Summary
Små ubiquitin-relaterte modifikator (SUMO) familie proteiner er konjugert til lysin rester av målet proteiner til å regulere ulike cellulære prosesser. Dette dokumentet beskriver en protokoll for påvisning av retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogene og ytre forhold i menneskeceller.
Abstract
Post-translasjonell modifikasjoner av proteiner er avgjørende for riktig regulering av intracellulær signaltransduksjon. Blant endringene er små ubiquitin-relaterte modifikator (SUMO) en ubiquitin-lignende protein som tilhører covalently lysin rester av en rekke mål proteiner å regulere cellular prosesser, som gene transkripsjon, DNA-reparasjon, protein samhandling og fornedrelse, subcellular transport og signaltransduksjon. Den vanligste måten å oppdage protein SUMOylation er basert på uttrykk og rensing av rekombinant merket proteiner i bakterier, slik at en i vitro biokjemiske reaksjon som er enkel og egnet for adressering mekanistisk spørsmål. Men komplekse prosessen med SUMOylation i vivoer det mer utfordrende å finne og analysere protein SUMOylation i celler, spesielt når under endogene forhold. En fersk studie av forfatterne av notatet avdekket at endogene retinoblastoma (Rb) protein, en tumor suppressor som er viktig for negative regulering av cellen syklus progresjon, er spesielt SUMOylated på den tidlige G1-fasen. Dette dokumentet beskriver en protokoll for deteksjon og analyse av Rb SUMOylation under både endogene og ytre forhold i menneskeceller. Denne protokollen er egnet for phenotypical og funksjonelle etterforskningen av SUMO-endring av Rb, samt mange andre SUMO målrettede proteiner, menneskelige celler.
Introduction
Nøyaktig kontroll av cellen syklus progresjon i eukaryote celler er basert på et stramt regulatoriske nettverk, som sikrer at spesielle hendelser skje i en organisert måte1,2. En av de viktigste aktørene i dette nettverket er retinoblastoma (Rb) protein, den første klonede tumor suppressor1,3. Rb protein er antatt å være en negativ regulator av cellen syklus progresjon, spesielt for G0/G1 S fase overgang og tumor vekst4,5. Svikt i Rb funksjon enten direkte fører til de vanligste intraokulært kreft hos barn, retinoblastoma, eller bidrar til utvikling av mange andre typer kreft5. Videre er Rb involvert i mange mobilnettet baner inkludert celledifferensiering og chromatin remodeling mitokondrier-mediert apoptose3,6,7.
Post-translasjonell modifikasjoner spille en sentral rolle i regulering av RB funksjon8,9. Fosforylering er en slik endring, og det fører vanligvis til Rb inaktivering. Quiescent G0 celler er Rb aktiv med lav fosforylering nivå. Som celler gjennom G0/G1 fase, er Rb sekvensielt hyper-fosforylert av en rekke cyclin-avhengige protein kinaser (CDKs) og cyclins, som cyclin E/CDK2 og cyclin D/CDK4/6, som deaktivere Rb og eliminere dens evne til å undertrykke celle-syklusen relaterte gene expression4,10. RB kan også endres av små ubiquitin-relaterte modifikator (SUMO)11,12,13.
SUMO er et ubiquitin som protein som covalently er knyttet til en rekke mål proteiner. Det er avgjørende for mangfoldig cellulære prosesser, inkludert celle syklus regulering, transkripsjon, protein mobilnettet lokalisering og fornedrelse, transport og DNA reparasjon14,15,16, 17 , 18. den SUMO Bøyning pathway består av dimeric SUMO E1 aktivering enzymet SAE1/UBA2, enkelt E2 conjugating enzymet Ubc9, flere E3 ligases og SUMO-spesifikke proteaser. Vanligvis må begynnende SUMO proteiner proteolytically behandles for å generere skjemaet modne. Eldre SUMO er aktivert av E1 heterodimer og deretter overført til E2 enzymet Ubc9. Endelig, C-terminalen glysin i SUMO covalently er konjugert til målet lysin av et substrat, og denne prosessen er vanligvis tilrettelagt av E3 ligases. SUMO protein kan fjernes fra modifisert underlaget ved bestemte proteaser. En tidligere studie av forfatterne av notatet avslørte at SUMOylation av Rb øker sin binding til CDK2, fører til hyper-fosforylering i den tidlige fasen G1, en prosess som er nødvendig for cellen syklus progresjon13. Vi viste også at tapet av Rb SUMOylation fører til en redusert celle spredning. Videre ble det nylig demonstrert at SUMOylation av Rb beskytter Rb protein fra proteasomal omsetning, dermed øker nivået av Rb protein i celler19. Derfor spiller SUMOylation en viktig rolle i Rb-funksjonen i ulike cellulære prosesser. For videre studier den funksjonelle konsekvens og fysiologiske relevans av Rb SUMOylation, er det viktig å utvikle en effektiv metode for å analysere SUMO status Rb i menneskelige celler og pasienten vev.
SUMOylation er en reversibel, svært dynamisk prosess. Dermed er det vanligvis vanskelig å oppdage SUMO endret proteiner under helt endogene forhold. Dette dokumentet presenterer en metode for å oppdage endogene Rb-SUMOylation. Videre, det viser hvordan oppdage eksogene Rb SUMOylation vill-type Rb og dens SUMO-mangelfull mutasjon11. Spesielt beskrevet Jacobs et al. en metode for å øke SUMO endring av en gitt substrat spesielt av Ubc9 fusion-rettet SUMOylation (UFDS)20. Denne protokollen basert på denne metoden, og beskriver hvordan å analysere Rb tvungen SUMOylation og funksjonelle konsekvensene. Gitt at hundrevis av SUMO underlag har blitt beskrevet tidligere og mer antatte SUMO underlag identifisert fra mange proteomic-baserte analyser, kan denne protokollen brukes til å analysere SUMO-endring av disse proteiner i humane celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gjenkjenning av endogene Rb SUMOylation på den tidlige G1 fasen
- celle kultur og celle syklus synkronisering.
- Opprettholde HEK293 celler i vekstmediet som inneholder Dulbecco ' s endret Eagle Medium (DMEM) med 1% penn-Strep og 10% fosterets bovin serum (FBS) på 37 ° C og 5% CO 2 i en inkubator.
- Synkronisere HEK293 cellene på G0 fasen.
- Antall HEK293 celler ved hjelp av en hemocytometer og seed ~1.5 x 10 7 celler i en 15 cm rett med 25 ml vekst medium for 24 timer før behandling. Etter å ha nådd en samløpet av 70% - 80%, leveringstanken medium og vask cellene to ganger med 5 mL prewarmed fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Legge til 25 mL DMEM som inneholder 1% Penicillin-Streptomycin og Inkuber cellene på 37 ° C for 72 h. vaske cellene av platen med 3 mL iskald PBS. Overføre cellene til en ny 5 mL tube.
- Underlagt en liten del av cellene til cellen syklus analyse av flowcytometri (trinn 1.2), samle de gjenværende fleste cellene med sentrifugering 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og deretter lagre dem i en ultra-nedre temperaturen fryseren til analyse av Rb SUMOylation.
- For å få G1-fase celler, på slutten av synkroniseringen G0, fjerne DMEM og legge tilbake frisk vekst medium, slik at de HEK293 cellene skriver inn i cellen syklus. Deretter samle cellene ved ulike G1 faser (tidlig G1: 30 min; G1: 2t) for cellen syklus analyse og ytterligere SUMO analysen.
- Synkronisere HEK293 cellene på S fasen med metoden dobbel-thymidine blokk.
- Vokser HEK293 cellene til en confluency på 50% og vask celler med prewarmed PBS. Deretter legger oppblomstringen medium med 2,5 thymidine 18 h (første blokk).
- Fjerner thymidine som inneholder mediet, og deretter vaske cellene to ganger med prewarmed PBS. Legge fersk oppblomstringen medium for 14 h å frigi cellene.
- Forkaste mediet med en pipette og legge til vekstmediet med 2,5 thymidine en annen 18 h (andre blokk) før gjennomfører en analyse av i cellen syklus og Rb SUMOylation.
- For the G2/M synkronisering, plate ~1.5 × 10 7 HEK293 cellene til en 15 cm rett med 25 mL vekst medium for 24 timer. Deretter legge nocodazole til mediet til en siste konsentrasjon av 400 ng/mL er oppnådd. Endelig ruge celler for 16 h før gjennomføre analyser av cellen syklus og Rb SUMOylation.
- Celle syklus analyse av flowcytometri.
- å avbryte den synkroniserte HEK293 PBS og deretter ordne celle suspensjon med iskald 70% etanol for 2t 4 ° C. Merk at minimere celle klynging, legge til celle suspensjon dropwise til det iskalde 100% etanol å få en endelig konsentrasjon av 70% etanol mens forsiktig vortexing.
- Sentrifuge celler for 5 min på 500 x g, og nøye forkaste nedbryting og vaske cellene to ganger med PBS. Gjenta trinnet sentrifuge.
- Legge til 500 µL PBS inneholder 50 µg/mL nukleinsyre flekken propidium iodide, 0,1% Triton X-100 og 1 µg/mL RNase A til cellene og bland godt. Inkuber cellene i 15 min på 37 ° C.
- Lagre prøver på 4 ° C til analyse av flowcytometri.
- Immunoprecipitation av endogene Rb protein.
- Forbered HEK293 celle lysates.
- Lyse synkronisert HEK293 cellene ved forsiktig å henge dem i 1 mL av iskalde radio-immunoprecipitation analysen (RIPA) lyseringsbuffer (tabell 1) som inneholder ferske lagt 20 mM N-Ethylmaleimide, en isopeptidase inhibitor som kunne blokkere SUMO proteaser og stabilisere SUMO conjugates.
- Ytterligere homogenize cellene på isen av Dounce homogenisering, sonication eller bare på gjennomreise 10 ganger gjennom en 21 G nål festet på en 2 mL sprøyte. Deretter ruge cellene på is 5 min.
Merk: Anionic vaskemiddel natrium dodecyl sulfate (SDS) i RIPA bufferen er avgjørende for senere fastsettelse av Rb-SUMO, som det kunne eliminere uspesifikke SUMO signalet som er avledet fra ikke-kovalente samspillet mellom Rb protein og andre ikke-Rb SUMO-arter.
- Sentrifuge celle lysates 18 000 x g i 30 min på 4 ° C. overføre supernatants til nye 1,5 mL mikro-sentrifuge rør.
Merk: Protokollen kan pauses her. Proteinene kan lagres på-80 ° C i minst 6 måneder. - For å forberede input kontroll av hver prøve senere Western blot, lagre en liten del av nedbryting ovenfor beskrevet i en ny tube og butikk på-80 ° C.
- Over supernatants, legge til 1 µg av ikke-spesifikk musen immunglobulin G (IgG) av samme art og isotype Rb monoklonale antistoffer og 20 µL av 50% protein A/G-sepharose slurry. Deretter ruge 1t på 4 ° C med mild rotasjon.
- Sentrifuge prøvene 3000 x g i 3 minutter på 4 ° C. nøye samle supernatants uten å forstyrre perler, og overføre dem til nye 1,5 mL mikro-sentrifuge rør. Hver av prøvene, legge til 5 µL Rb primære antistoff og 40 µL av 50% protein A/G-sepharose slurry. Deretter ruge over natten ved 4 ° C med mild rotasjon.
- Samle perler med sentrifugering 3000 x g i 3 minutter på 4 ° C, og fjern forsiktig nedbryting av pipettering. Merk at for å unngå tap av perle, ikke Sug opp perler tørr.
- Vask perlene fire ganger med 1 mL av RIPA bufferen. Hver gang, bland rør godt av rotasjon på 4 ° C i 15 min. samle perler ved lav hastighet sentrifugering 3000 x g i 3 minutter på 4 ° C og deretter kaste supernatants.
- Etter fjerner supernatants fra siste vask, å suspendere perlene i 30 µL 1 x natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) lasting buffer (tabell 1) og bland godt.
- Incubate rør ved 100 ° C i en varme blokkere for 10 min. sentrifuge prøvene 12.000 x g for 1 min til pellets perler. Nøye samle supernatants uten å forstyrre perler, og overføre dem til 1,5 mL mikro-sentrifuge rør.
- Analyser prøvene av 4% - 20% gradient SDS side gel og Western blot eller lagre dem på 20 ° C for senere bruk.
- Forbered HEK293 celle lysates.
2. Analyse av 6XHis-merket eksogene Rb SUMOylation i menneskeceller
- kultur og transfection.
- Frø ~ 6 × 10 6 HEK293 celler i en 10 cm rett og ruge 24 h i vekst medium under normal celle kultur forhold å erverve 75-85% confluent celler. Før transfection, fjerne vekstmediet og legge 6 mL av prewarmed redusert serum medium (se Tabell for materiale), og deretter plassere retter tilbake i inkubator.
- For Rb konstituerende SUMOylation analysen, legger 15 µg hver 6XHis-merket Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT og Ubc9-C93S plasmider i 500 µL redusert serum medium i 1,5 mL mikro-sentrifuge rør, henholdsvis.
- å analysere SUMO-Bøyning av vill-type Rb og dens SUMOylation-defekt mutant, bland 10 µg av enten 6XHis-merket Rb-WT eller Rb-K720R plasmider sammen med GFP-SUMO1 (10 µg) i 500 µL redusert serum medium i 1,5 mL mikro-sentrifuge rør 13.
- i mellomtiden, i en separat tube, bland 50 µL transfection reagens (se Tabell for materiale) i 500 µL redusert serum medium og ruge ved romtemperatur for 5 min.
- Fullt kombinere to separate rør beskrevet ovenfor, og ruge ved romtemperatur i 15 min. Legg transfection reagens/plasmider komplekser til cellene og fortsette å kultur for 8 h på 5% CO 2 og 37 ° C.
- Erstatte redusert serum medium med vekst medium, og ruge cellene under normal kultur forhold for 48 timer etter transfection.
- Nikkel affinitet trekke ned av 6XHis-merket Rb protein.
- Lyse transfekterte HEK293 cellene og ekstra totale proteiner som beskrevet 1.3.1.
- Sentrifuge celle lysates 18 000 x g i 30 min på 4 ° C. nøye samle supernatants og overføre dem til ren rør.
Merk: Protein kan være frosset på dette punktet i mer enn 6 måneder på-80 ° C. - For å forberede input kontroll av hver prøve senere Western blot, lagre en liten del av supernatants beskrevet ovenfor til en ny tube og butikk på-80 ° C.
- Vask 25 µL av 50% nikkel nitrilotriacetic syre (Ni-NTA) agarose perler med RIPA buffer to ganger i en 1,5 mL mikro-sentrifuge rør for hvert utvalg. Samle perler med sentrifugering 3000 x g i 3 minutter på 4 ° C.
- Legge til 1 M imidazole til hver prøve å få en endelig konsentrasjon av 10 mM. Legg deretter til hvert utvalg til røret som inneholder forberedt Ni-NTA agarose perler.
- Ruge perler og lysates for 2t 4 ° c med mild rotasjon. Spinn perlene 3000 x g i 3 minutter på 4 ° C, og fjern forsiktig i supernatants av pipettering. For å unngå tap av perle, ikke Sug opp perler tørr.
- Vask perler med 1 mL av vaskebuffer inneholder 20 mM imidazole (tabell 1). Hver gang, bland rør godt rotasjon på 4 ° C i 15 min. samle perler av snurrende 3000 x g i 3 minutter på 4 ° C, og forkaste supernatants.
- Etter siste vask, legge 30 µL av elueringsrør buffer inneholder 250 mM imidazole (tabell 1) til hvert utvalg og flick for å blande. Deretter ruge etter 20 min på 4 ° C til elute proteiner.
- Blande hvert utvalg med 6 × SDS siden lasting buffer (tabell 1). Deretter ruge rør ved 100 ° C i en varme blokk for 10 min.
- Sentrifuge 12.000 x g for 1 min til pellets perler. Nøye samle supernatants uten å forstyrre perler, og overføre prøvene til 1,5 ml mikro-sentrifuge rør. Eksemplene kan være analysert ved Western blot eller lagret på 20 ° C for senere bruk.
3. Western Blot
- laste immunoprecipitation eller trekke ned prøver innhentet fra de forrige trinnene på 4-20% gradient SDS side gels. Utføre geleelektroforese på 120 V for 90 min skille proteiner.
- Overføre proteiner fra gel til en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran av electroblotting på 300 mA for 90 minutter til 4 ° C med metoden tank overføring. Blokkere PVDF membranen i blokk buffer inneholder 5% nonfat melk (tabell 1) 1t ved romtemperatur.
- Incubate membran med primære antistoffer Antistoffer fortynning buffer inneholder 3% bovin serum albumin (BSA) (tabell 1) overnatting på 4 ° C. Primære antistoffer, bruke en arbeider konsentrasjon på 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antistoffer) eller en fortynning av 1:2000 (anti-Rb og anti-Tubulin antistoffer) eller 1:5,000 (anti-GFP og anti-hans antistoff).
- Vask membranen 3 x i 10 min hver gang med 1 x tris-bufret saline Tween (TBST) buffer (tabell 1). Inkuber membranen med arter spesifikke pepperrot Peroxidase HRP-konjugerte sekundære antistoffer utvannet 1:5,000 i blokk buffer inneholder 5% nonfat melk (tabell 1). Vask membranen 3 x i 10 min hver gang med 1 x TBST buffer.
- Ruge membranen med forbedret chemiluminescence (ECL) arbeider løsning. Dekke membranen med plast brytes og utsette det X-ray film avhengig av styrken signalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppdage endogene Rb-SUMOylation under cellen syklus progresjon, synkronisert denne studien først HEK293 celler på fem ulike stadier av celle syklus (G0, tidlig G1, G1, S og G2/M) som beskrevet i delen protokollen i dette papiret. Kvaliteten på synkronisering ble bekreftet ved hjelp av nukleinsyre flekken propidium iodide etterfulgt av flyt cytometri analyse (figur 1). Deretter var cellene samlet og lysed av denaturing RIPA buffer. SUMO proteaser inhibitor, N-Ethylmaleimide, ble lagt til en siste konsentrasjon av 20 mM å bevare opprinnelige SUMO signalet under forsøkene. Etter immunoprecipitation av endogene Rb arter under denaturing forhold til å blokkere ikke-kovalente uspesifikke samspillet og følgende western blot bruke et anti-SUMO1 antistoff, fant spesielt tilstedeværelsen av SUMO signalet på den tidlig G1 fase (figur 2). Selv om den globale SUMOylation ble forbedret i S/G2/M-fase på tid punkt av Rb SUMOylation, hadde det ikke endret (figur 2, Inndatapanel). Dette funnet antyder at SUMOylation av Rb ikke er bare konsekvensen av endrede globale SUMO Bøyning aktivitet. Dermed disse resultatene viser at protein immunoprecipitation og Western blot analyse beskrevet i denne hvitboken tillater påvisning av SUMOylation av endogene Rb protein.
For å oppdage den tvunget SUMOylation Rb protein, denne studien generert konstruere en grunnleggende SUMOylated Rb kombinerer Ubc9, den eneste SUMO E2 ligase, til sin C-terminalen gir effektiv og selektive SUMOylation av Rb (Figur 3A). Tap av funksjon mutasjon av Ubc9, C93S, er også smeltet til C-terminalen på Rb å tjene som en kontroll (Figur 3A). For å ytterligere styrke spesifisitet av SUMO-Rb, ble ikke-smeltet Ubc9 alene bygget også. Alle fire av hans-merket plasmider ble transfekterte i HEK293 celler for 48 timer før de ble lysed RIPA buffer med 20 mM N-Ethylmaleimide. Alle proteiner ble deretter utsatt for en trekk ned analysen, som beskrevet i delen protokollen i dette papiret. Eluted Rb proteiner ble analysert ved Western blot. Ubc9 rettet fusion-SUMOylation av Rb ble oppdaget ved hjelp av et anti-SUMO1 antistoff (Figur 3BSUMO1-panelet), mens Ubc9 defekt mutasjonen, C93S, ikke klarte å produsere dette signalet. Merk at svært effektiv SUMO-endring forårsaket av Ubc9-blanding fører til et høyere molekylvekt band som kunne engang registreres direkte ved hjelp av Rb antistoffer, og det tilsvarer SUMO signalet (Figur 3BRb-panelet). Videre forårsake Ubc9 alene ikke noen SUMO Bøyning, videre bekrefter Rb-spesifikke SUMOylation (Figur 3B).
Fordi SUMO1 er konjugert til lysin 720 Rb protein11, for å analysere Rb-SUMOylation generert denne studien en SUMO-mangelfull mutasjon av erstatter denne lysin rester med en arginine (K720R). For å lette oppdagelsen av SUMO-Bøyning av to transiently uttrykt Rb proteiner, ble en GFP-SUMO1-konstruere lagt til forbedre intracellulær SUMO signalet. Hans-merket wild type eller mutant Rb var co transfekterte i HEK293 celler med GFP-SUMO1, etterfulgt av trekke ned analysen og analyse av Rb-SUMO1 Bøyning evne. Som observert, avskaffet K720R mutant helt SUMO-endring av Rb, ytterligere styrke den foreslåtte metoden evne til å oppdage Rb-SUMOylation (Figur 4).
Figur 1 : Validering av cellen syklus synkronisering analysen av flowcytometri. HEK293 celler ble kultivert og synkronisert på G0, tidlig G1, G1, S og G2/M faser av cellen syklus som beskrevet i denne protokollen. Cellen syklus distribusjoner ble fastsatt av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Representert data viser et eksempel på kvantitativ analyse av FACS analysen (n = 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Rb er SUMOylated på G1 tidligfasen. HEK293 celler ble synkronisert i forskjellige faser av cellen syklus som beskrevet i denne protokollen. Cellene var samlet og lysed RIPA buffer med 20 mM N-Ethylmaleimide. Kildekontrollene ble lastet på en 4% - 20% SDS side gradient gel, overført og strøket med anti-SUMO1 og anti-Tubulin, som angitt. De gjenværende celle lysates ble deretter utsatt for immunoprecipitation bruker anti-Rb antistoff på en fortynning av 1:200. De resulterende eluents var atskilt med 4% - 20% SDS side gradient gel og immunoblotted ved hjelp av anti-SUMO1 antistoffer og anti-Rb antistoff. Dette forsøket ble gjentatt to ganger med samme resultat. Dette tallet er endret med tillatelse13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Påvisning av SUMO-endring av Rb-Ubc9 fusion protein. (A) Diagram av Ubc9 fusion-rettet SUMOylation (UFDS) konstruksjoner av Rb. (B) grunnleggende SUMOylation av Rb forårsaket av UFDS. HEK293 celler transiently transfekterte med hans-merket UFDS konstruksjoner var lysed RIPA buffer med 20 mM N-Ethylmaleimide. Totalen lysate av hver prøve ble inkubert med Ni-NTA agarose perler å trekke ned hans-merket Rb-Ubc9 fusion proteiner eller Ubc9 (brukt som kontrollen negative), henholdsvis. Renset proteiner var atskilt med 4% - 20% SDS side gradient gel og immunoblotted med anti-SUMO1 og anti-hans antistoffer. Hans-Rb: 6XHis merket Rb-Ubc9 fusion proteiner; Hans-Ubc9: 6XHis merket Ubc9 bare. RB-Ubc9: uforandret Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hyper-fosforylert Rb-Ubc9. Resultatene vises i figur er representant for tre uavhengige forsøk. Dette tallet er endret med tillatelse13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . SUMO-mangelfull K720R mutasjon reduserer SUMOylation Rb. HEK293 celler var transiently co transfekterte med wild type eller mutant Rb-hans sammensetningene med GFP-SUMO1. Cellene var samlet og lysed RIPA buffer med 20 mM N-Ethylmaleimide. En liten del av lysates var direkte analysert Western blot som input kontroll. Resten av lysates ble inkubert med Ni-NTA agarose perler å trekke ned hans-merket Rb proteiner som beskrevet i denne protokollen, og de var immunoblotted med anti-SUMO1 og anti-hans antistoffer. Merk at lysin-til-arginine mutasjon på 720 av Rb totalliert opphever SUMO endring av dette proteinet. Eksperimentet ble gjennomført en gang med et lignende resultat som tidligere rapportert11. Dette tallet er endret med tillatelse13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsning | Komponenter | Kommentarer |
| RIPA lyseringsbuffer | 50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1% natrium deoxycholate; 0,1% SDS | Legg protease hemmer cocktail og N-ethylmaleimide umiddelbart før bruk. |
| Vaskebuffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM imidazole | Brukes for trekk ned analysen bare |
| Elueringsbufferen | 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM imidazole | Brukes for trekk ned analysen bare |
| 6 x lasting Buffer | 0,5 M Tris, pH = 6.8; 30% glyserol; 10% SDS; 5% β-mercaptoethanol; 0,1% bromphenol blå | Butikken på 20 ° C |
| 10 x kjører Buffer | 0,25 M Tris, pH 8.6; 1,9 M glysin; 1% SDS | Å gjøre 1 x kjører Buffer: Bland 100 ml 10 x kjører Buffer med 900 mL ddH2O |
| 10 x overføring Buffer | 0,25 M Tris, pH 8.3, 1,9 M glysin | Å gjøre 1 x overføring Buffer: Bland 100 mL 10 x overføre Buffer med 200 ml metanol og 700 mL ddH2O |
| 10 x TBS Buffer | I 1 L ddH2O: 24.08 g Tris pH 7.4; 80 g NaCl | Å gjøre 1 x TBST Buffer: Bland 100 mL 10 x TBS Buffer med 900 mL ddH2O og 1 mL av Tween-20 |
| Blokkerer Buffer | 1 x TBST med 5% tørr melk nonfat | Forberede bufferen umiddelbart før bruk |
| Antistoff fortynning Buffer | 1 x TBST med 3% BSA og 0.02% Natriumazid | Denne bufferen kan lagres på 4 ° C i minst 6 månede |
Tabell 1: Løsninger og buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver en protokoll for å finne og analysere endogene SUMOylation av Rb i menneskeceller. Som denne metoden er spesielt fokusert på endogene Rb protein uten noen veksling av globale SUMO-relaterte signal, er det et viktig verktøy for å undersøke Rb-SUMO modifisering under helt naturlig fysiologiske forhold.
For å oppnå dette, er det viktig å huske på at: 1) selv om SUMO omfatter fire isoformene (SUMO1-4, hver kodet av ulike gener) i forhold til ubiquitination, alle SUMO arter er mye mindre rikelig; 2) for de fleste SUMO målet proteiner er bare en liten del av et bestemt protein SUMOylated på steady state, som er resultatet av konstant konkurransen mellom enzymer som er involvert i SUMO bøyning og deconjugation14,21; og 3) SUMO mål kan gjennomgå rask sykluser av SUMOylation og deSUMOylation. For eksempel demonstrere siste data innhentet av forfatterne av notatet gjeldende at Rb-SUMO1 eksisterer bare for en veldig kort vindu av tid i den tidlige fasen G1, som samsvarer med oppfatningen at SUMOylation er en reversibel, svært dynamisk prosess13 . Alle disse fakta gjør det utfordrende å direkte gjenkjenne den endogene SUMOylation av et bestemt protein. Dermed for å oppdage dette, er det viktig å finne den eksakte forholdene som denne endringen oppstår. For eksempel i denne foreslåtte protokollen er tidspunktet for cellen syklus synkroniseringen avgjørende for påvisning av Rb SUMOylation. En optimalisert eksperimentelle prosedyren er også viktig for vellykket påvisning av lavt nivå SUMO endret arter av et bestemt protein. For eksempel riktig sonication eller passerer gjennom nåler kunne forhindre dannelsen av klissete og tyktflytende komponenter på grunn av genomisk DNA, dermed riktig sonication kan forenkle totale protein utvinning. Dessuten kan en god monoklonalt antistoff med høy affinitet til målet protein være nyttig for å forbedre kvantitet og spesifisitet av immunoprecipitation. Oppsummert er den foreslåtte metoden viktig for videre utforsking av fysiologiske forhold som endogene Rb er SUMOylated, som er forutsetningen av følgende overuttrykte-baserte funksjonelle analysen.
For å forsterke SUMO signalet til en gitt protein, er det vanlig å co-overexpress dette proteinet samt andre SUMO-relaterte proteiner (vanligvis Ubc9 og SUMO protein) i cellene. Selv om en enkelt Western blot bruke et antistoff mot underlaget er den enkleste måten å finne høyere molekylvekt, SUMOylated form av dette proteinet, kunne vi gjenkjenne SUMO-Rb med denne metoden. Dermed notatet bare fokusert på en metode for å oppdage SUMO-endring av utfelt eksogene Rb protein. Videre er beskrevet denne metoden hvordan å kunstig øke eller eliminere SUMO-Bøyning av Rb. Som den eneste E2 ligase, har Ubc9 funnet direkte overføre SUMO konkrete mål22. Dermed kombinerer til C-terminalen på Rb, Ubc9 betydelig fremmer SUMO-endring av Rb. denne metoden, forfatterne av notatet vist at SUMOylation av Rb tilstrekkelig fremmet sin egen fosforylering ved å øke sin binding til CDK213. Videre for å studere funksjonelle konsekvensene av tap av Rb SUMOylation, generert forfatterne en SUMO-mangelfull Rb konstruksjon, som tidligere rapportert11. Ved hjelp av metoden foreslått i denne dagens papir, ble det vist at SUMO-Rb er nødvendig for normal celle syklus progresjon og celle spredning13.
I tillegg til SUMO1 spille SUMO2 og SUMO3 også viktige roller i protein SUMOylation14,17. SUMO2 og SUMO3 er ofte referert til som SUMO2/3 fordi de er nært beslektet og dele 97% identitet. SUMO1 aksjer en 50% likhet med SUMO2/3. Det er allment akseptert at SUMO1 er ansvarlig for normal celle fysiologiske funksjoner og vedlikehold, mens SUMO-2/3 er hovedsakelig involvert i celle stress svar15,17,23, 24. at Rb kan også være SUMOylated av SUMO2/3 med ukjent funksjon12, metoden foreslått i denne studien er fortsatt egnet for deteksjon og analyse av denne endringen av Rb. I tillegg til Rb, kan metodene som er beskrevet her bli mye brukt til gjenkjenning og funksjonell analyse av SUMOylation av en rekke mål proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra vitenskap og teknologi Commission of Shanghai (Grant nr. 14411961800) og National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
