Summary
여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.
Abstract
상처 치유 분석 결과 효율적인 셀 마이그레이션 시험관을 공부 하는 가장 경제적인 방법 중 하나. 전통적으로, 이미지는 시작과 단계 대조 현미경을 사용 하 여 실험의 끝에 고 셀의 마이그레이션 능력 상처의 폐쇄에 의해 평가 됩니다. 그러나, 셀 이동은 동적 현상, 그리고 종래의 방법 단일 셀 이동 추적에 대 한 허용 하지 않습니다. 현재 상처 치유 분석 실험에 개선 하기 위해, 우리는 셀 마이그레이션 실시간으로 모니터링 하 라이브 세포 이미징 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 셀 추적 시스템을 기반으로 셀 마이그레이션 속도 확인할 수 있습니다 하 고 셀 마이그레이션 및 세포 증식 사이 명확한 구별을 제공 합니다. 여기, 우리 TIP60의 존재에 의해 영향을 하는 유 방 상피 세포의 다른 마이그레이션 능력을 연구 분석 상처 치유에 라이브 셀 이미징의 사용을 보여 줍니다. 세포 운동 성 높은 동적으로, 우리의 메서드는 상처 치유의 상처 폐쇄 상처 치유 분석 실험에 사용 되는 전통적인 이미징 기술을 함께 찍은 스냅샷 보다 과정에 더 많은 통찰력을 제공 합니다.
Introduction
HIV Tat에 상호 작용 단백질 60 kDa (TIP60)은 히스톤과 비 히스톤 단백질1,2acetylate 수 있는 lysine acetyltransferase 이다. 그것의 기능은 전사, DNA 손상 복구 및 apoptosis1,3,,45,6, 를 포함 하 여 여러 신호 전달 경로에 영향을 찾을 수 있습니다. 7 , 8. 또한, TIP60 자주 downregulated 암에 그 downregulation 암 전이 상관은 고 가난한 생존 요금9,,1011,12, 13,14. 종양 전이 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 그것은 다단계 과정 그리고 전이의 초기 단계는 마이그레이션 및 인접 조직을15,16으로 종양 세포의 내 습을 포함 한다. 그렇게 하기 위해 종양 세포는 먼저 기본 종양 질량 총칭 침입 셀 시트의 모양에서 분리 해야 합니다 또는으로 단일 셀17분리. 이 과정 동안 종양 세포는 종종 엽 전환 (응급), 형태학 및 세포 접착 기능17,18에 변화 결과로 상피 받을.
몇 가지 기법 연구는 마이그레이션 개발 되었습니다 그리고 종양의 내 습 능력 세포 생체 외에서. 그 중, 상처 치유 분석 결과 가장 효율적이 고 경제적인19이다. 첫째,이 방법은 마이그레이션할 및 간격 닫기 셀 되므로 셀 confluent 단층에 인공 갭의 창조를 포함 한다. 둘째, 시작 및 실험의 끝에 간격의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 마지막으로, 간격 폐쇄의 비교는 세포 이동의 비율을 결정 하는 데 사용 됩니다. 단계 대조 현미경 일반적으로 기존의 상처 치유 분석 실험에 대 한 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 상처 치유 분석 결과의 또 다른 장점은 그것은 부분적으로 종양 세포 마이그레이션 vivo에서 유사한입니다. 유사 하 게 종양 전이 에 비보를 상처 치유 분석 실험에서 셀 마이그레이션 상피 시트의 집단 이주와 분리 된 단일 셀의 마이그레이션을 보여줍니다.
그러나, 셀 마이그레이션 동적, 알려져 있다 그리고 실시간으로 세포의 움직임을 문서화 하는 필요 있다. 예를 들어, 기존의 상처 치유 분석 결과 단일 셀 움직임을 분석 하는 연구원을 허용 하지 않습니다. 다른 한편으로, 상처 치유 분석 실험에 대 한 배양 세포 들은 세포 증식을 억제 하는 혈 청을 굶 어입니다. 이것은 세포 증식으로 인해 간격 폐쇄의 가능성을 배제 하기 위해 이루어집니다. 그럼에도 불구 하 고, 있을 것입니다 아직도 일부 확산 및 세포 죽음, 및 단계 실험은 그들을 구별 수 없습니다 전후를 찍은 이미지.
라이브 세포 이미징 기술을 기존의 상처 치유 분석의 이러한 제한을 해결합니다. 라이브 영상 현미경을 사용 하 여 CO2 배양 기 및 적절 한 온도 제어와 결합 하 여, 연구원은 간격 크기를 측정할 수 있으며 세포 적극적으로 마이그레이션의 움직임을 추적 하는 동안 시간이 지남에 폐쇄의 그것의 비율의 끝에는 침략 앞에. 따라서, 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션 모니터링 구현만 셀 이동의 더 나은 시각화를 제공 하지 않습니다 하지만 또한 셀 마이그레이션 및 세포 증식, 제공 하는 더 구별 가능성에 대 한 수 세포 이동의 신뢰할 수 있는 분석.
이 연구에서는 MCF10A 유 방 상피 세포 상처 치유 분석 결과 및 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션에 TIP60의 역할을 연구 하기의 조합을 설명 하기 위해 사용 되었다. TIP60의 소모 증가 마이그레이션 능력 MCF10A 세포에서 발생합니다.
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Protocol
1입니다. 준비
- MCF10A 문화 매체를 준비: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F12 (1:1) 5% 혈 청, 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 10 µ g/mL 인슐린 승마 /.
- 혈 청 무료 매체를 준비: DMEM/F12 (1:1)와 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 10 µ g/mL 인슐린.
- SiRNA는 다음 순서를 사용 하 여:
siControl:
앞으로: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
역: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
앞으로: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
역: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3' - 10 cm 세포 문화 요리와 24-잘 접시를 사용 합니다.
2. TIP60를 사용 하 여 siRNA의 일시적인 고갈
- 하루에 1, transfection 시 약 (예: Lipofectamine RNAiMAX)의 aliquot 15 µ L의 2 mL 혈 청 매체 (예를 들어, Opti 메모리) 감소와 각각 10 µ L의 각 siRNA (10 µ M 주식), 그들을 혼합.
- 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
- 1 x 106 MCF10A 셀 10 cm 접시에 배양의 3 mL 함께 씨앗 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 10 cm 접시에 siRNA 혼합물에 의해 드롭 추가 합니다.
- 세포는 동일 하 게 37 ° C 배양 기에 그것을 올려 놓기 전에 배포 되도록 요리를 흔들어.
- 후 보육의 6 h, 포함 하는 siRNA 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.
- 하루에 2, siRNA 혼합물의 다른 배치를 준비 하 고 20 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어.
- 1 일 추가 문화 매체의 8 mL을 aspirate 하 고 신선한 문화 매체의 3 mL와 함께 그것을 대체.
- 요리에 의해 드롭 siRNA 혼합물의 두 번째 배치를 추가 합니다. 요리는 시 약은 완전히 인큐베이터에 그들을 올려 놓기 전에 혼합 되도록 흔들어.
- 6 h 후 siRNA 포함 된 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.
3. 씨 셀 상처 치유 분석 결과 대 한
- 3 일에 매체를 삭제 하 고 셀 염 분 (PBS) 버퍼 인산 염 버퍼의 2 mL을 한 번 씻어. PBS 버퍼를 삭제 합니다.
- 접시에 1 mL의 트립 신-EDTA 버퍼 x 1 추가 하 여 siControl 및 siTIP60 치료 세포를 trypsinize. 다시 20 분 동안 인큐베이터에에서 넣어.
- 각 접시에 완전 한 문화 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 pipetting에 의해 resuspend 15 mL 튜브에 그들을 전송.
- 5 분 동안 200 g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 다시 혈 청 자유로운 매체의 5 mL로 세포를 일시 중단 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
- SiControl 및 siTIP60; 6 x 105 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 잘 혼합 셀 인지 확인 합니다. 100 %confluency 위해 24-잘 접시의 한 잘에 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 6 우물 각각 siControl와 siTIP60에 대 한 씨앗
- 부드럽게 앞뒤로 접시 그리고 사이드-투-사이드 분산 되도록 흔들어. 원형 모션을 하지 마십시오. 24 h에 대 한 인큐베이터에 접시를 남겨 주세요.
- TIP60의 최저 효율 확인 나머지 셀을 수확. 이렇게 하려면 5 분 동안 200 g에서 나머지 세포 현 탁 액을 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- RNA는 상업적인 시 약을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 분리 하 고 최저 효율을 평가 하는 실시간 양이 많은 PCR을 진행.
4. 상처를 만듭니다
- 단계 대조 현미경 셀 완전히 장착 되었는지 확인 하려면 확인 하십시오. 세포는 현미경 관찰 (4 배, 10 배, 및 20 배 확대) 셀 셀 confluent 단층 형성 하고있다 연결 완벽 하 게 됩니다.
참고: siControl 셀 일반적으로 siTIP60 셀 보다 더 나은 연결합니다. 이 때문에 TIP60의 소모 셀 더 엽 같은20으로 예상 된다. 여기, 일반 벤치탑 화이트 빛 단계 대조 현미경 사용 됩니다. - 상처를 생성 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁; 우물의 중앙에 걸쳐 직선을 긁어 생성 된 상처의 길이 우물의 직경으로 동일 합니다. 모든 나머지 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.
- 부드럽게 씻어 5 번 잘 각 혈 청 무료 사용 하 여 분리 된 세포를 제거 하는 매체.
- 각 잘 하 혈 청 자유로운 매체의 1 mL을 추가 하 고 라이브 셀 이미징에 진행.
5입니다. 라이브 셀 이미징의 설치
- 현미경을 라이브 셀 이미징 챔버에서 온도 37 ° c.에 도달 하면 되도록 설정 하기 전에 적어도 1 시간을 제어 하는 온도
- 라이브 셀 이미징 시작 하기 전에 이산화탄소 (CO2) 가스 공급을 켜십시오. 5% CO2 농도 설정 합니다.
- 현미경의 무대에서 24-잘 접시를 놓고 이미징에 대 한 10 배 확대와 대물 렌즈를 선택 합니다. 직접 카메라 대신 접 안경에 내보낸된 빛 고 상처와 주위 세포를 찾기 위해 초점을 조정 합니다.
참고:이 경우에, 단계 대조와 흰색 빛 사용 되었다. - 라이브 셀 옵저버 시스템을 사용 하 여 각 잘에서 상처의 위치를 표시.
참고: 라이브 셀 이미징 시스템의 자동화 된 단계는 여러 위치에서 이미지 수집에 대 한 수 있습니다. 이미지는 한 번 모든 간격 모든 표시 된 위치에 이동 됩니다. - 시간 조건 설정: 1 시간 간격 및 72 h 기간; 이 설정에 따라 시스템 것입니다 사진을 찍고 각 표시 된 위치에 72 h. 어떤 원하는 시간 간격 설정에 대 한 모든 시간과 모니터링 기간.
참고: 여기, 기간 72 h는 최고의 이러한 셀 시작 후 72 h 혈 청 자유로운 매체에 죽어가 고 있기 때문에.
6. 단일 셀 이동 추적
- 후에 72 h. JPEG 형식에서 이미지와 동영상을 AVI 형식에서으로 데이터를 내보낼 데이터를 내보냅니다.
참고: 이것은 중요 ImageJ 소프트웨어만 AVI 형식의 동영상을 인식할 수 있기 때문 에입니다. SiTIP60 및 siControl 세포 사이 다른 셀 마이그레이션 속도 비디오에서 명확 하 게 관찰할 수 있습니다. - ImageJ 소프트웨어에 AVI 비디오를 엽니다.
- MTrackJ 플러그인 (플러그인 해야 합니다 다운로드 및 설치 별도)를 열고: 플러그인 > MtrackJ.
- MtrackJ 도구 모음에서 "추가" 탭을 클릭 하 여 비디오에서 선택 하는 단일 셀에 대 한 트랙을 추가 합니다. 침략의 끝에 셀 및 자체에 마이그레이션할 수 있는 셀을 선택 (단일 셀 마이그레이션). 비디오에서 선택한 셀의 움직임에 따라 하 고 그들을 추적 하는 것은 MtrackJ를 사용 하 여.
- 도구 모음에서 "측정" 탭을 클릭 하 여 이동 거리를 측정 합니다.
참고: 여기는 siControl에 거의 셀 단일 세포, siTIP60 세포의 많은 단일 세포로 이동 하는 반면 단일 셀 운동 측정 하기 어려운 만들기로 이동. 그러나, 침략 앞에 있는 세포의 움직임 수 여전히 추적 되며, siControl 및 siTIP60 셀에 계산. - 동영상 AVI 형식으로 트랙을 저장 합니다.
7입니다. 셀 마이그레이션 능력의 정량화
- 정량화, 0 h 이미지와 "n" h, 여기서 "n" _는 timepoint 닫히면 siTIP60 또는 siControl 세포는 완전히 상처에서 이미지를 선택 합니다.
참고: 여기, 48 h 선택 되었다, siTIP60 세포에 상처 거의 완전히 폐쇄 했다. - ImageJ는 다음 수식을 사용 하 여를 사용 하 여 백분율 마이그레이션 계량: (0 h-"n" h의 영역에서 상처의 지역) / 0 h x 100의 지역.
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Representative Results
일반 스키마의 라이브 셀 이미징 기반 셀 마이그레이션 분석 결과
그림 1A 는이 프로토콜의 스키마입니다. MCF10A 셀 siControl 전형적인 상피 형태를 보여와 페. TIP60의 고갈 후 MCF10A 셀 제어 셀 (그림 1B)에 비해 더 엽 했다.
TIP60 때 려 눕 힘 효율성의 시험
그림 2 는 TIP60 최저 효율을 보여준다. TIP60 식 수준 siTIP60 치료 후 크게 감소. TIP60, 뿐만 아니라 여러 셀 마이그레이션 관련 단백질의 표현 했다 또한 시험된20. 예를 들어 상피 마커 인 상피 접착 분자 (EpCAM)의 표현, 반면 감소 했다 Fibronectin (FN1) 및 SNAIL2의 식 (SNAI2), 위에 증가 했다는 응급 드라이버 모두 TIP60의 고갈입니다. 이러한 데이터는 라이브 셀 이미징에 사용 되는 MCF10A 세포에서 TIP60 수준 충분히 감소 되었다 건의 한다.
TIP60의 고갈 세포 이동의 동적 변경
그림 3 은 siControl 및 siTIP60 세포에 대 한 비디오를 보여준다. 동영상에는 명확 하 게 siTIP60 siControl에 비해 빠른 세포 이동을 보여줍니다. 이것 이외에, siControl 및 siTIP60 셀 사이의 셀 이동의 동적 변화는 (즉, 더 많은 단일 셀 운동 siTIP60 세포에서 관찰 되었다 반면 시트, 이동는 siControl 세포) 또한 관찰 되었다.
TIP60 최저 후 셀 이동 증가
그림 4 는 siControl 및 siTIP60 세포에 대 한 셀 이동의 정량화. 마이그레이션된 셀의 비율 TIP60의 고갈 후 크게 증가.
TIP60 소모 변경 셀 이동의 패턴
그림 5 는 추적 단일 셀 운동 비디오를 보여준다. 대부분 siTIP60 셀 단일 셀 마이그레이션 보여준 반면 siControl 세포의 대부분은 총칭 셀 시트, 그리고 보여 두 셀 단일 셀 마이그레이션의 한 부분으로 마이그레이션됩니다. 세포 이동의 패턴에 변화 고갈 된 TIP60 셀 더 엽 형을 나타냅니다.
그림 1: 실험 개요 및 대표 이미지. (A) 프로토콜의 스키마입니다. (B) MCF10A 셀의 대표 이미지는 siControl 또는 siTIP60 페. MCF10A 셀 TIP60의 고갈 후 더 엽 형태를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: TIP60 siTIP60 transfection 후 효율적으로 고갈 되었다. 실시간 양이 많은 PCR TIP60, EpCAM FN1, 및 SNAI2의 식 수준을 확인 사용 되었다. 총 RNA 격리 Trizol 시 약 제조의 프로토콜에 따라 사용 하 여 했다. 각 샘플의 총 RNA의 2 µ g cDNA를 만들기 위해 사용 되었다. 결과 배 변경으로 표시 됩니다. 말라는 내부 제어로 사용 되었다. 오차 막대는 적어도 3 독립적인 실험에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: siControl 및 siTIP60 세포의 라이브 셀 이미징 비디오 쇼 셀 이동의 다른 본. 시간 간격 1 시간으로 설정 된 고 기간 72 h. 비디오는 Zeiss 라이브 셀 관찰자를 사용 하 여 찍은. 이 동영상을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 세포 이동의 비율의 정량화. (A) 대표 이미지 라이브 셀 이미징 동영상에서 입수 했다. 오와 48 h에 찍은 사진은 사용 했다. (B) 48 h 이내 셀 이동의 비율의 정량화 이루어졌다 ImageJ 소프트웨어는 다음 수식을 사용 하 여를 사용 하 여: (0 h-"n" h의 영역에서 상처의 영역) / 0 h x 100의 지역. 오차 막대는 적어도 3 개의 독립적인 실험에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 라이브 셀 이미징 비디오 표시 단일 셀 이동 추적. 색된 선은 각 선택한 격리 된 단일 셀의 철새 트랙을 보여 줍니다. 이 동영상을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 셀 마이그레이션 과정에서 셀 수 중 이동 부착 시트;의 형태로 알려져 느슨한 클러스터; 또는 단일, 고립 된 세포입니다. 모드와 다이나믹 셀의 다른 한 상태에서 변화할 수 있다 그리고 표현 형 시간 변경할 수 있습니다. 전통적인 상처 치유 분석 결과 12 또는 24 h와 같은 긴 시간 간격으로 현미경에서 찍은 스냅 사진을 기반으로 합니다. 이 어렵게 상처 폐쇄의 동적 및 셀 움직임의 패턴을 잡으려고 합니다.
다른 한편으로, 라이브 셀 이미징 시스템 셀 마이그레이션 훨씬 짧은 간격 (30 분 또는 1 시간)와 직접 촬영 한 이미지에 대 한 실현 되지 않습니다 정확히 같은 위치에서 모니터링 합니다. 시스템은 자동으로, 그리고 연구원은 실험의 끝에 데이터를 내보낼 필요. 이 셀 움직임의 패턴 및 실시간으로 상처 폐쇄의 프로세스 모니터링을 가능 하 게. 이 연구에서 상처 치유 분석의 양적 라이브 셀 이미징 시스템의 제어 또는 TIP60 고갈 세포에 상처 폐쇄의 과정 뿐만 아니라 동적 셀 운동, 캡처 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 시스템을 사용 하 여 촬영 하는 영상에서 siControl 셀의 대부분 부착 시트, TIP60 고갈 세포 격리 된 단일 셀 (그림 3 과 그림 5)로 이동 하는 반면 이동.
세포 증식과 세포 죽음 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 연구 복잡 하 게 될 수 있습니다. 따라서, 치유 하는 부상을 분석 결과 세포 증식의 효과 최소화 하기 위해 혈 청 자유로운 매체에서 수행 됩니다. 또한, TIP60의 최저 세포 생존에 미치는 영향을 줄이기 위해 최적화 되었다. 그러나, 그것은 세포 증식과 상처 치유 분석 실험에서 세포 죽음의 영향을 없앨 수입니다. 스냅샷을 특정 시간이 시점에서 상처 폐쇄 셀 마이그레이션 또는 세포 증식 여부를 구별 하는 게 불가능 한 만드는 유일한 상처 캡처 폐쇄 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 세포 이동의 역학을 모니터링 하 고 개별 셀 운동, 세포 증식과 세포 죽음에서 셀 마이그레이션을 구별 하는 연구자 수를 추적 합니다. 이 연구에서 단일 셀 추적 siControl 셀 시트의 형태로 주로 이동 하는 동안 siTIP60 상태에서 고립 된 단일 셀의 마이그레이션 경로를 계시 했다. 라이브 셀 이미징 시스템 또한 siTIP60 세포 siControl 세포에 비해 집단 셀 마이그레이션 (즉, 셀 응집력 그룹으로 마이그레이션) 증가 점령. 동영상에서 MCF10A siTIP60 더 많은 단일 셀 움직임과 상피 세포 시트 siControl (그림 5)에 비해 빠른 마이그레이션 보여주었다.
이 프로토콜에 사용 되는 다양 한 매개 실험 오류 방지 하기 위해 최적화 해야 합니다. 첫째, 과도 transfection 후 세포 죽음의 수는 셀 마이그레이션에 미치는 영향을 최소화 하기 위해 10% 미만 이어야 한다. 이 경우에, TIP60의 고갈 세포 생존;을 줄일 수 있습니다. 로 셀 마이그레이션 복잡 하 게 만들 수 있습니다 따라서, 연구원은이 잠재적인 표현 형의 알고 있어야 합니다. 이 문제를 방지 하려면 연구자는 그들의 표적 유전자를 고갈 하는 데 사용 하는 siRNA의 양과 셀 수를 최적화 해야 합니다. MCF10A, 20 nM siTIP60 1 x 106 셀이이 연구에서 최적화 된 조건 이었다. 둘째, MCF10A 세포는 종종 클러스터 및 계산 하기 어렵다. 오류 셀 카운트에 서로 다른 조건에서 초기 셀 숫자에 큰 차이으로 이어질 수 있습니다 그리고이 상처 치유 분석 실험에 혼란 변수를 수 있다. 이 문제를 방지 하려면 적어도 20 분 중지 하는 trypsinization 고 20 번 풀을 분산 하 고 쉽게 계산 하려면 위아래로 pipetting으로 혼합 추가 완전 한 성장 매체에 대 한 MCF10A 셀 trypsinize. 셋째, 세포는 일반적으로 우물의 센터에 24-잘 접시에 시드 되 고 후. 다시 고르게 분포 되도록 시드 후 세포를 일시 중단 합니다. 인큐베이터에 그것을 올려 놓기 전에 접시 앞뒤로, 좌우로 흔들어. 넷째, TIP60의 고갈 고 따라서 연결할 더 엽 세포를 만든다. 이 경우 시간이 더 긴 기간에 대 한 인큐베이터에 접시를 둡니다. 24 시간 후 셀 일반적으로 붙어 있다. 셀 여전히 제대로 연결 하 고, 연구원은 셀 시드를 위한 완전 한 성장 매체를 사용 하 고 셀은 완벽 하 게 연결 될 때 혈 청 무료 매체와 그것을 대체 수 있습니다. 이 세포는 일반적으로 후 완전 한 매체에 12 h 첨부 됩니다. 다섯째, 상처의 가장자리 원활 하지 않을 수 있습니다. 부드러운 가장자리를 만들려고 긁 적의 속도 증가. 여섯째, 상처는 현미경의 카메라를 통해 시각화에 너무 큰 수 있습니다. 적은 힘으로 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 상처를 생성. 또는 바늘 작은 간격을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 일곱 번째, 긁 적 동안 분리는 일부 셀 다시 부족 한 세척으로 인해 상처에 첨부할 수 있습니다. 워시 PBS 대신 혈 청 자유로운 매체와 우물 적어도 5 번. 여덟째, 세포 몇 세척 후 접시에서 분리를 시작할 수 있습니다. 그러나, 세척의 수 분리 된 세포는 상처에 다시 연결 하지 마십시오 있도록 손상 될 수 없습니다. 이 경우에, 연구원은 셀 3 번 부드럽게 씻어 하 고 인큐베이터 안에 접시는 세척의 나머지 부분을 진행 하기 전에 진정 셀 수 있도록 1 h의 최대 시간에 대 한 떠날 수 있습니다. 9, 현미경, 초점을 잃을 수 있습니다 그리고 이미지가 될 수 있습니다 모호한 중간 실험을 통해. 온도 조정된 단계 거리에 작은 효과가 현미경 주위 온도 변화는 이유 있을 수 있습니다. 연구원은 현미경에 바뀌고 인큐베이터 셀에 초점을 조정 하기 전에 워밍업은 되도록 실험을 시작 하기 전에 적어도 1 시간을 제어 하는 온도.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 도움이 논의 및 의견 Jha 실험실의 구성원 감사. 스는 암 과학 연구소의 싱가포르 (R-713-006-014-271), 국가 의료 국립 연구 재단 싱가포르와 싱가포르 교육부의 연구 센터 우수 이니셔티브의 밑에서 교부 금에 의해 지원 되었다 연구 위원회 (CBRG-검; BNIG11nov001 및 CS-IRG; R-713-000-162-511), 교육 학술 연구 기금 (모에 AcRF 계층 1 T1-2012 년 10 월-04). Y.Z., G.S.C., 및 C.Y.T. 암 과학 연구소의 싱가포르, 싱가포르의 국가 대학에 의해 수 여 하는 대학원 친교에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
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