De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

Samenvatting

Deze video toont een procedure voor het genereren van neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale muis cortex. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming en een platform te bieden voor de neuronale ontwikkeling van transgene dieren die een postnatale dodelijke genmutatie dragen bestuderen.

Samenvatting

Deze video zal u door het proces voor het genereren van corticale neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale hersenen van muizen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming, eiwit en / of RNA isolatie. Deze culturen ook een platform om de neuronale ontwikkeling van transgene dieren dat een te late embryonale of postnatale dodelijk genmutatie dragen bestuderen. De procedure is relatief eenvoudig, vergt enige ervaring in weefselkweek techniek en mag niet langer duren dan twee tot drie uur of u goed voorbereid. Een zorgvuldige scheiding van de corticale schil van de thalamo-corticale fiber-darmkanaal vermindert het aantal ongewenste niet-neuronale cellen. Ter verhoging van opbrengsten van neuronale cellen voorzichtig vermaal de stukken van de corticale weefsel na het enzym incubatie stap. Dit is noodzakelijk omdat het voorkomt onnodige schade aan cellen en vroegtijdige neuronale celdood. Aangezien deze culturen worden gehandhaafd in de afwezigheid van glia feeder cellen, ze bieden ook een extra voordeel van de groeiende culturen verrijkt met neuronen.

Protocol

Voorbereidingen voor de dag van het kweken:

• Bereid steriele ontleden oplossing (DS).
• Bereid NBM/B27 (Neurobasal Mediom met B27 supplementen).
• Autoclaaf DDH ₂ O en steriliseren glas coversilps, indien nodig.
• Vacht weefselkweek gerechten of glazen dekglaasjes met poly-D-lysine.

Poly-D-Lysine Coating:

Bereid de dag voor het kweken van onder steriele omstandigheden.

• Dooi hoeveelheid van 10X PDL en leg ze op ijs.
• Voeg 9 ml steriele ultra-gefilterd water tot 1 ml van PDL en meng goed (1x).
• Coat oppervlakken met 1X PDL 's nacht....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P4504
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	S0876
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal medium (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-fosfonopentaanzuur	Sigma-Aldrich	A5282
Bovien albumine	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsineremmer	Sigma-Aldrich	T9253
Natriumhydroxide, 1N oplossing	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteïne	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papaïne	Worthington Biochemical	LS 03126
Steriel 0,2 μm spuitfilter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glazen dekglasjes, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Medium (MEM)	Invitrogen	11090-081	met Earle’s zouten zonder L-glutamine, nodig voor het kweken van niet-neuronale culturen
Penicilline/Streptomycine	Invitrogen	15070-063	voor niet-neuronale culturen
Foetaal bovine serum	Invitrogen	16140-071	nodig voor niet-neuronale culturen
Nunclon "Triple Flask" weefselkweekfles	Fisher Scientific	12-565-25	Gebruiken voor niet-neuronale culturen. Deze flessen zijn zeer handig bij het produceren van "geconditioneerd Neurobasal medium/B27", maar elke andere weefselkweekfles of schaal kan in plaats daarvan worden gebruikt.
Glazen bodem "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Kweekschalen van 35mm met glazen bodem, ideaal voor calcium- of natrium-imaging bij gebruik van een geïnverteerde imaging-opstelling. Echter kostbaar!