التحضير للثقافات ماوس العصبية القشرية نأت

ملخص

هذا الفيديو يظهر الداخلي لتوليد الخلايا العصبية من الثقافات الجنين في وقت متأخر وأوائل القشرة الماوس بعد الولادة. ويمكن استخدام هذه الثقافات للكيمياء سيتولوجية مناعية ، والكيمياء الحيوية ، الفيزيولوجيا الكهربية والكالسيوم والصوديوم والتصوير ، وتوفير منبر لدراسة تطور الخلايا العصبية من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تحمل بعدها طفرة جينية قاتلة.

الملخص

وهذا الفيديو دليل لكم من خلال عملية لتوليد الخلايا العصبية الثقافات القشرية من جنين في وقت متأخر ومخ الفأر في وقت مبكر بعد الولادة. ويمكن استخدام هذه الثقافات لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك كيمياء سيتولوجية مناعية والكيمياء الحيوية والكهربية ، والتصوير الكالسيوم والصوديوم والبروتين و / أو RNA العزلة. هذه الثقافات كما توفر منبرا لدراسة تطوير الخلايا العصبية من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تحمل الجنين في وقت متأخر بعد الولادة أو طفرة جينية قاتلة. هذا الإجراء هو نسبيا على التوالي إلى الأمام ، ويتطلب بعض الخبرة في مجال تقنية زراعة الأنسجة ، وينبغي ألا يستغرق وقتا أطول من ساعتين الى ثلاث ساعات إذا كان قد أعد عليك بشكل صحيح. والفصل الدقيق للقشرة القشرية من السبيل المهادي القشري الألياف تقلل من عدد الخلايا العصبية غير المرغوب فيها. لزيادة الغلة من الخلايا العصبية متمزج قطعة من نسيج قشري بلطف بعد خطوة حضانة الانزيم. هذا أمر حتمي لأنه يمنع الاصابة لا لزوم لها على الخلايا المبكرة وموت الخلايا العصبية. لأن الحفاظ على هذه الثقافات في غياب الخلايا الدبقية المغذية ، كما أنها توفر ميزة إضافية للثقافات النمو المخصب في الخلايا العصبية.

البروتوكول

الاستعدادات قبل يوم من زراعة :

• تحضير محلول معقم تشريح (DS).
• إعداد NBM/B27 (Mediom Neurobasal مع ملاحق B27).
• الأوتوكلاف DDH ₂ O وتعقيم coversilps الزجاج ، وإذا لزم الأمر.
• أطباق معطف أو زراعة الأنسجة coverslips الزجاج مع بولي يسين - D.

بولي - D - يسين طلاء :

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S9625
جهاز Vibraslicer	Campden Instruments
كلوريد البوتاسيوم	Sigma-Aldrich	P4504
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة	Sigma-Aldrich	S0876
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
سكروز	Sigma-Aldrich	S0389
بولي-D-لايسين	Sigma-Aldrich	P7280
مكمل B27	Invitrogen	17504-044
وسط Neurobasal (NBM)	Invitrogen	21103-049
حمض 2-أمينو-5-فوسفونو بنتانويك	Sigma-Aldrich	A5282
ألبومين بقري	Sigma-Aldrich	A7030
مثبط التربسين	Sigma-Aldrich	T9253
هيدروكسيد الصوديوم، محلول 1N	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
أجار باكتو (Bacto Agar)	Difco Laboratories	0140-01
باباين	Worthington Biochemical	LS 03126
مرشح سرنجة معقم 0.2 μm	Fisher Scientific	DDA02025S0
غطاءات زجاجية، رقم 1، 12 مم	Bellco Glass	1943-00012
وسط أساسي أدنى (MEM)	Invitrogen	11090-081	مع أملاح Earle’s وبدون L-glutamine، مطلوب لنمو المزارع غير العصبية
بنسلين/ستريبتومايسين	Invitrogen	15070-063	للمزارع غير العصبية
مصل بقري جنيني	Invitrogen	16140-071	مطلوب للمزارع غير العصبية
زجاجات Nunclon "Triple Flask" لاستزراع الأنسجة	Fisher Scientific	12-565-25	تستخدم للمزارع غير العصبية. هذه الزجاجات مريحة للغاية عند إنتاج "وسط Neurobasal/B27 مُكيَّف"، ولكن يمكن استخدام أي زجاجات أو أطباق استزراع أنسجة أخرى بدلاً منها.
أطباق "تصوير" ذات قاع زجاجي	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	أطباق استزراع بقاع زجاجي، 35 مم، مثالية لتصوير الكالسيوم أو الصوديوم عند استخدام إعداد تصوير مقلوب. ولكنها باهظة الثمن!