 mL ddH2O og 1 mL af Tween-20 |
| Blokerende Buffer | 1 x TBST med 5% nonfat tørt mælk | Forberede buffer umiddelbart før brug |
| Antistof fortynding Buffer | 1 x TBST med 3% BSA og 0,02% natriumazid | Denne Buffer kan opbevares ved 4 ° C i mindst 6 måned |
Tabel 1: Løsninger og buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en protokol for at registrere og analysere den endogene SUMOylation Rb i humane celler. Denne metode er specifikt fokuserede på den endogene Rb protein uden nogen vekslen af globale SUMO-relaterede signal, er det et vigtigt redskab for at undersøge Rb-SUMO ændring under helt naturlige fysiologiske omstændigheder.
For at nå dette mål, er det vigtigt at huske at: 1) selv om SUMO omfatter fire isoformer (SUMO1-4, hver kodet af forskellige gener) i forhold til ubiquitination, alle SUMO arter er langt mindre rigelige; 2) for de fleste SUMO target proteiner er kun en lille del af et bestemt protein SUMOylated i steady state, som er resultatet af den konstante konkurrence mellem de enzymer, der er involveret i SUMO konjugering og deconjugation14,21; og 3) SUMO mål kan gennemgå hurtige cykler af SUMOylation og deSUMOylation. For eksempel, demonstrere de seneste data opnået ved forfatterne til denne nuværende papir, Rb-SUMO1 findes kun for et meget kort vindue af tid i den tidlige G1-fase, som er i overensstemmelse med den opfattelse, at SUMOylation er en reversibel, yderst dynamisk proces13 . Alle disse fakta gør det udfordrende at direkte registrere den endogene SUMOylation af et bestemt protein. Således, at kunne påvise dette, det er vigtigt at identificere de nøjagtige betingelser, hvorunder denne ændring forekommer. For eksempel, i denne foreslåede protokol er timingen af cellecyklus synkronisering afgørende for påvisning af Rb SUMOylation. En optimeret forsøgsmetoden er også vigtig for vellykket påvisning af low-level SUMO-modificerede arter af et bestemt protein. For eksempel, ordentlig sonikering eller passerer gennem nåle kunne forhindre dannelsen af klæbrig og tyktflydende komponenter på grund af genomisk DNA, dermed ordentlig ultralydbehandling kan lette total protein udvinding. Derudover kunne en god monoklonalt antistof med høj affinitet til target proteinet være nyttige for at forbedre mængden og specificitet af immunoprecipitation. I sammendrag er den foreslåede metode vigtigt for yderligere udforskning af de fysiologiske forhold hvorunder endogene Rb er SUMOylated, som er udgangspunktet for den følgende overekspression-baserede funktionelle analyse.
For at forstærke SUMO signal af et bestemt protein, er det almindeligt at co-overexpress dette protein samt andre SUMO-relaterede proteiner (normalt Ubc9 og SUMO protein) i celler. Selv om en simpel vestlige skamplet ved hjælp af en antistof mod underlaget er den nemmeste måde at finde højere molekylvægt, SUMOylated form for dette protein, lykkedes os at registrere SUMO-Rb-signal med denne metode. Således, dette papir kun fokuseret på en metode til at registrere SUMO-ændring af det udfældede eksogene Rb protein. Desuden, denne metode beskrevet hvordan man kunstigt øge eller fjerne SUMO-konjugation af Rb. Som den eneste E2 ligase, har Ubc9 fundet direkte overføre SUMO til specifikke mål22. Således, ved at fusionere til C-terminal på Rb, Ubc9 betydeligt fremmer SUMO-ændring af Rb. ved hjælp af denne metode, forfatterne af denne papir med succes demonstreret at SUMOylation af Rb tilstrækkeligt fremmes dets egen fosforylering ved at øge sin binding CDK213. Desuden, for at studere de funktionelle konsekvenser af tabet af Rb SUMOylation, forfatterne genereret en SUMO-mangelfuld Rb konstruktion, som tidligere rapporteret11. Ved hjælp af den metode, der foreslås i denne nuværende papir, var det vist, at SUMO-Rb er nødvendige for normale cellecyklus progression og celle spredning13.
Ud over SUMO1 spille SUMO2 og SUMO3 også en vigtig rolle i protein SUMOylation14,17. SUMO2 og SUMO3 er ofte omtales som SUMO2/3 fordi de hænger tæt sammen og deler 97% identitet. SUMO1 deler en 50% lighed med SUMO2/3. Det er almindeligt accepteret, at SUMO1 er ansvarlig for normal celle fysiologiske funktioner og vedligeholdelse, mens SUMO-2/3 er overvejende involveret i celle stress svar15,17,23, 24. eftersom at Rb kunne også være SUMOylated af SUMO2/3 med ukendt funktion12, den metode, der foreslås i denne undersøgelse er stadig egnet til detektion og analyse af denne ændring af Rb. Ud over Rb, kan de metoder, der beskrives her anvendes bredt til påvisning og funktionel analyse af SUMOylation af en række mål proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra videnskab og teknologi Kommissionen i Shanghai (Grant nr. 14411961800) og National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
