Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético após lesões enquanto induzindo na vivo reprogramação. Este método é adequado para avaliar o papel da senescência celular durante a regeneração do tecido e reprogramação na vivo.
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Artigo de método
Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético
Neste artigo
Resumo
Resumo
Senescência celular é uma resposta ao estresse que é caracterizada por uma detenção estável de crescimento celular, o que é importante para muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como câncer e envelhecimento. Recentemente, a senescência também tem sido implicada na regeneração e reparo tecidual. Portanto, tornou-se cada vez mais crítico para identificar células senescentes em vivo. Senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais utilizado para detectar células senescentes tanto na cultura e na vivo. Este ensaio é baseado no aumento conteúdo lisossomal nas células senescentes, que permite a detecção histochemical da atividade lisossomal β-galactosidase em pH suboptimum (6 ou 5.5). Em comparação com outros ensaios, tais como citometria de fluxo, isto permite a identificação de células senescentes em seu ambiente residente, que oferece informações valiosas, tais como a localização, relacionadas com a arquitectura do tecido, a morfologia e o possibilidade de acoplamento com outros marcadores através de imuno-histoquímica (IHC). A limitação principal do ensaio SA-β-Gal é a exigência de amostras frescas ou congeladas.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para entender como celular senescência promove celular plasticidade e tecido regeneração em vivo. Nós usamos SA-β-Gal para detectar células senescentes no músculo esquelético após a lesão, o que é um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração de tecidos. Além disso, usamos IHC para detectar Nanog, um marcador de células-tronco pluripotentes, em um modelo do rato transgénico. Este protocolo permite-nos analisar e quantificar a senescência celular no contexto da plasticidade celular induzida e na vivo reprogramação.
Introdução
Senescência celular é uma forma de reação de estresse, caracterizada por uma detenção do ciclo celular estável. Na última década, pesquisa estabeleceu-se firmemente que a senescência é associada com vários processos biológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, fibrose e organismo envelhecimento1,2. Senescência celular foi identificada em fibroblastos humanos no final de sua vida replicative desencadeada por telômero encurtamento3. Além do estresse replicative, existem muitos outros estímulos que podem induzir a senescência, incluindo danos, estresse oxidativo, onco....
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Protocolo
os animais foram tratados conforme orientações da Comunidade Europeia e o Comité de ética dos protocolos Institut Pasteur (CETEA) aprovado.
1. preparações das soluções estoque
- preparar os materiais para fixação de amostra do músculo. Dissolver 0,5 g de adragante com 20 mL de água em RT tornar o meio de congelação-incorporação para fixação muscular.
- Preparar as soluções para a coloração de SA-β-Gal.
- Preparar as estoque soluções de K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M), dissolvendo os respectivos pós em água destilada.
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Resultados
Detecção de senescência celular induzida por lesão de músculo
Foi recentemente demonstrado que a lesão muscular induz transitória senescência celular14. Em 10 dias pós-lesão (DPI), a maioria do myofibers danificado está em fase de regeneração com núcleos centralmente localizados, uma marca registrada de regeneração myofibers, e a arquitetura do músculo é restabelecida. As células inflamatórias infiltrante sã.......
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Discussão
Aqui, apresentamos um método para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético de ratos reprogramáveis. Esse método pode ser usado para avaliar e quantificar os dois senescência e induzir plasticidade celular na vivoe examinar o papel da senescência em reparação de tecidos e regeneração.
No protocolo atual, o ensaio da senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) é usado para detectar células senescentes no vivo no músculo esquelético. .......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Estamos em dívida com Clemire Cimper por seu excelente suporte técnico. Trabalho no laboratório de H.L. foi financiado pelo Instituto Pasteur, Centre National pour la Recherche científico e a Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire conquistou Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), a Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e ARC Fondation (PJA 20161205028). C.C. e C.A. são financiados pelo doutorado e pós-doutorado bolsas do consórcio reviver.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | Para SA-β Solução de coloração Gal |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | Para SA-β Solução de coloração Gal |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | para SA-β Solução de coloração |
| Gal X-Gal | Sigma | B4252 | para SA-β Solução de coloração Gal |
| Doxiciclina | Sigma | D3447 | Para induzir a reprogramação in vivo |
| Cardiotoxina | Lotaxan Valence, França | L8102 | Para lesão muscular |
| Glutaraldeído Sigma | 111-30-8 | Para solução de fixação | |
| Paraformaldeído | Ciência de microscopia eletrônica | 50-980-487 | Para solução |
| de fixaçãoNaCitrate: Citrato de sódio bioxtra monobásico, anidrido | Sigma | 18996-35-5 | Para solução de permeabilização |
| Triton | Sigma 93443 | Para solução de permeabilização | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A3608 | Solução de lavagem |
| Anticorpo anti- Nanog | Sinalização celular | 8822S | Anticorpo monoclonal de coelho |
| EnVision+ Kits (HRP. Coelho. DAB+) | Dako | K4010 | Para Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Contracoloração |
| Fast red Vector | Laboratories | H-3403 | Contracoloração |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Solução de montagem |
| Meio de montagem de endurecimento rápido para microscopia : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Solução de montagem |
| Microscópio de contraste de fase Campo claro CKX41: objetivas 10X-20X-40X | Microscópio | Olympus CKX41 | para quantificação de Nanog |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Modelo de mouse reprogramável |
| Músculo esquelético, Tibialis Scanner de | |||
| Zeiss | Axio Scan Z1 | Digitalização de slides |
Referências
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2....
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Reimpressões e permissões
