Summary
Cilia er avgjørende for riktig organogenesen. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å merke og visualisere tungeformet cellene i sebrafisk.
Abstract
De siste årene, har sebrafisk fosteret framstått som en populær modell å studere utviklingsbiologi på grunn av trekk som ex utero embryo utvikling og optisk gjennomsiktighet. Spesielt har sebrafisk fosteret blitt en viktig organisme å studere virveldyr nyre organogenesen samt multiciliated celle (MCC) utvikling. For å visualisere MCCs i embryonale sebrafisk nyre, vi har utviklet en kombinert protokoll om hele-mount fluorescerende i situ hybridisering (fisk) og montere hele immunofluorescence (hvis) som gir høy resolution tenkelig. Dette manuskriptet beskriver våre teknikk for co lokalisere transkripsjoner av RNA og protein som et verktøy for å forstå bedre regulering av utviklingsmessige programmer gjennom uttrykk for ulike avstamning faktorer.
Introduction
De siste tiårene, sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som en førsteklasses modell organisme å studere utviklingsbiologi. Embryoene utvikle utenfor mor og synlig optisk. Dannelsen av vitale organer som øyet, nyre og forebrain oppstår også, raskt, med strukturer av bare 24 h innlegget befruktning (hpf). Viktigere, er sebrafisk genomet svært bevart med pattedyr1,2,3. I tillegg har sebrafisk og pattedyr organer lignende anatomi og fysiologi. Den sebrafisk embryonale nyre, eller pronephros, viser verdien av modellsystem for å undersøke gen funksjon under tidlig nephrogenesis og skjebne fastsettelse av bevarte epithelial celle populasjoner av virveldyr nyre4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. tilsvarende sebrafisk fosteret har blitt stadig viktigere i behandlingen ontogeny MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Som navnet antyder, er MCCs epitelceller preget av masse motile flimmerhårene ligger på den apikale overflaten17. Sebrafisk, MCCs fungere i strømning og spres i en "salt-and-pepper" som mote gjennom midten av hver nyre av pronephros med 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. selv om de har bare vært nevnt i en håndfull av menneskelig nyre sykdom tilfeller18,19,20,21, MCCs er utbredt i andre pattedyr vev som hjernen og spor22,23,24, som utgjør en rekke utfordringer for eksperimentell design. Elegante studier i ulike virveldyr modeller inkludert sebrafisk har vist en bevart sti av MCC skjebne, med hakket signalveien som en inhibitor av MCC utvikling12,17,25 ,26,27. Derfor gir sebrafisk-pronephros en lett tilgjengelig modell for å studere de genetiske mekanismene av MCC utvikling i vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Både åpenhet og lett genetisk manipulering av sebrafisk embryoer har vist seg for å være uvurderlig egenskaper når studere genetiske og molekylære veier som regulerer celle skjebne, vevvekst og utvikling av tidlig embryo1,2 ,3. Som sådan, tradisjonell teknikker å visualisere protein og gene transkripsjoner, som i situ hybridisering og hele veggfeste hvis, har vært brukt på og optimalisert for de sebrafisk16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Ved å kombinere populære protokoller for fisk og hvis, er det mulig å merke og analysere MCCs i vivo16,28,37,38.
Protocol
Følgende protokollen bruker sebrafisk voksne vedlikeholdes og stelt av Center for sebrafisk forskning ved University of Notre Dame. Alle metoder for å arbeide med sebrafisk voksne og embryo ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. embryo fiksering
- Samle sebrafisk embryo med tidligere beskrevet metoder39,40. På 24 hpf, legge til 500 µL av ikke-spesifikk protease blanding løsning (50 mg/mL) på E3 i et embryo rett Incubate ved romtemperatur (RT).
- Når embryo begynner bryte ut av plasmocitara, fjerne all væsken fra embryo parabolen.
- Vask embryo 2 - 3 ganger med frisk E3 legger ca 20 mL E3, forsiktig virvlende på E3 i retten og deretter dekantere vin væsken inn i en flytende sløseri receptacle.
- For å avlive embryoene før Utbedring, legge til 2 mL 0,2% tricaine på E3.
- Overfør embryoene til en 5 mL hetteglass med en plast Pasteur pipette. Fjerne det meste av tricaine/E3 løsningen bruker pipette når embryoene har avgjort til bunnen av ampullen.
- Løsning 24 hpf embryo med 5 mL 4% paraformaldehyde (PFA) 2-4 h på RT, uten agitering.
FORSIKTIG: PFA er giftig og PFA løsninger skal håndteres under kjemiske hette mens hun har på seg Øyevern, hansker og en labfrakk. Utarbeidelse av PFA bindemiddel fra granulert PFA pulveret skal utføres med eksepsjonell omsorg, som granulert PFA pleier å spre gjennom statisk ladning.
Merk: Embryo kan fikse i 4% PFA overnatting på 4 ° C. Forberede 4% PFA ved oppvarming 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) til en koke mens røring kontinuerlig løsningen å løse granulert PFA. Når løsningen har avkjølt ned RT, 4% PFA er filter steriliseres ved å sende det via en 0,45 µm disponibel system for vakuum filtrering da og aliquoted i 15 mL eller 50 mL deler for lagring på 20 ° C. - Fjern 4% PFA og vask embryo to ganger med 1 X fosfat bufret saltvann med 0,1% Tween-20 (PBST) på RT. vask embryoer når med 5 mL av 100% metanol (MeOH) på RT. legge 5 mL frisk 100% MeOH til embryoene og Inkuber på 20 ° C i minst 20 min.
Merk: Embryo kan lagres i 100% MeOH på 20 ° C til du er klar for fosteret forberedelse.
2. embryo forberedelse og hybridisering
- Rehydrate embryoene ved vask i 5 mL av 50% MeOH i 1 x PBST for 5 min på RT. Fortsett utvanning av vaske embryoene 5 mL av 30% MeOH i 1 x PBST for 5 min på RT. vaske embryoene i 5 mL 1 x PBST to ganger i 5 min hver på RT.
- Permeabilize embryoene av rugende dem i 5 mL i en løsning av 1:1,000 proteinasen K (pK) (10 mg/mL) i 1 x PBST i 2 minutter på RT.
Merk: Eldre embryo kan være ruges lenger enn 2 minutter i pK konsentrasjonen nevnt ovenfor, men en konsentrasjon av 5 mg/mL og inkubasjon tid mindre enn 2 min er foreslått for embryoer yngre enn 24 hpf. - Fjerne pK løsning og vask umiddelbart i 5 mL 1 x PBST to ganger på RT. fikse embryoene i 5 mL av 4% PFA på RT for minst 20 min.
Merk: Embryo kan fikse i 4% PFA overnatting på 4 ° C. - Fjerne PFA og vask to ganger i 5 mL 1 x PBST på RT.
- Overføre embryo i 5 mL 1 x PBST i flat bunn microcentrifuge rør plasseres oppreist i et microcentrifuge rack på RT å lette interaksjoner mellom hver embryoet og påfølgende hybridisering løsningen.
- Vask embryo to ganger i 1,5 mL hybridisering løsning (Hyb +) på RT. legge 1.5 mL frisk Hyb + og ruge embryoer på 70 ° C i en hybridisering ovn for 4-6 h.
- Erstatte den 1,5 mL Hyb + med et volum på sonde løsning (10 µL RNA sonde/500 µL Hyb +) tilstrekkelig til å fullt ut dekker embryoene.
Merk: Syntetisere antisense RNA sonde med tidligere beskrevet metoder39. - Hybridize sonden overnatter i hybridisering ovnen på 70 ° C med personlige rør plasseres oppreist i microcentrifuge-rack uten risting.
3. varme vasker og blokkerer
Merk: Hot vasker utføres ved å sette den riktige løsningen på embryoene og deretter incubating inne hybridisering ovnen på 70 ° C. For å holde vask løsninger på 70 ° C, plasser 50 mL rør av hver løsning i hybridisering ovnen når proben / Hyb + blandingen er lagt.
- Ta proben. Vask embryoene to ganger på 70 ° C i 1,5 mL av 50% formamide/2 x saltholdig-natriumsitrat (SSC) bufferen for 20-30 minutter hver.
Merk: Proben kan lagres i Hyb + på 20 ° C og brukes på nytt senere. - Vask embryoene gang på 70 ° C i 1,5 mL av 2 x SSC i 15 min. vask embryoene to ganger på 70 ° C i 1,5 mL 0,2 X SSC i 20-30 minutter hver. Erstatt 0,2 x SSC med 1,5 mL blokkerer reagens og ruge over natten på 4 ° C.
Merk: Det er mulig å ruge blokkerer reagens på RT 4 h i stedet for overnatting.
4. antistoff inkubasjon og Maleic syre Buffer vasker
Merk: Holde embryo beskyttet mot lyset.
- Erstatt blokkerer reagensen med 0,2 mL anti-DIG-POD i blokkering reagens i forholdet 1:1,000 og ruge for 3t under folie eller en annen lys-blokkerende dekning på RT.
Merk: Alternativt antistoffer kan ruge over natten på 4 ° C. - 3t, vaskes embryoene i 1,5 mL maleic syre buffer 2 - 4 ganger i 10-15 minutter hver til RT. Incubate embryoene overnatting på 4 ° C i 1,5 mL av fersk maleic syre buffer.
Merk: Det er ikke nødvendig å ruge maleic syre buffer over natten, men gjør så reduserer sonde bakgrunn.
5. sonde oppdagelse og fjerning av Peroxidase
Merk: Holde embryo beskyttet mot lyset.
- Fjerne maleic syre buffer og erstatte med 1,5 mL 1 x PBS. Vask embryo to ganger i 1,5 mL 1 x PBS i 5 min hver på RT. Incubate embryo i 0,2 mL av Cy3 fluorescerende flekker løsning for 60 minutter til RT.
Merk: Inkubasjonstiden kan variere for forskjellige sonder. - Vaske embryoer når med 1,5 mL av følgende prosent MeOH i 1 X PBS i 10 min på RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH og 100% MeOH.
- Inkuber embryo med 1,5 mL 1% H2O2 i MeOH i 30 min på RT. Wash embryoer når med 1,5 mL følgende MeOH løsninger i 1 x PBS i 10 min på RT: 75% MeOH, 50% MeOH og 30% MeOH. Vask embryo to ganger i 5 min på RT i 1,5 mL 1 x PBS.
Merk: Embryo kan lagres i PBS natten på 4° C.
6. immunofluorescence
Merk: Holde embryo beskyttet mot lyset.
- Vask embryo i 1,5 mL av ddH2O i 5 min på RT. Wash embryo i 1,5 mL pre kjølt aceton (holdt på 20 ° C) for 7 min på RT. vask embryo i 1,5 mL av ddH2O i 5 min på RT. Wash embryo i 1.5 mL 1 x PBST med 1% DMSO (PBDT) i 5 min på RT.
- Inkuber embryo i 1,5 mL PBDT + 10% fosterets bovin serum (FBS) på en rocker på RT 2 h.
- Fjerne PBDT + FBS og erstatte med 1,5 mL primære antistoffer, anti-acetylated tubulin (produsert fra musen) og anti-γ-tubulin (produsert fra kanin), utvannet sammen på 1:400 i PBDT + 1% FBS. Inkuber embryo overnatting på 4 ° C.
Merk: Inkubasjon ganger kan variere etter primære antistoffer. Testing av ulike tidsintervaller kan være nødvendig å optimalisere merking.
7. sekundære antistoff
Merk: Holde embryo beskyttet mot lyset.
- For å fjerne overflødig ubundet antistoff fra embryoene, vask i 1,5 mL PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl for 1 min på RT på en rocker.
- Vask embryoene 5 ganger i 1,5 mL PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl i 30 min hver på en rocker på RT. vaske embryoene i 1,5 mL PBDT + 1% FBS i 30 min på RT på en rocker.
- Inkuber embryo overnatting på 4 ° C i 200 µL av sekundær antistoffer, Alexa 488 geit anti-musen IgG og Alexa 647 geit anti-kanin IgG, utvannet sammen i PBDT på 1:500.
8. DAPI flekker
Merk: Holde embryo beskyttet mot lyset.
- Vask embryoene raskt på RT i 1,5 mL PBDT to ganger. Erstatt PBDT med 1,5 mL DAPI fortynnet 1:15000 i 1 X PBST og ruge 15 min på RT på en rocker.
- Vask av embryo i 1,5 mL PDBT + 1% FBS + 0.1 M NaCl tre ganger på RT i 15-20 minutter hver. Lagre embryo i 1,5 mL PBDT på 4 ° C helt klar til å montere og bilde.
9. montere og Imaging for sebrafisk Pronephros
- Lå embryoet lateral på objektglass i liten volum, ca. 10 µL, av PBDT.
- Klem embryoet bak øynene med et par fine pinsett fjerne hodet og noen av eggeplomme.
- Bruke fine tang til å forsiktig skrape bort gjenværende eggeplomme ballen fra selve embryo. Fjern dissosiert eggeplomme og ekstra væske fra lysbildet med en tynn vev.
- Legg en dråpe montering media på gjenværende halen av embryoet og plasser slik halen er lagt til siden. Plass en dekkglassvæske på halen å flate prøven, og plasser i en dekket lysbildet.
- Bilde nyre flimmerhårene ved 60 X forstørrelse på AC confocal mikroskop bruker følgende kanaler: DAPI i blått (laser sett på 408.0 nm), FITC i grønt (laser sett på 488.0 nm), Cy3 dye-merket i rødt (laser sett på 561.0 nm), og Alexa 680 i hvitt (laser sett på 637.0 nm).
Representative Results
Vill-type sebrafisk embryo var fast på 24 hpf og umiddelbart som beskrevet ovenfor. Figur 1 viser en eksperimentell arbeidsflyt med valgte illustrert stadier. Arbeidsflyten i trinn 1-8 omfatter prosessene for eksempel innkjøp, fiksering og manipulasjon av fast vev vil merke endogene utskrifter med antisense riboprobes etterfulgt av immunofluorescence til etiketten protein(s) rundt. Trinn 9 i arbeidsflyten refererer til montering og imaging teknikker spesielt designet for å optimalisere visualisering av sebrafisk embryonale bagasjerommet. I tegninger som følge trinn 9, illustrere vi metoden for manipulasjon for posisjonering vev på et glass lysbilde. I dette trinnet embryoet hodet og eggeplomme ballen er fjernet, forlater halen å være lateralt plassert mellom glass lysbilde og dekkglassvæske. Fjerning av eggeplomme ballen og hodet er foreslått for beste avbilding av bosatt MCC befolkningen i pronephros, eggeplomme ballen auto-fluoresces og hindrer montering prosessen.
Representant bilder hentet ved hjelp av en AC confocal mikroskop finnes i figur 2, som viser samme vill-type fosteret ved 60 X forstørrelse og en digital zoom på samme forstørrelse. Toppen panelene gir bilder av hver enkelt kanal, mens bunnen to panelene er sammensatt overlegget disse bildebehandling data. Den hvite boksen (i venstre kolonne bildet) beskriver området som er fokus for digital zoom (høyre bilde). Uthevet i den endelige panelet av digital zoom, kjerner ble merket i DAPI og MCCs ble funnet basert på en antisense riboprobe utviklet for å gjenkjenne odf3b, der antistoffer mot γ-tubulin betegne basal organer og α-tubulin angir flimmerhårene. I digital zoom for sammensatt overlappingen indikerer gul stiplet sirkelen omkretsen av Mitt kundesenter, som ble identifisert på grunn av odf3b utskrifter, flere basal organer og flimmerhårene. Den tilstøtende mono-tungeformet cellen merket med en gul prikket sirkel, ble identifisert basert på fenotypen ved å ha en enkelt basal kropp og et enkelt Flimmerhår.
Figur 1: skjematisk eksperimentelle flytskjematypen. Dette flytskjema viser en eksperimentell arbeidsflyt, ledsaget av illustrasjoner av kritiske stadier der snøflaket angir kaldt inkubering, de tre buede linjene representerer varme og klokken representerer lang incubation ganger. Arbeidsflyten kan utføres i minst 6 dager (se Dagsnummer i øvre høyre hjørne av hvert trinn i prosessen), men noen trinn kan utføres over lengre tidsperioder, som angitt i protokollen. En detaljert fremstilling av montering er trukket ut, viser siste montert embryoet halen mellom objektglass og dekkglassvæske. En svart stiplede boksen beskriver området som er fotografert ved 60 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant resultater for visualisere MCCs av sebrafisk pronephros. Høyeste anslag på en 24 hpf vill-type sebrafisk fosteret ved 60 X forstørrelse samt en digital zoom på AC-confocal ved 60 X forstørrelse på den samme fosteret. De hvite boksene angir området fokusert på for zoomingen. Individuelle flekker DAPI (kjerner), odf3b (MCCs), den ble-tubulin (basal organer) og α-tubulin (flimmerhårene) er merket, og deretter flettet sammen i to nederste panelene. I digital zoom, gir vi tilnærmelser av celleplasseringen som følger: en MCC er skissert av stiplet gule sirkelen, og den prikkete gul sirkelen skisserer en mono-tungeformet celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor er optimalisert for merking MCCs i pronephros med odf3b utskrifter og α-tubulin i 24 hpf sebrafisk embryoer. De beste resultatene anbefales det å bruke ferske fast og forberedt embryoer. Embryo som er fast og lagret i enten MeOH eller Hyb + på 20 ° C lenger enn en uke kan brukes, men sannsynligheten for uønsket bakgrunn flekker øker med tiden embryoene er holdt i lagring.
Endringer og feilsøking av denne teknikken er nødvendig å skreddersy denne metoden for andre suitene på bestemt markører, f.eks andre antisense riboprobes og andre antistoffer. Mange metoder for justering av parametre for trinnene under hele mount i situ hybridisering er tidligere dokumentert av vår gruppe og andre31,34,36,38, 39. Likeledes, hver protein antistoff vil kreve noen feilsøking i flekker ganger, og omtrentlig celleområder fortynninger og inkubasjon tider for hver primære antistoff anslås beste ved evaluering av dokumenterte resultater28, 35. for embryoer yngre enn 24 hpf, pK behandling bør være kortere enn 2 minutter, hvor embryo eldre enn 24 hpf bør behandles med pK lenger enn 2 min. Også embryo eldre enn 24 hpf bør være bleket pigment før pK behandling.
Etter farging med fluorescerende flekker løsning, er det avgjørende å fjerne eventuelle gjenværende flekken, antistoffer og peroxidases ved å utføre en rekke metanol og hydrogenperoksid vasker. PBS vasker umiddelbart etter er avgjørende å fjerne overflødig metanol fra embryoene. Viktigere, før du utfører hvis antistoffer, har vi funnet at aceton og deionisert vann vasker gjøre embryoer mindre sannsynlig å forholde seg til hverandre og/eller sentrifuger rørene. I vår erfaring, antistoffer spesifikke transkripsjonsfaktorer og andre gener, selv om de kan fungere effektivt Western blotter, fungerer ikke bra for hvis sebrafisk. Men fungerer høyt konservert og rikelig proteiner, som α-tubulin og β-catenin, godt i sebrafisk for hvis16,37.
Med fisk er det mulig å visualisere RNA transkripsjoner av gener som ennå ikke har spesifikke antistoffer i sebrafisk. Ved å kombinere fisk med hvis, som demonstrert av denne protokollen, kan co lokalisering av RNA utskrifter og protein være sett i vivo (figur 2). Fleksibel natur protokollen kan rask feilsøking for visualisering av ulike RNA utskrifter og proteiner i flere vev og tidspunkt. Kombinert med allerede respektert trekk av sebrafisk embryo, gir denne protokollen fisk + hvis et annet verktøy for å utforske uttrykket av gener og proteiner viktig til utviklingsmessige veien regulering.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av grant R01DK100237 R.A.W. og feltet National Science Foundation Graduate forskning fellesskap. DGE-1313583 til A.N.M. Vi takker også College av vitenskap sommer Undergraduate Research stipendprogrammet for støtte til M.U. Vi vil gjerne takke sentrum for sebrafisk forskning ved University of Notre Dame for deres dedikert omsorgen for våre sebrafisk. Vi vil også gjerne takke departementet av biologisk vitenskap samt medlemmene av vår lab for all deres støtte og verdifull innsikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
| E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
| embryo dishes | VWR | 351029 | |
| 5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
| disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
| 10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
| 1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
| methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
| flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
| hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
| hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
| 20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
| blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
| maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
| anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
| Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
| molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
| acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
| monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
| anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
| odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
| NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
| Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
| confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
| rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
- Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
- Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
- Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
- Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
- Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
- Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
- Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
- Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
- Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
- Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
- Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
- Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
- Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
- Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
- Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
- Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
- Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
- Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
- Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
- Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
- Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
- Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).
