여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 노화는 안정적인 세포 성장 체포, 암과 노화 등 많은 생리와 병리학 과정에 대 한 중요 한 특징은 스트레스 반응이 다. 최근, 노화 또한 조직 수리 및 재생에 연루 되었습니다. 따라서, 그것은 점점 노화 세포에 vivo에서식별에 중요 한 되고있다. 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 노화 세포 모두 문화에 vivo에서감지 하는 가장 널리 사용 되 분석 결과가 이다. 이 분석 결과 기반 노화 세포에서 증가 lysosomal 내용을 lysosomal β-galactosidase 활동의 조직화 학적인 탐지 중형 pH 6 (5.5)에서 수 있습니다. 다른 분석 실험, cytometry, 같은 비교 관련 조직 구조, 형태, 위치와 같은 중요 한 정보를 제공 합니다 그들의 거주 환경에 노화 세포의 식별 수 있습니다 그리고 커플링 immunohistochemistry (IHC)를 통해 다른 마커와 가능성. SA-β-Gal 분석 결과의 주요 한계는 신선 또는 냉동 샘플의 요구 사항입니다.
여기, 우리가 어떻게 세포 노화를 이해 하는 상세한 프로토콜 현재 셀룰러 소성 및 조직 재생 비보를 촉진. SA-β-Gal 사용 하 여 조직 재생 연구에 기초가 튼튼한 시스템은 부상 시 골격 근육에 노화 세포를 감지. 또한, IHC 사용 하 여 유전자 변형 마우스 모델에서 Nanog, 만능 줄기 세포의 마커를 감지. 이 프로토콜 검사 하 고 세포 노화 유발된 세포가 소성 그리고 vivo에서 프로그래밍의 맥락에서 정할 수 있습니다.
서론
세포 노화 스트레스 응답 안정적인 세포 주기 검거가 특징의 한 형태입니다. 지난 10 년간에서 연구는 단단히 설립 노화 배아 개발, 섬유 증, 및1,2노화 하는 유기 체를 포함 하 여 다양 한 생물 학적 및 병 적인 프로세스와 연결 된. 세포 노화는 그들의 일차 수명 telomere 단축3에 의해 실행의 끝에 인간의 섬유 아 세포에서 처음 확인 되었다. 일차 스트레스, 노화, DNA 손상, 산화 스트레스, 종양 신호는의 결국에 p53/p21 또는 pRB 통로 활성화 하는 게놈/epigenomic 변경 등을 일으킬 수 있는 다른 많은 자극 있습니다. 설정 하 고 영구 성장 체포1강화. 노화 세포의 중요 한 특성 중 하나는 그들은 metabolically 활성 상태로 유지 하 고 견고 하 게 표현 하는 노화에 관련 된 분 비 형 (SASP): 많은 염증 성 cytokines, 성장 인자, 세포 외 매트릭스의 분 비 요인4. SASP 요소를 중재 하 고 면역 세포를 유치 하 고 지역 및 조직의 조직 milieus1변경에 그들....
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프로토콜
동물 인 파스퇴르 (CETEA) 승인 프로토콜의 윤리 위원회와 유럽 공동체 지침에 의하여 처리 했다.
1. 재고 솔루션의 준비
- 근육 샘플 고정을 위한 자료 준비. 20 mL 물 근육 고정을 위한 동결 포함 매체 수 있도록 RT에서 tragacanth 껌의 0.5 g을 녹.
- SA-β-Gal 얼룩에 대 한 솔루션을 준비.
- 재고의 솔루션 K 3 Fe(CN) 6 (100 m m), K 4 Fe(CN) 6 (100 m m), MgCl 2 (1m) 증류수에 각각 분말을 용 해 하 여 준비.
- 물에 희석 하 여 0.2% C 20 H 6 Br 4 나 2 O 5 (오신)의 재고 솔루션을 준비.
- 없음 (dimethylformamide, DMF) C 3 H 7에서 X-여자 분말을 용 해 하 여 C 14 H 15 BrClNO 6의 재고 솔루션 (X-ga....
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결과
근육 부상 유발 세포 노화를 감지
그것은 최근에 입증 되었습니다 근육 부상을 과도 세포 노화14유도. 10 일 후 부상 (DPI)에서 손상 된 myofibers의 대부분 위치 핵, myofibers, 재생의 품질 증명으로 재생을 겪고 있다 그리고 근육의 아키텍처는 다시 설립. 침투 염증 세포는 특정 지역에 표시 하면서 극적으로 감소 된다. 10 DPI 있기 때문에 적은 괴 사 성 및 염증 성 세포는 얼룩과 방해 하는 근육에 SA-β-Gal에 의해 노화 세포를 감지 하는 좋은 시간 점입니다. 얼룩의 특이성을 결정, TA 같은 마우스 (그림 1A)에서 PBS를 주입 중요 한 부정적인 통제로 사용 됩니다.
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토론
여기, 선물이 모두 노화를 검출 하는 방법 및 pluripotent 줄기 세포 재프로그래밍 쥐의 골격 근육. 이 방법은 평가 척도 모두 노화 세포가 소성에 vivo에서, 유도 그리고 조직 수리 및 재생에 노화의 역할을 검토 사용 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 골격 근육에 노화 세포 vivo에서 감지 하 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 사용 합니다. 이 분석 결과 중형 pH 6.0 (5.5), 연관 특히 노화 세포,이 효소의이 활동은 일반적으로 산 성 pH 4.516,17에서 측정 하는 동안에 증가 lysosomal β-galactosidase 활동을 감지 합니다. 따라서, 그것은 pH를 조정 하는 것이 중요 (pH = 6 또는 5.5) 노화 관련 활동의 특정 한 탐지를 위해. 또한, 카운터 오신와 얼룩.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
우리는 Clemire Cimper에 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 빚을입니다. H.L.의 연구실에서 작업 파스퇴르, 검색 과학 센터 국가 부 라와 직원 회 드 라 검색 (응용 d'Excellence, 소생 Investissement d'Avenir;에 의해 투자 되었다 ANR-10-LABX-73), 직원 회 드 라 검색 (ANR-16-CE13-0017-01) 및 Fondation 호 (PJA 20161205028). 참조 및 교류는 박사에 의해 부활 컨소시엄에서 박사 장학 자금을.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | SA-&beta용; Gal 염색 용액 |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | SA-&beta용; Gal 염색 용액 |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | SA-&beta용; Gal 염색 용액 |
| X-Gal | Sigma | B4252 | SA-&beta용; Gal 염색 용액 |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | 생체 내 재 프로그래밍 유도 |
| 용 Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | 근육 부상 |
| 용 글루 타르 알데히드 | 시그마 | 111-30-8 | 고정 용액 |
| 파라 포름 알데히드 | 전자 현미경 과학 | 50-980-487 | 고정 용액 |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | 투과화 용액 |
| Triton | Sigma | 93443 | 투과화 용액 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | 세척 용액 |
| 항체 항나노 | 세포 신호 8822S | Rabbit monoclonal 항체 | |
| EnVision+ Kits (HRP. 토끼. DAB+) | Dako | K4010 | 나노그 계시 |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | 카운터 스테인닝 |
| 빠른 빨간색 | Vector Laboratories | H-3403 | 카운터 스테인닝 |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher 과학 | 9990402 | 마운팅 솔루션 |
| 빠른 경화 마운팅 매체 현미경 검사용 : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | 마운팅 솔루션 |
| 현미경 위상차 명시야 CKX41: 10X-20X-40X 대물렌즈 | 나노 정량화를 위한 | Olympus | CKX41 |
| 마우스: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | 재프로그래밍 가능한 마우스 모델 |
| 골격근, 경골 전방 | |||
| 슬라이드 스캐너 | Zeiss | Axio Scan Z1 | 슬라이드 스캔 |
참고문헌
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2....
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재인쇄 및 허가
