L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.
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Articolo metodologico
Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fenotipi mutanti di zebrafish sono spesso in modo incompleto con liquidi penetranti, solo che si manifesta in alcuni mutanti. Fenotipi interessanti che compaiono in modo incoerente possono essere difficili da studiare e possono portare a risultati di confondimento. Il protocollo descritto qui è un paradigma di allevamento semplice per aumentare e diminuire la penetranza nei mutanti scheletrica letale zebrafish. Perché mutanti letali non possono essere selettivamente allevati direttamente, la strategia di allevamento selettivo classico di progenie test è impiegata. Questo metodo include anche protocolli per Kompetitive Allele specifico PCR (KASP) genotipizzazione zebrafish e colorazione zebrafish larvale della cartilagine e dell'osso. Applicare la strategia di allevamento descritta qui può aumentare la penetranza di un fenotipo scheletrico interessante consentendo ulteriori risultati riproducibili in applicazioni a valle. Inoltre, diminuendo la penetranza mutante attraverso questa strategia di allevamento selettivo può rivelare i processi di sviluppo che richiedono più fondamentalmente la funzione del gene mutato. Mentre lo scheletro in particolare è considerato qui, proponiamo che questa metodologia sarà utile per tutte le linee mutanti di zebrafish.
Introduzione
Zebrafish è un sistema potente modello per comprendere lo sviluppo scheletrico. Con ceppi mutanti di zebrafish, biologi possono decifrare la funzione del gene durante skeletogenesis. Tuttavia, zebrafish fenotipi mutanti scheletrico possono presentare con penetranza variabile1,2,3,4 che può ostacolare l'analisi evolutiva e genetiche. Lo scopo di questo metodo è triplice. In primo luogo, generando linee mutanti di zebrafish che costantemente producono fenotipi gravi consente studi evolutivi a valle come registrazione time-lapse trapianto e
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Protocollo
tutti gli esperimenti descritti nel presente protocollo sono stati completati in conformità e rispetto dell'Università del Colorado e la University of Oregon istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC).
1. preparare il brodo non selezionati a partire
- identificare portatori eterozigoti dell'allele del mutante di interesse da pinna clip 11 e genotipizzazione uno stock di animali pieno-fratello germano di un metodo di scelta, come KASP 12 , 13 , 14. Questo protocollo è stato effettuato con il ceppo mef2....
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Risultati
Questo protocollo è una tecnica di allevamento a lungo termine utile per mutanti di comprensione zebrafish scheletrico (Figura 1). Allevamento selettivo di progenie test dovrebbe produrre un cambiamento in generale penetranza sia verso il basso e verso l'alto in poche generazioni (Figura 2). Nel nostro lavoro precedente, due turni di allevamento selettivo ha guidato la penetranza media verso il basso dal 17% al 3%
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Discussione
Allevamento selettivo svela sottigliezze della funzione del Gene
Lo spostamento di fenotipi mutanti per essere più o meno gravi di allevamento selettivo è un modo semplice per acquisire nuove conoscenze in funzione del gene. Quando confrontato con i metodi standard di allevamento non selezionato, il protocollo qui presentato può produrre una comprensione più completa dei fenotipi mutanti. In particolare, tramite la generazione di ceppi che sono gravi, può essere rivelata l'int.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Chuck Kimmel per l'orientamento, John Dowd aiuto nello sviluppo di questa strategia di allevamento, Macie Walker per il suo lavoro nel perfezionare la macchia scheletrica e Charline Walker e Bonnie Ullmann per zebrafish utili consigli. Questo lavoro è stato supportato da K99/R00 DE024190 a JTN.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeide, pellettato, solido | Ted Pella Co. | 18501 | PFA pellettato è un'alternativa più sicura al cloruro di magnesio PFA in polvere |
| , solido | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, acquoso | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof etanolo | |||
| Alcian Blue, solido | Anatech Ltd. | 867 | Deve provenire da Anatech |
| Alizarin Red, solido | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerolo, liquido | Fisher | BP229 1 | |
| Perossido di idrogeno, liquido | Fisher | BP263500 | |
| Idrossido di potassio, solido | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Macchina per PCR in tempo reale | Applied Biosystems | ||
| Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp Fast con codice a barre (0,1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Guarnizione Microseal 'B' | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solido | Fisher | BP153 500 | |
| cloruro di potassio, solido | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquido | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinasi K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Termociclatore | BioRad | 1861096 | |
| Pastore a goccia controllata Pipette | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | per la quantificazione del DNA |
Riferimenti
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
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Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Penetranza dei mutanti di zebrafishstrategia di test della progenieprotocollo di genotipizzazione KASPcolorazione con rosso Alcianomutanti scheletrici letalimetodo di incrocio selettivoanalisi della cartilagine e dell'ossocomprensione delle serie fenotipicheceppi ad alta e bassa penetranzamantenimento delle linee di zebrafish
