투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.
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방법 논문
C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨
이 논문에서
요약
초록
다세포 튜브, 모든 내부 장기의 기본 단위는 루멘과 basolateral 막 서로 또는 세포 외 매트릭스 연락 안 감 꼭대기 멤브레인과 편광 된 상피 또는 내 피 세포의 구성 됩니다. 이 독특한 막 비대칭 설립 되 고 기관 morphogenesis 동안 유지 하는 방법 아직도 세포 생물학의 미해결된 질문 이다. 이 프로토콜 꼭대기 막 및 루멘 속에 강조와 함께 튜브 morphogenesis 동안 편광된 막 속의 분석을 위한 모델 선 충 C. 소장을 설명합니다. C. 선 충 20 셀 단일 레이어 창 자 상피 간단한 양측 대칭 관, 허용 하는 단일 세포 수준에서 분석으로 배열 된다. 막 분극 발생 합니다 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션 동안 초기 embryogenesis, 하지만 드 노 보 편광 막 속 세포 이상 증식 및 이동 하는 때 애벌레의 성장을 통해 계속. 후자의 설정을 동시에 이러한 서로 다른 편광 프로세스, 대부분 극성 모델에서 구분 하기 어려운 중재 subcellular 변경 분리 있습니다. 꼭대기-basolateral 막-, 접합-, cytoskeletal-endomembrane 구성 요소 또는 수 있습니다 분류 및 GFP 융해 단백질에 의해 개발을 통해 추적 제자리에서 얼룩이 지는 항 체에 의해 평가. 생물의 유전적 다양성, 함께 C. 선 충 장 따라서 독특한 vivo에서 발달, 시각 모델과 편광된 막과 튜브 속의 분자 유전 분석을 제공합니다. 여기에 설명 된 특정 방법 (모든 표준) 포함 하는 방법: 항 체 얼룩이 지기; 여 장 subcellular 구성 요소 레이블 일반적으로 필수 tubulogenesis 유전자;에 적응 하는 손실의 기능 연구에 의해 편광된 막 속에 관련 된 유전자 분석 다른 발달 단계; 극성 결함 평가 epifluorescence, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 및 confocal 현미경 검사 법; 고기 해석 시각적 결함을 계량. 이 프로토콜 분석 관련 된 매우 자주 보존된 분자의 상피 극성, 막 속, 튜브 및 루멘 morphogenesis 적용할 수 있습니다.
서론
세포 및 subcellular asymmetries, 편광된 막 도메인의 형성 등의 세대 morphogenesis 및 셀, 조직 및 장기1의 기능에 결정적 이다. 여러 연속과 일치 extracellular 및 세포내 신호는 의존 subcellular 구성 요소 할당에 방향 변경 이후 epithelia에 편광된 막 속에 대 한 연구 기술 도전 남아 어려운 대부분의 모델에서 분리 하 고 강하게 모델 시스템에 따라 달라 집니다. 모델은 여기에 제시-단일 층 꼬마 선 충 장-절묘 한 단순의 조직 이다. 단일 셀과 함께 배설 C. 선 충 ( C. 선 충 배설 운하에 편광된 막 속에 종이 동반 참조)2운하, 식별에 대 한 여러 독특한 이점을 제공 하 고 편광된 막 속에 필요한 분자 특성 이 간단한 무척 추 동물 기관 효 모에서 남자에 분자 극성 단서의 보존에 게 훌륭한"vivo에서 조직 챔버" 상피의 극성에도 아직까지 인간의 시스템에 직접적인 관련성 주소 질문에 복잡 한 단일 이러한 이벤트의 시각적 해 부를 허용을 세포 수준 비보.
비록 extracelluar 매트릭스 (1), (2) 플라....
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프로토콜
1. C. 선 충 장 라벨
참고: 조직의 특정 형광 성 감 적의 건설에 대 한 배설 운하 tubulogenesis 2의 분석에는 저자에 의해 동반 종이 참조 플라스 미드 그리고 transcriptional 및 변환 융합 단백질 (관심사의 분자의 subcellular 지 방화에 필요한 후자)에 대 한 논의 포함 하 여 유전자 변형 동물의 세대. 이 절차는 소장에 관심사의 분자를 특정 발기인을 사용 하 여 적응 될 수 있다. 표 1 C. 선 충 장 엔도-하 고 플라즈마 막과 그들의 접합을 시각화 하는 데 유용 하 게 입증 하는 분자의 예 식 소장, 운전에 대 한 발기인의 예제를 보려면 표 2 참조 장 표시자 및 발기인의 더 포괄적인 컬렉션에 대 한 리소스에 대 한 표 3.
- 항 체 선 충 C. 내장의 얼룩
- 27 , 28
- 고정
- 깨끗 한 유리 슬라이드 하....
- 고정
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결과
이 프로토콜 분자로 분석 하 고 단일 세포 및 subcellular 수준에서 선 충 C. 내장에서 편광된 막 속 및 루멘 morphogenesis 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 20-셀 단일 레이어 C. 선 충 장 감독된 세포 분열 및 중앙 embryogenesis 동안 마이그레이션에 의해 형성 된다. 도메인 설치 되 고,이 시간, 편광 막 아직 드 노 보 에서 편광된 막 속에는 성숙한 계속 하지만 편광 분석에 초점을 수 있도록 성인 기까지 4 개의 애벌레 단계에 걸쳐 상피를 확대, 막 속 (그림 1A)
C. 선 충 세포 및 subcellular 구성 요소를 시각화 하려면 두 가지 일반적으로 사용 됩니다: 면역 형광 (에 대 한 자세한이 프로토.......
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토론
이 프로토콜 표준 기능 손실 유전/RNAi 및 이미징 (라벨 부착 및 현미경) 접근 시각과 분자 해 부 의 생체 조건에 대 한 모델로 C. 선 충 장 상피의 활용을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 편광된 막과 루멘 속.
라벨
이 프로토콜은 항 체 얼룩이 지기에 초점을 맞추고. 제자리에서 항 체에 의해 라벨 라벨 형광 성 융해 단백질 (배설도 막 속에 동반 종이에 설명)2에 의해 매우 구체적인 대체 접근 방식입니다. 비록 항 체 얼룩이 라이브 이미징 허용 하지 않습니다, 그것은 (어느 라벨 방법은 실패 하지 않고) 관심사의 단백질의 지역화에 대 한 확인을 제공할 수 있습니다. 또한, morphogenesis 또는 단백질의 subcellular 지 방화에 관한 질문 종종 고정 동물에서 평가 수 있습니다. Immun.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
우리 감사 마리오 데 보노 (MRC 분자 생물학의 실험실, 케임브리지, 영국), 케네스 J. Kemphues (코넬 대학, Ithaca, 미국), 미셸 Labouesse (Institut de Biologie 파리 세 느 강, 대학교 피에르 외 마리 퀴리, 파리, 프랑스), 그레고리우스 미 쇼 (대학교 드렌 1, 렌, 프랑스)와 CGC, 긴장 및 항 체에 대 한 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금. 이 작품은 NIH GM078653, MGH는 224570 V.G.에 SAA 223809 교부 금에 의해 지원 되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항체 염색 | |||
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A452-4 | |
| 아세톤 | Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| 트윈 | Fisher Scientific | 50-213-612 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| 분유 | 시그마 | MT409-1BTL | |
| <강력한>일차 항체 | |||
| MH27 (마우스) | 농도: 1:20 자원: 발달 연구 Hybridoma Bank. | ||
| MH33 (마우스) | 농도: 1:10 자원: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| anti-ICB4 (토끼) | 집중: 1:5 자원: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England) | ||
| anti-PAR-3 (rabbit) | 집중: 1:50 자원: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University) | ||
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Floor 568 (anti-rabbit) | ABCam | AB175471 | 농도 : 1:200 |
| Cy5 (안티 마우스) | Life technologies | A10524 | 농도 : 1:200 |
| TRITC (안티 토끼) | Invitrogen | T2769 | 농도 : 1:200 |
| FITC (안티 마우스) | Sigma | F9006 | 농도 : 1:100 |
| 라벨링 된 화학 물질 | |||
| Texas Red-Phalloidin | 농도: 1:100 자원: Molecular Probes-T7471 | ||
| 재료 | |||
| 진공 그리스 실리콘 | Beckman | 335148 | |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 4448 | |
| 현미경 커버슬립 (22x22-1) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| C. elegans related | 표준 C. elegans Culture and Maintenance Procedures는 Reference29 를 참조하십시오. | ||
| 프로토콜은 LB Medium 및 plates | 참조29 참조. | ||
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| 효모 추출물 | BD Biosciences | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| 암피실린 | 시그마 | A0116 | |
| 테트라사이클린 | Fisher Scientific | BP912 | |
| M9 프로토콜은 Medium | 29 참조 | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| NGM plates | see reference29 프로토콜에 대해 설명합니다. | ||
| NaCl | 시그마 | S7653 | |
| 펩톤 | BD Biosciences | 211677 | |
| 트립톤 | Acros 유기물 | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| 콜레스테롤 | 시그마 | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| RNAi plates | see reference30 프로토콜. | ||
| NaCl | 시그마 | S7653 | |
| 펩톤 | BD Biosciences | 211677 | |
| 트립톤 | Acros 유기물 | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| 콜레스테롤 | 시그마 | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| IPTG | US Biological | I8500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 차아염소산나트륨 | Fisher Scientific | 50371500 | |
| Bacteria | |||
| OP50 박테리아 | CGC | ||
| HT115 박테리아 | CGC | ||
| 게놈 와이드 RNAi 라이브러리 Ahringer 게놈 와이드 RNAi 공급 라이브러리(ref 30,49,50) | 출처: BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) | 출처: BioScience | ||
| Imaging related | |||
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP9221-500 | |
| Equipment | |||
| 해부 현미경 | Nikon | SMZ-U | |
| 해부 현미경(Kramer Scientific), Q 캡처 소프트웨어가 있는 CCD 카메라 및 X-Cite 형광등(Photonic Solutions) | Olympus | SZX12 | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Leica Microsystem | TCS SL | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 ECLIPSE Ti-E 도립형에 장착 현미경 | 니콘 | C2 |
참고문헌
- Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
- Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE
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재인쇄 및 허가
