Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

Résumé

Cette vidéo montre une procédure pour générer cultures de neurones de l'embryon et au début du cortex de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisées pour l'immunocytochimie, la biochimie, l'électrophysiologie, de calcium et de sodium d'imagerie et de fournir une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du gène létal postnatale.

Résumé

Cette vidéo va vous guider à travers le processus pour générer des cultures de neurones corticaux de l'embryon et au début de cerveau de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisés pour une variété d'applications, y compris immunocytochimie, biochimie, électrophysiologie, d'imagerie du calcium et de sodium, de protéines et / ou d'isolement d'ARN. Ces cultures fournissent également une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du retard embryonnaire ou postnatale gène létal. La procédure est relativement simple, nécessite une certaine expérience dans la technique de culture de tissus et ne devrait pas prendre plus de deux à trois heures si vous êtes bien préparé. Attention séparation de l'écorce corticale par le tractus de fibres thalamo-cortical permettra de réduire le nombre des grossesses non désirées cellules non-neuronales. Pour accroître les rendements des cellules neuronales triturer les pièces du tissu cortical doucement après l'étape d'incubation enzymatique. C'est impératif car elle prévient les blessures inutiles aux cellules et la mort prématurée de cellules neuronales. Étant donné que ces cultures sont maintenues en l'absence de cellules nourricières glie, ils offrent également un avantage supplémentaire de cultures de plus en plus enrichies en neurones.

Protocole

Les préparatifs avant le jour de la culture:

• Préparer une solution stérile de dissection (DS).
• Préparer NBM/B27 (Mediom Neurobasal avec B27 suppléments).
• Autoclave ddH ₂ O et stériliser coversilps verre, si nécessaire.
• Manteau plats de culture de tissu ou de lamelles de verre avec de la poly-D-lysine.

Poly-D-Lysine Coating:

Préparer la veille de culture dans des conditions stériles.

• Aliquote de dégel du PDL 10X et le placer sur la glace.
• Ajouter 9 ml stériles ultra-eau filtrée à 1 ml de PDL et bien mélanger (1X).
• Surfaces Ma....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P4504
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S0876
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
Supplément B27	Invitrogen	17504-044
Milieu Neurobasal (NBM)	Invitrogen	21103-049
Acide 2-amino-5-phosphonopentanoïque	Sigma-Aldrich	A5282
Albumine bovine	Sigma-Aldrich	A7030
Inhibiteur de la trypsine	Sigma-Aldrich	T9253
Solution d'hydroxyde de sodium, 1N	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cystéine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papaine	Worthington Biochemical	LS 03126
Filtre stérile pour seringue, 0,2 μm	Fisher Scientific	DDA02025S0
Couvre-objets en verre, n°1, 12 mm	Bellco Glass	1943-00012
Milieu Essentiel Minimum (MEM)	Invitrogen	11090-081	avec les sels d'Earle’s, sans L-glutamine, nécessaire pour la culture de cellules non neuronales
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15070-063	pour la culture de cellules non neuronales
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	16140-071	nécessaire pour les cultures non neuronales
Flacon de culture cellulaire Nunclon "Triple Flask"	Fisher Scientific	12-565-25	À utiliser pour les cultures non neuronales. Ces flacons sont très pratiques pour produire du "milieu Neurobasal/B27 conditionné", mais tout autre flacon ou boîte de culture cellulaire peut être utilisé à la place.
Boîtes de culture "Imaging dishes" à fond en verre	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Boîtes de culture de 35 mm à fond en verre, idéales pour l'imagerie calcique ou sodique en configuration de microscope inversé. Mais coûteuses !