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Genetics

Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, जीन संपादन के लिए भ्रूण

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग कर चैनल कैटफ़िश भ्रूण में जीन संपादन के लिए एक सरल और कुशल microinjection प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । इस प्रोटोकॉल में, गाइड RNAs और Cas9 प्रोटीन एक सेल भ्रूण की जर्दी में microinjected थे । इस प्रोटोकॉल बाहर दो चैनल कैटफ़िश प्रतिरक्षा से संबंधित जीन दस्तक द्वारा मांय किया गया है ।

Abstract

चैनल के पूरा जीनोम कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, अनुक्रम किया गया है, चैनल कैटफ़िश जीन समारोह के अध्ययन के लिए अधिक से अधिक अवसरों के लिए अग्रणी । वीवो मेंइन जीन फंक्शन्स का अध्ययन करने के लिए जीन नॉकआउट का इस्तेमाल किया गया है । संकुल नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic दोहराता/CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रणाली एक शक्तिशाली करने के लिए जीन समारोह में परिवर्तन जीनोमिक डीएनए दृश्यों को संपादित उपकरण का इस्तेमाल किया है । जबकि पारंपरिक दृष्टिकोण को microinjection के माध्यम से एकल सेल भ्रूण में CRISPR/Cas9 mRNA शुरू किया गया है, यह कैटफ़िश में एक धीमी और अक्षम प्रक्रिया हो सकती है । यहां, CRISPR/Cas9 प्रोटीन के साथ चैनल कैटफ़िश भ्रूण के microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । संक्षेप में, अंडे और शुक्राणु एकत्र किए गए और फिर कृत्रिम निषेचन किया । निषेचित अंडे एक पेट्री Holtfreter समाधान युक्त पकवान को हस्तांतरित किया गया । इंजेक्शन की मात्रा पर तुले थे और फिर RNAs/Cas9 लक्ष्यीकरण/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन-एडाप्टर अणु युक्त (TICAM 1) जीन और rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन (RBL) जीन एक सेल भ्रूण की जर्दी में microinjected थे । जीन नॉकआउट indels डीएनए अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की गई के रूप में सफल रहा था । इन उत्परिवर्तनों की वजह से भविष्यवाणी की प्रोटीन अनुक्रम परिवर्तन frameshift और छोटे से समय से पहले बंद codons के कारण प्रोटीन शामिल थे ।

Introduction

Microinjection एक आम प्रयोगशाला ऐसी डीएनए, आरएनए, प्रोटीन के रूप में एक पदार्थ की एक छोटी राशि देने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया है, और एक ग्लास केशिका1के माध्यम से कोशिकाओं या भ्रूण में अंय अणुओं । Microinjection एक microinjector, micromanipulator, और एक खुर्दबीन2सहित विशेष उपकरण सेटअप का उपयोग किया जाता है । तकनीक शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है आनुवंशिक रूप से transgenics की पीढ़ी के माध्यम से कई जीवों को संशोधित करने के लिए, जीन नॉकआउट, और जीन थेरेपी, intracellular घटकों की गतिशीलता को समझने के उद्देश्य के साथ3,4 , 5.

चैनल कैटफ़िश (Ictalurus punctatus) संयुक्त राज्य अमेरिका में जलीय कृषि और मनोरंजन मछली पकड़ने की गतिविधियों में सबसे लोकप्रिय कैटफ़िश प्रजातियों में से एक है । चैनल कैटफ़िश में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन करने के लिए एक बढ़ती जरूरत है, और चैनल कैटफ़िश के पूर्ण जीनोम के अनुक्रमण जीनोम संपादन उपकरण6,7में हाल ही में अग्रिमों की उपयोगिता को बढ़ाता है । समझ जीन समारोह केवल अनुसंधान कि कैटफ़िश पर आयोजित किया जा रहा है समृद्ध नहीं होगा, लेकिन यह भी अधिक प्रभावी आनुवंशिक सुधार कार्यक्रमों को कैटफ़िश उद्योग को बढ़ाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक बार ब्याज की एक विशेषता के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान की है, वे आनुवंशिक रूप से जीनोम संपादन के माध्यम से कैटफ़िश उत्पादन में सुधार के लिए लाभकारी alleles, इन alleles के लिए चयन उत्पंन, हानिकारक alleles को दबा इस्तेमाल किया जा सकता है, स्थानांतरित transgenesis के माध्यम से लाभकारी alleles, या इन विकल्पों में से कुछ संयोजन । एक मछली में विभिंन प्रजातियों में से अलग व्यावसायिक रूप से लाभप्रद लक्षण के लिए सबसे अच्छा जीन के संयोजन बहुत उत्पादकता और मछली उत्पादन आपरेशनों के लाभप्रदता8में सुधार होगा ।

जीन नॉकआउट vivo मेंजीन फंक्शन्स का अध्ययन करने का सीधा तरीका है । डीएनए के स्तर पर उत्परिवर्तनों भावी पीढ़ियों जो विभिंन पीढ़ियों में उनके प्रभाव के अध्ययन की सुविधा होगी द्वारा विरासत में मिला होगा । विभिंन जीनोम संपादन उपकरण जस्ता फिंगर nucleases (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रभाव nucleases (TALENs), और नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic दोहराता/CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9 सहित विकसित किया गया है ) सिस्टम9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली, कुशल उपकरण है कि आरएनए-निर्देशित साइट विशिष्ट डीएनए दरार5,13के माध्यम से मछली में जीन नॉकआउट सहित जीनोमिक डीएनए दृश्यों को संपादित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्रणाली एक गाइड आरएनए (gRNA) है, जो जीनोम और एक डीएनए endonuclease एंजाइम, Cas9 में लक्षित अनुक्रम निर्धारित करता है के होते हैं । CRISPR/Cas9 प्रणाली ZFNs और TALENs पर कई फायदों के साथ जीनोम में किसी भी अनुक्रम को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है: (1) कम लागत (2) आसान इंजीनियरिंग (3) लक्ष्य अनुक्रम के लिए गाइड आरएनए के अधिक विशिष्ट बंधन, और कम लक्ष्य उत्परिवर्तनों (4) एकाधिक दृश्यों को एक ही समय में अलग gRNA के साथ लक्षित किया जा सकता है (5) जीन में उच्च mutagenesis दर है कि TALENs द्वारा रूप नहीं दिया जा सकता है, और (6) में सुधार germline संचरण दर के लिए 6-गुना जब ZFNs और TALENs14की तुलना में, 15,16,17,18.

microinjection के लिए मुख्य वैकल्पिक विधि electroporation, जिसमें बिजली आवेगों भ्रूण या कोशिकाओं के लिए लागू कर रहे है झिल्ली पारगम्यता बढ़ाने के लिए और जैविक अणुओं19,20के ऊपर ले । medaka (Oryzias latipes), zebrafish (ढाणियो rerio), चिनूक सामन (Oncorhynchus tshawytscha), चैनल कैटफ़िश, सागर ब्रीम (Sparus स॓दबा) जैसे electroporation का उपयोग करते हुए कई ट्रांसजेनिक मछली उत्पन्न हुई और कॉमन कार्प (सायप्रिनस कार्पियो)21,22,23,24,25,26.

Electroporation जीन नॉकआउट के लिए प्लाज्मिड डीएनए, आरएनए, और Cas9 प्रोटीन देने के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्तनधारी कोशिकाओं में, Cas9/gRNA प्लाज्मिड डीएनए, Cas9 mRNA/gRNA, और Cas9 प्रोटीन/gRNA परिसरों electroporation का उपयोग कर वितरित किया गया और mutagenesis सबसे Cas9 की स्थिति के लिए gRNA प्रोटीन/electroporation परिसरों का उपयोग कर रहे थे ।27परीक्षण किया गया । ascidian chordate में (Ciona intestinalis), TALENs व्यक्त constructs निषेचित अंडे में electroporated के लिए कई जीन28के नॉकआउट प्रेरित थे । ZFNs एक्सप्रेस प्लाज्मिड construction चैनल कैटफ़िश में luteinizing हार्मोन बाहर दस्तक करने के लिए electroporated थे29. हालांकि, एक बार सेल में पेश किया, प्लाज्मिड constructs आरएनए के लिए लिखित और कार्यात्मक प्रोटीन के लिए अनुवाद करने से पहले वे वांछित डीएनए अनुक्रम है, जो की संभावना mutagenesis के समय में देरी होगी लक्ष्य कर सकते है की आवश्यकता होगी आरएनए के microinjection की तुलना/ प्रोटीन. के रूप में एक भ्रूण विकसित कर रहा है, देरी mutagenesis इंजेक्शन संस्थापकों की पच्चीकारी बढ़ जाती है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति microinjection के साथ संभव अभिव्यक्ति स्तर को प्राप्त करने के लिए संभावना नहीं है, mutagenesis दक्षता कम.

कोशिकाओं में जीनोम संपादन उपकरण शुरू करने के लिए एक साधन के रूप में, microinjection electroporation पर कई फायदे हैं । जीनोम संपादन अणुओं मज़बूती से कोशिकाओं या भ्रूण में microinjection30के माध्यम से शुरू किया जा सकता है । कम इंजेक्शन सामग्री की जरूरत है । यह सामग्री इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए आसान है । संस्थापक मछली में कम मोज़ेक के साथ उच्च उत्परिवर्तन दर हासिल किया जा सकता है जो एफ1के लिए उत्परिवर्तनों के germline संचरण में सुधार होगा । कम संस्थापक मछली के लिए पहली पीढ़ी के उत्पादन, उच्च उत्परिवर्तन दर के कारण विश्लेषण किया जाना चाहिए । electroporation में, और अधिक संस्थापक मछली का विश्लेषण किया है जो लागत में वृद्धि होगी की जरूरत है । हालांकि, चैनल कैटफ़िश microinjected भ्रूण के अस्तित्व electroporated लोगों से कम है, हालांकि इस अधिक भ्रूण31इंजेक्शन से दूर किया जा सकता है,३२। चैनल कैटफ़िश में, जर्दी के अस्तित्व-microinjected भ्रूण 16 से ५५% से लेकर, निशाना बनाया जा रहा जीन पर निरभर है और gRNA/Cas9 प्रोटीन की खुराक३२।

कैटफ़िश भ्रूण की नियमित microinjection तकनीकी रूप से मांग और समय लगता है, तथापि, एक तेजी से और कुशल CRISPR/Cas9 प्रोटीन microinjection प्रोटोकॉल चैनल कैटफ़िश भ्रूण के लिए प्रस्तुत किया है । इस प्रोटोकॉल CRISPR/Cas9 प्रोटीन समाधान के बाद से कम समय और विशेषज्ञता की आवश्यकता है एक सेल भ्रूण की जर्दी में इंजेक्शन है । निषेचित अंडे के सैकड़ों 1 घंटे में इंजेक्शन किया जा सकता है (लगभग समय पहले कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक हो) । प्रोटोकॉल को मांय करने के लिए, दो रोग संवेदनशीलता से संबंधित जीन चैनल कैटफ़िश, टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन एडाप्टर अणु (TICAM1) जीन और rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन (RBL) जीन युक्त में खटखटाया गया । TICAM 1 संकेत मार्ग टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) 3 द्वारा शुरू में शामिल है । चैनल कैटफ़िश में, TICAM 1 नाटकीय रूप से Edwardsiella ictaluriके साथ बैक्टीरिया की चुनौती के बाद विनियमित था, जबकि यह नीले downregulated में कैटफ़िश था, एक प्रजातियों के लिए प्रतिरोधी ई. ictaluri३३। RBL के साथ जल्दी संक्रमण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है Flavobacterium columnare, columnaris रोग के प्रेरणा का एजेंट, जहां तीव्र और मजबूत विनियमन एक columnaris-अतिसंवेदनशील चैनल कैटफ़िश तनाव में दर्ज की गई एक की तुलना में columnaris प्रतिरोधी तनाव३४।

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Protocol

यह प्रयोग मछली आनुवंशिकी अनुसंधान इकाई, ई. डब्ल्यू शैल मत्स्य अनुसंधान केंद्र, Auburn विश्वविद्यालय, अल में आयोजित किया गया । प्रयोग शुरू करने से पहले इस प्रयोग में प्रयुक्त सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल Auburn विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (AU-IACUC) द्वारा अनुमोदित किए गए थे । उपकरण और इस प्रयोग में प्रयुक्त आपूर्ति की एक सूची सामग्री तालिका में पाया जा सकता है । निंनलिखित कदम और तैयार करने के लिए प्रक्रियाओं और चैनल कैटफ़िश एक सेल भ्रूण के microinjection के रूप में चित्रा 1में सचित्र हैं ।

1. चिंता स्टॉक चयन और अंडे

  1. तनाव या ब्याज की आनुवंशिक रेखा से स्वस्थ चैनल कैटफ़िश चिंता शेयर चुनें । चैनल कैटफ़िश पुरुषों और महिलाओं अच्छा माध्यमिक सेक्स विशेषताओं का प्रदर्शन करना चाहिए ।
  2. चुनें पुरुषों कि एक व्यापक मांसल सिर है कि अच्छी तरह से विकसित जननांग papilla के साथ अपने शरीर के बाकी की तुलना में व्यापक है । क्षेत्रीय लड़ाई से गहरे रंग, जख्म और घाव भी यौन तत्परता के संकेत हैं । महिलाओं है कि सिर है कि उनके शरीर के बाकी की तुलना में संकरा है का चयन करें, और नरम, स्पष्ट, अच्छी तरह गोल पेट है । सटीकता के लिए और प्रारंभिक हैंडलिंग के दौरान मछली पर जोर देने से बचने के लिए, महिलाओं को 2-3 दिनों के लिए अपनी तत्परता की जांच करने से पहले खिलाना बंद करो ।
  3. मछली हैंडलिंग जल्दी से, लेकिन ध्यान से प्रदर्शन । हैंडलिंग तनाव को कम करने के लिए, सभी प्रक्रियाओं है कि महिलाओं को संभालने की आवश्यकता होती है जबकि बैग (३२ mm आकार मेष) अंडे में मछली पकड़ प्रदर्शन करते हैं ।
  4. बस हार्मोन इंजेक्शन से पहले ovulation प्रेरित करने के लिए, महिलाओं के शरीर के वजन को मापने ।
  5. लगातार पानी के प्रवाह और पर्याप्त वातन के साथ टैंक के माध्यम से एक प्रवाह में अंदर महिलाओं के साथ अंडे बैग लटका ।
  6. Aseptically, ८५ µ जी के साथ एक 14 ग्राम सुई है कि आरोपण लोड/luteinizing हार्मोन रिलीज हार्मोन एनालॉग (LHRHa) प्रत्यारोपण के. इंजेक्शन साइट कुल्ला (पृष्ठीय पेशियां) ०.९% के साथ इंजेक्शन से पहले बाँझ खारा समाधान. एक ४५ ° कोण पर आरोपण डालें और प्रत्यारोपण जारी । सुई वापस लेने और स्वाइप एक कपास पहले ७०% इथेनॉल में लथपथ गेंद के साथ इंजेक्शन साइट ।
  7. जोत के टैंक में अंडे वाली थैली रखें ताकि पानी की सतह से नीचे 15-20 सेमी पानी में मछली पूरी तरह जलमग्न हो जाए । पर्याप्त वातन (5 पीपीएम से ऊपर ऑक्सीजन भंग) और अच्छे पानी की गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता वाले अंडे के ovulation के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
  8. डिग्री-घंटे (एच) संबंध३५का उपयोग कर पानी के तापमान के आधार पर ovulation समय की भविष्यवाणी । डिग्री-एच रिस्पांस टाइम = हार्मोन इंजेक्शन और ovulation (एच) * पानी के तापमान (डिग्री सेल्सियस) के बीच समय । उदाहरण के लिए, 900-1000 के एक डिग्री-एच रिस्पांस टाइम के लिए, एक महिला को 25 डिग्री सेल्सियस पर हार्मोन इंजेक्शन समय से 36-40 ज में अंडे की उम्मीद है । आमतौर पर, अंडे के लिए पहली जांच के बारे में ३६ एच में हार्मोन इंजेक्शन के बाद और फिर 4 एच अंतराल पर किया जाता है ।
  9. ovulation के लिए जांच करने के लिए, धीरे पानी की सतह के ऊपर पैदा बैग उठा, जबकि आप अंडे कि पैदा बैग के अंदर संलग्न है के लिए देख रहे हैं । इस महिला को देखने से कम 10 अंडे इंगित करता है कि ovulation और हाथ अलग करना के लिए तैयार है ।

2. शुक्राणु तैयारी

नोट: शुक्राणु की उंमीद ovulation समय से पहले कुछ एच तैयार किया जा सकता है ।

  1. संज्ञाहरण के बिना सिर को एक टकराता झटका से Euthanize नर, संज्ञाहरण के बाद से शुक्राणु गतिशीलता पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है ।
  2. एक छोटा सा वजन में परीक्षण ले लीजिए, किसी भी ऊतक को हटाने, और उंहें ०.९% खारा के ५० मिलीलीटर के साथ धोने के लिए रक्त निकालने के लिए, यदि आवश्यक हो । अच्छी तरह से विकसित परीक्षण कई villiform अनुमानों ( चित्रा 2) के साथ सफेद होते हैं ।
  3. परीक्षण के वजन का निर्धारण ।
  4. अंडा निषेचन के लिए शुक्राणु समाधान तैयार करने के लिए, एक १०० cm2 १०० µm संदंश का उपयोग जाल के केंद्र के लिए tests हस्तांतरण । अंदर testes के साथ जाल गुना, testes कुचलने और एक ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में शुक्राणु फिल्टर । इस दबाव को लागू करने के लिए अंगूठे के माध्यम से संग्रह ट्यूब के रिम के खिलाफ जाल के अंदर परीक्षण किया जा सकता है । संग्रह ट्यूब में मेष से शुक्राणु धोने के लिए ०.९% खारा समाधान का उपयोग करें । खारा समाधान 10 मिलीलीटर के लिए जोड़ा जा सकता है/
  5. शुक्राणु की एकाग्रता का निर्धारण, गतिशीलता और व्यवहार्यता की जांच करें ।
    नोट: एकाग्रता एक hemocytometer का उपयोग milt के एक ज्ञात पतला मात्रा में शुक्राणु कोशिकाओं की गिनती द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, शुक्राणु घनत्व एक spectrophotometer का उपयोग कर milt के ऑप्टिकल घनत्व का मूल्यांकन द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है । इस विधि में, ५०५ एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण एक नियंत्रण चार्ट है कि पहले शुक्राणु३६के विभिंन सांद्रता के अवशोषण के लिए तैयार किया गया है की तुलना में है । शुक्राणु गतिशीलता शुक्राणु के सक्रियकरण से समय के रूप में माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जा सकती है जब तक शुक्राणु आंदोलन की समाप्ति (कहा जाता गतिशीलता अवधि)३७। शुक्राणु की व्यवहार्यता trypan नीले रंग के रूप में चयनात्मक रंगों के साथ शुक्राणु धुंधला द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जो केवल गैर-व्यवहार्य शुक्राणु कोशिकाओं दाग होगा, जबकि व्यवहार्य शुक्राणु दाग रहेगा । हालांकि, इन microinjection प्रक्रियाओं के लिए, यह आवश्यक नहीं है यदि tests अच्छी तरह से विकसित कर रहे हैं ।
  6. ०.९% खारा में 4 डिग्री सेल्सियस पर २.५ कदम से शुक्राणु की दुकान और तैयारी के बाद 24 घंटे के भीतर का उपयोग करें ।

3. अंडा संग्रह और निषेचन

  1. सब्जी की एक बहुत पतली परत एक 20 सेमी व्यास साफ सूखी अंडे पैन को छोटा करें ।
  2. संवेदनाहारी में मादा प्लेस बफर tricaine के १०० पीपीएम युक्त मीथेन sulfonate सोडियम बिकारबोनिट के साथ (अंतिम समाधान के पीएच ७.० होना चाहिए) जब तक मछली पूरी तरह से anesthetized है३८।
    चेतावनी: Tricaine मीथेन sulfonate परेशान हो सकता है अगर सांस, घूस या त्वचा के माध्यम से अवशोषित ।
  3. ध्यान से, अंडे की थैली से मछली निकालें और संवेदनाहारी समाधान को धोने के लिए ०.९% खारा में डुबकी । मछली सूखी पूरी तरह से एक साफ तौलिया का उपयोग कर, मछली शरीर की सतह पर बलगम परत को हटाने से परहेज ।
  4. लागू सब्जी छोटा करने के आसपास के क्षेत्र के लिए वेंट, श्रोणि पंख सहित, हाथ से अलग करना के दौरान अंडे की कुर्की को रोकने के लिए ।
  5. हाथ अंडाशय के लिए कोमल दबाव लागू करने से चिकना अंडे पैन में अंडे पट्टी । अच्छा अंडे स्वतंत्र रूप से प्रवाह करना चाहिए, रंग में सुनहरा पीला हो, और कम या कोई झुरमुट या रक्त के थक्के (चित्रा 2) है । निषेचन से पहले अंडे और पानी के बीच संपर्क से बचें, के रूप में पानी micropyle बंद करने को उत्तेजित कर सकते हैं ।
  6. microinjection के लिए अंडे खाद, हस्तांतरण 200-300 अंडे एक चिकना अंडे पैन करने के लिए । तेल प्लास्टिक संयंत्र लेबल एक चंमच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए अंडे का हस्तांतरण करने के लिए तेल अंडे पैन । 1 जोड़ें-शुक्राणु समाधान के 2 मिलीलीटर (२.५ कदम से) अंडे के लिए और धीरे मिश्रण । अंडे के लिए शुक्राणु का अनुपात लगभग ११,००० शुक्राणु/
  7. अंडे के लिए मीठे पानी जोड़ें शुक्राणु और अंडे को सक्रिय करने के लिए । थोड़ा अंडे को कवर करने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें । धीरे 30 एस निषेचन के लिए अंडे भंवर 1 में होने चाहिए-2 मिनट । यह अंडे जो एक ही परत में व्यवस्था कर रहे है खाद के लिए महत्वपूर्ण है । कैटफ़िश अंडे एक दूसरे को यह मुश्किल भ्रूण के कई परतों microinject बनाने के लिए पालन करना ।
  8. निषेचित अंडे के लिए और अधिक मीठे पानी जोड़ें और अंडे 10-15 मिनट के लिए कठोर करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  9. अंडे एक गीले तौलिया से बचे हुए निषेचित अंडे युक्त पैन को सुखाने और कुछ ही घंटों में खाद को रोकने के कवर । निषेचन एक चौंका देने वाला तरीके से किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, 200 के एक बैच-300 अंडे हर 30 निषेचित किया जा सकता है-60 मिनट के लिए एक सेल स्टेज पर भ्रूण की एक सतत आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए microinjection और नियंत्रण गैर इंजेक्शन भ्रूण । गीले तौलिया और अंडे के रूप में अंडे गीला तौलिया का पालन कर सकते है यह मुश्किल उंहें हटाने के लिए बनाने के बीच संपर्क से बचें । इस प्रोटोकॉल में, 2 के भीतर निषेचित अंडे-3 एच अलग करना कुशलता से microinjected के बाद और अंडे के रूप में तुरंत अलग करने के बाद निषेचित के रूप में इसी तरह की सफलता थी ।

4. सुई खींच और लोड हो रहा है

  1. 2 सुइयों में एक १.० मिमी आयुध डिपो borosilicate ग्लास केशिका खींचो (चित्रा 3). स्पंज के एक टुकड़े के साथ एक कागज बॉक्स में सुई की दुकान जिसमें कई चीरा बनाया गया है । सुई तोड़ने से बचने के लिए, स्पंज का व्यास सुई स्टेम की लंबाई की तुलना में छोटा होना चाहिए ।
  2. एक तेज वस्तु का उपयोग कर सुई के पतले क्षेत्र का एक छोटा सा टुकड़ा तोड़ने के द्वारा सुई टिप खोलें । वैकल्पिक रूप से, खुर्दबीन के नीचे संदंश के साथ टिप के पतले क्षेत्र चुटकी से सुई खुला ।
  3. Cas9 प्रोटीन के साथ gRNA (s) मिश्रण से इंजेक्शन समाधान तैयार करें । आरएनए या प्रोटीन के अन्य प्रकार भी एक ही प्रक्रिया के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, gRNAs चैनल कैटफ़िश प्रतिरक्षा संबंधित जीन, टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन एडाप्टर अणु (TICAM1) जीन और rhamnose बंधन लेक्टिन (RBL) जीन युक्त और शाह एट अलके अनुसार तैयार के दो लक्ष्य के लिए डिजाइन किए गए थे । एक उच्च निष्ठा Taq पोलीमरेज़३२,३९के उपयोग के साथ । gRNAs के लिए जीनोमिक लक्ष्य 5 ' GGA GGT गाा जीसीए CGT CGA GGA 3 ' के लिए TICAM 1 जीन (चित्रा 4) और 5 ' GGA CTT TGA गोरखा प्रशिक्षण केंद्र GGA गाा GTG जी 3 ' के लिए एक्सॉन जीन RBL के साथ 1 आसंन आकृति (पाम) अनुक्रम रेखांकित (चित्रा 6) ।
    1. ब्लास्ट गाइड आरएनए चैनल कैटफ़िश जीनोम अनुक्रम के खिलाफ लक्ष्य और कोई संभावित बंद लक्ष्य साइटों के साथ उन का चयन करें ।
    2. phenol लाल रंग में जोड़ें gRNA/Cas9 प्रोटीन कुल मात्रा का एक तिहाई तक मिश्रण ।
    3. nuclease मुफ्त पानी के साथ gRNA/Cas9 प्रोटीन मिश्रण के अंतिम एकाग्रता को समायोजित करें ताकि प्रत्येक भ्रूण ५० लगभग २.५ एनजी gRNA और ७.५ एनजी Cas9 प्रोटीन युक्त nL के साथ इंजेक्शन है । उपयोग करने से पहले बर्फ पर 10 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन ।
  4. एक microloader के साथ, सुई स्टेम में microloader डालने और microloader टिप (चित्रा 3) मुकर जबकि धीरे मिश्रण को निष्कासित करके इंजेक्शन सुई में gRNA/Cas9 मिश्रण के 5-10 µ l लोड. अंदर हवा के बुलबुले फँसाने से बचें.
  5. सुई micropipette धारक को देते हैं और एक तंग कनेक्शन सुनिश्चित करते हैं, और फिर micromanipulator के लिए धारक देते हैं । मुक्त स्थिर आंदोलन सुनिश्चित करें । नाइट्रोजन सिलेंडर खोलकर और दबाव नियामक को एडजस्ट करके microinjection के लिए दबाव लागू करें ।
    नोट: इंजेक्शन की मात्रा दबाव, सुई एपर्चर के व्यास, और इंजेक्शन की अवधि से प्रभावित किया जा सकता है । को इंजेक्शन के लिए मात्रा का निर्धारण, एक hemocytometer पर रखा खनिज तेल की एक बूंद में सुई । यदि आवश्यक हो, दबाव, इंजेक्शन की अवधि, और सुई व्यास को बढ़ाने या इंजेक्शन की मात्रा में कमी करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । लगातार मात्रा सुनिश्चित करने के लिए खनिज तेल में कई बार सुई ।

5. कैटफ़िश भ्रूण का Microinjection

  1. एक १०० mm साफ पेट्री डिश को छोटा सब्जी की एक बहुत पतली परत लागू करें ।
  2. एक तेल प्लास्टिक संयंत्र लेबल का उपयोग करना, 50 हस्तांतरण-निषेचन से 100 अंडे पेट्री पकवान के लिए पैन और उंहें Holtfreter समाधान (सामग्री तालिका) के साथ कवर किया । एक ही परत में एक दूसरे के खिलाफ अंडे संरेखित करें । इस संरेखण microinjection प्रक्रिया के दौरान जगह में अंडे रखना चाहिए ।
  3. पेट्री डिश को अंडे के साथ माइक्रोस्कोप की स्टेज पर रखें और एक हाथ से इसे पकड़ लें । दूसरे हाथ (चित्रा 3) के साथ सुई कम जब तक यह एक चिकनी आंदोलन में चोरियों और जर्दी छेदने । सुई की नोक इंजेक्शन सामग्री देने से पहले blastodisc के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में होना चाहिए ।
    1. दबाना की जर्दी में इंजेक्शन सामग्री वितरित करने के लिए पेडल । यदि blastodisc स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देता है, तो इंजेक्शन सामग्री की जर्दी में विभिन्न स्थानों में फैलाया जा सकता है । ऐसा करने के लिए, सुई की जर्दी के अंत तक डाला जाता है, तो पेडल निराशाजनक और सुई वापस लेने के लिए एक साथ किया जाता है के लिए जर्दी के विभिंन क्षेत्रों के माध्यम से इंजेक्शन सामग्री फैल । अप करने के लिए ५० nanoliters चैनल कैटफ़िश भ्रूण की जर्दी में इंजेक्ट किया जा सकता है, तथापि, gRNA/Cas9 प्रोटीन की मात्रा के लिए प्रत्येक जीन उत्परिवर्तन दर और भ्रूण अस्तित्व के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित करने की जरूरत है३२।
  4. सुई को सुचारू रूप से वापस लें ताकि अंडे को नुकसान न हो । एक ही प्रक्रिया के साथ एक और अंडा इंजेक्षन करने के लिए पेट्री डिश हटो । इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान पेट्री डिश के आंदोलन से बचने के रूप में यह अंडा नुकसान या सुई तोड़ सकते हैं । microinjection के कारण टूटना या क्षतिग्रस्त अंडे निकालें । इंजेक्शन 15 में शुरू किया जा सकता है-निषेचन के बाद 20 मिनट और जब तक भ्रूण के रूप में एक सेल स्टेज में अभी भी जारी है (निषेचन के बाद के बारे में 60-90 मिनट तक) ।
  5. जगह doxycycline और 6 के लिए सतत कोमल वातन के 10 पीपीएम के साथ Holtfreter समाधान में वापस भ्रूण इंजेक्शन-7 दिन तक सेने४०तक । दैनिक समाधान बदलें और मृत भ्रूण को हटा दें ।

6. उत्परिवर्तन का पता लगाने

  1. बेतरतीब ढंग से, ७२ ज पद निषेचन में कई इंजेक्शन भ्रूण इकट्ठा, जर्दी हटाने और जीनोमिक डीएनए निकालें । शामिल 3-5 गैर एक नियंत्रण के रूप में भ्रूण इंजेक्शन ।
    नोट: जीनोमिक डीएनए अंडे के गोले और जर्दी सामग्री को हटाने के बाद proteinase कश्मीर पाचन और इथेनॉल वर्षण३२का उपयोग कर भ्रूण से निकाला जा सकता है ।
  2. एक डीएनए एक जीन है, जहां उत्परिवर्तनों होने की उंमीद कर रहे है के gRNA के लिए जीनोमिक लक्ष्य पार्श्व खंड बढ़ाना, एक उच्च निष्ठा Taq पोलीमरेज़३२का उपयोग कर । TICAM के लिए 1, प्राइमरी 5 ' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3 ' (फॉरवर्ड) और 5 ' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3 ' (रिवर्स) के लिए एक ७५० बीपी बढ़ाना इस्तेमाल किया गया जबकि RBL के लिए, प्राइमर्स 5 ' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3 ' (फॉरवर्ड) और 5 ' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3 ' (रिवर्स) का इस्तेमाल किया गया RBL जीन से ३७५ बीपी सेगमेंट को बढ़ाना ।
    1. निम्नलिखित पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करें: अप करने के लिए 20 µ एल पीसीआर ग्रेड पानी; 1x उच्च निष्ठा Taq एंजाइम प्रतिक्रिया बफर के साथ MgCl2, ०.२ mM dNTP मिश्रण, ०.४ µ m आगे और रिवर्स प्राइमर के एक ही सेट के लिए, 100-300 एनजी जीनोमिक डीएनए और उच्च निष्ठा Taq एंजाइम मिश्रण के १.२५ इकाइयों । पीसीआर साइकलिंग शर्तें निष्पादित करें: प्रारंभिक विकार 3 मिनट के लिए ९४ ° c पर; विकार के ३५ चक्र के लिए ९४ ° c पर 30 s, एनीलिंग के लिए ६० ° c पर ५५ s TICAM के लिए, और ४० s for RBL, विस्तार पर ७२ ° c 1 min/kb के लिए; और 10 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार ।
  3. ऐसे शुद्ध पीसीआर उत्पादों के अनुक्रमण के रूप में एक उत्परिवर्तन का पता लगाने विधि का उपयोग कर उत्परिवर्ती भ्रूण का पता लगाने, सर्वेयर उत्परिवर्तन जांच परख, heteroduplex गतिशीलता परख, प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइट के नुकसान, या किसी भी अन्य उत्परिवर्तन का पता लगाने विधि है कि लक्ष्य के लिए उपयुक्त । इस प्रोटोकॉल में, उत्परिवर्ती भ्रूण TICAM 1 और प्रतिबंध एंजाइम सापि कटौती साइट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से RBL जीन के लिए शुद्ध पीसीआर उत्पादों के अनुक्रमण के नुकसान के लिए सर्वेयर उत्परिवर्तन जांच परख का उपयोग का पता लगाने ।
  4. उत्परिवर्ती alleles, क्लोन पीसीआर उत्पादों और अनुक्रम व्यक्तिगत कालोनियों से वैक्टर की पहचान करने के लिए । उत्परिवर्ती alleles में प्रस्तुत चित्रा 4 और चित्रा 6 इंजेक्शन भ्रूण से आया था । पीसीआर उत्पादों से छह microinjected और 3 नियंत्रण भ्रूण प्रत्येक जीन के लिए दो अलग ट्यूबों, microinjected भ्रूण और नियंत्रण के लिए अंय भ्रूण के लिए एक, तेजी से क्लोन और ८६ वैक्टर TICAM 1 के लिए और ४८ वैक्टर के लिए एक में परित थे RBL जीन अनुक्रम, सहित 8 प्रत्येक जीन के लिए 3 नियंत्रण गैर इंजेक्शन भ्रूण से अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं ।
  5. विभिन्न उत्परिवर्ती alleles की पहचान करने के लिए, इस तरह के विस्फोट या टी कॉफी के रूप में किसी भी डीएनए अनुक्रम संरेखण उपकरण का उपयोग कर जंगली प्रकार के अनुक्रम के उत्परिवर्ती भ्रूण से दृश्यों की तुलना करें ।

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Representative Results

microinjection प्रोटोकॉल की दक्षता को प्रदर्शित करने के लिए, gRNAs चैनल कैटफ़िश टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन युक्त अनुकूलक अणु (TICAM1) जीन और rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन (RBL) जीन microinjected थे लक्ष्य के लिए डिज़ाइन किया गया ।

TICAM १
वैक्टर के डीएनए sequencing से अलग कॉलोनियों से परित, क्लोन पीसीआर उत्पादों TICAM 1 जीन में प्रेरित indel उत्परिवर्तनों का पता चला । उत्परिवर्तन दर 24 व्यक्तियों में ७९% का विश्लेषण किया गया । उत्परिवर्तनों के उदाहरण चित्रा 4 और चित्रा 5में सचित्र हैं । TICAM1 जीन में indel उत्परिवर्तनों के प्रभाव चैनल कैटफ़िश की भविष्यवाणी की प्रोटीन की लंबाई और अनुक्रम पर जंगली प्रकार अनुक्रम की तुलना में तालिका 1में सचित्र हैं । विलोपन उत्परिवर्तनों की भविष्यवाणी की प्रोटीन से कई अमीनो एसिड के लिए कुछ को हटाने के परिणामस्वरूप, बहाव पढ़ने के फ्रेम को बदलने के लिए अग्रणी है और समय से पहले अनुवाद समाप्त (तालिका 1) ।

ज्यादातर मामलों में, भविष्यवाणी की प्रोटीन अनुक्रम के ८०% से अधिक एक समय से पहले बंद codon के कारण काट दिया गया था । इन मामलों में, अनुमानित पॉलीपेप्टाइड लंबाई ९१ से लेकर १०६ एमिनो एसिड अवशेषों (जंगली प्रकार TICAM 1 है ५२० एमिनो एसिड अवशेषों) । अत्यंत छोटा प्रोटीन के साथ उत्परिवर्तनों के लिए एक गैर कार्यात्मक प्रोटीन उत्पादन की उंमीद कर रहे हैं । ८७ बीपी विलोपन उत्परिवर्तन (तालिका 2, चित्रा 4) के मामले में, 29 अमीनो एसिड रीडिंग फ्रेम को बदले बिना प्रोटीन से निकाले गए । इस तरह के उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक परिणामों के लिए प्रयोग करने की आवश्यकता का मूल्यांकन किया है ।

rbl
वैक्टर के डीएनए sequencing से अलग कॉलोनियों से परित, क्लोन पीसीआर उत्पादों indel उत्परिवर्तनों (चित्रा 6) की उपस्थिति की पुष्टि की । उत्परिवर्तन दर ४० व्यक्तियों में ८८% का विश्लेषण किया गया । विलोपन से लेकर 5 बीपी तक १८३ बीपी, जबकि 20 तक बीपी डाला गया । दिलचस्प है, १८३ बीपी विलोपन पूरी तरह से हटा दिया intron 1, एक्सॉन 2, और 19 बीपी intron 2 से । सैद्धांतिक रूप से, इस ब्याह साइटों के बाद से RBL जीन के ब्याह प्रभावित होना चाहिए रूपांतरित हो गया है ।

Indel उत्परिवर्तनों की भविष्यवाणी की प्रोटीन अनुक्रम पर चर प्रभाव पड़ा जब जंगली प्रकार के प्रोटीन अनुक्रम की तुलना में (३०८ एमिनो एसिड अवशेषों) (तालिका 2) । indels के ७०% से अधिक एक भविष्यवाणी कटा हुआ प्रोटीन है कि 10% या जंगली प्रकार के प्रोटीन की लंबाई से कम है के परिणामस्वरूप । कुछ indels में (उत्परिवर्तन संख्या 4, 5, और 6), भविष्यवाणी की पॉलीपेप्टाइड से कम था 10 अमीनो एसिड । केवल 2 मामलों (संख्या 2 और 3) 2 और 4 पढ़ने के फ्रेम जो या प्रोटीन समारोह को प्रभावित नहीं कर सकते है बदलने के बिना भविष्यवाणी की प्रोटीन में एमिनो एसिड के विलोपन के परिणामस्वरूप ।

द्वि-allelic उत्परिवर्तनों दो अंय gRNAs (Elaswad एट अल., अप्रकाशित) जहां दोनों गुणसूत्रों कुछ भ्रूण में रूपांतरित हो गए थे और कोई जंगली प्रकार alleles का पता लगाया गया के साथ प्रेरित किया गया । पीसीआर उत्पादों की जेल ट्रो के साथ, इन भ्रूण जंगली प्रकार बैंड (अधिक से अधिक २०० बीपी विलोपन) से कम था कि केवल एक बैंड था । क्लोन पीसीआर उत्पादों के डीएनए अनुक्रमण सभी वैक्टर एक भ्रूण से अनुक्रम में केवल एक उत्परिवर्ती एलील की उपस्थिति (homozygous biallelic उत्परिवर्तन) की पुष्टि की है जबकि दो उत्परिवर्ती alleles अंय भ्रूण (heterozygous biallelic उत्परिवर्तन) में हुई । कुछ अंय भ्रूण है कि उत्परिवर्तन के लिए मोज़ेक थे में, दोनों उत्परिवर्ती (अप करने के लिए 4 alleles) और जंगली प्रकार alleles क्लोन पीसीआर उत्पादों की डीएनए अनुक्रमण द्वारा पता लगाया गया ।

Figure 1
चित्र 1 : एक सेल चैनल कैटफ़िश के लिए microinjection प्रक्रियाओं का सारांश (Ictalurus punctatus) gRNA/Cas9 प्रोटीन के साथ भ्रूण बाहर दस्तक करने के लिए टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन-एडाप्टर अणु युक्त (TICAM1) जीन और rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन (RBL) जीन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : टेस्ट और चैनल कैटफ़िश के अंडे, Ictalurus punctatus . (क) चैनल कैटफ़िश पुरुषों के अच्छी तरह से विकसित परीक्षण कई villiform अनुमानों के साथ सफेद होते हैं. (ख) चैनल कैटफ़िश महिलाओं से अच्छे अंडे कम या कोई रक्त के थक्के के साथ रंग में सुनहरा पीला कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : Microneedle पुलिंग, लोड हो रहा है और microinjection के एक सेल चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus , भ्रूण । (क) सुई एक ऊर्ध्वाधर सुई खींचने के साथ खींच । सुई संरचना और व्यास हीटर रेशा और solenoid बल की गर्मी से प्रभावित कर रहे हैं । (ख) Microneedle CRISPR/Cas9 मिश्रण के साथ एक microloader टिप का उपयोग कर लोड हो रहा है । (ग) एक १०० मिमी पेट्री Holtfreter समाधान युक्त पकवान में चैनल कैटफ़िश भ्रूण की व्यवस्था । Microneedle जब तक यह छू लेती है और अंडा छेदना कम है । (घ) पैनल सी अंडे भेदी की प्रक्रिया को दिखाने के अनुभाग बढ़ाया । नोट सुई टिप chorionic झिल्ली आवक जोर दे रहा है लेकिन यह अभी तक प्रवेश नहीं किया है । इंजेक्शन भ्रूण के अंदर लाल इंजेक्शन सामग्री है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : CRISPR/Cas9 से प्रेरित उत्परिवर्तनों में टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन-एडाप्टर अणु (TICAM1) चैनल कैटफ़िश के जीन कोडिंग अनुक्रम युक्त, Ictalurus punctatus . नीले अनुक्रम protospacer आसंन आकृति (पाम) का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि हरी अनुक्रम gRNA के लिए लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है । डबल किनारा Cas9 प्रोटीन द्वारा प्रेरित तोड़ 2 लाल त्रिकोण के स्थल पर होने की उंमीद थी । उत्परिवर्तनों संख्या 8 के माध्यम से 1 सौंपा जाता है । हटाने उत्परिवर्तनों एक डैश्ड रेखा है जिसमें प्रत्येक डैश हटा दिया गया है एक न्यूक्लियोटाइड करने के लिए संगत द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । लाल अनुक्रम सम्मिलन हैं, जबकि बैंगनी प्रतिस्थापन उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है । ७८ के अंशों ७८ अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं (उदा., 3/78 का अर्थ है कि एक एलील ७८ प्रतिक्रियाओं की कुल से 3 अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं में पाया गया था) में रूप से रूपांतरित alleles की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : चैनल कैटफ़िश में Indel उत्परिवर्तनों, Ictalurus punctatus , टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन-अनुकूलक अणु युक्त (TICAM1) जीन कोडन gRNA/Cas9 प्रोटीन के चैनल कैटफ़िश एक सेल भ्रूण के रूप में डीएनए अनुक्रमण वर्णलेख द्वारा प्रगट में microinjection द्वारा प्रेरित अनुक्रम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : CRISPR/Cas9 rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन में उत्परिवर्तनों प्रेरित (RBL) चैनल कैटफ़िश के जीन, Ictalurus punctatus . Exonic अनुक्रम अपरकेस होते हैं, जबकि intronic अनुक्रम लोअरकेस अक्षर होते हैं । नीले अनुक्रम protospacer आसंन आकृति (पाम) का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि हरी अनुक्रम gRNA के लिए लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है । एक डबल किनारा Cas9 प्रोटीन द्वारा प्रेरित तोड़ 2 लाल त्रिकोण के स्थल पर होने की उंमीद थी । उत्परिवर्तनों संख्या 1 से 9 के माध्यम से सौंपा जाता है । हटाने उत्परिवर्तनों एक डैश्ड रेखा है जिसमें प्रत्येक डैश हटा दिया गया है एक न्यूक्लियोटाइड करने के लिए संगत द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । लाल अनुक्रम सम्मिलन हैं । ४० के अंशों का प्रतिनिधित्व ४० sequencing प्रतिक्रियाओं में रूप में alleles की संख्या 2/40 का अर्थ है कि एक एलील 2 sequencing प्रतिक्रियाओं में ४० प्रतिक्रियाओं की कुल से पाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

उत्परिवर्तन लन हटाने शुद्ध परिवर्तन (Δ) प्रोटीन की लंबाई (एमिनो एसिड) Frameshift बदली असमय रोक codon अनुमानित प्रोटीन अनुक्रम
wt 0 0 0 ५२० नहीं नहीं MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: np_ 001187154.1
1 0 5 -5 १०४ हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 ४० -३५ ९४ हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 ८७ -८७ ४९१ नहीं हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
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YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
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QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 १३१ -१२८ ९५ हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 १०६ हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 १०६ हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 १०० हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 ३५ 9 26 ९१ हाँ हाँ MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

तालिका 1: टोल में indel उत्परिवर्तनों के प्रभाव/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन-अनुकूलक अणु युक्त (TICAM1) चैनल कैटफ़िश के जीन कोडिंग अनुक्रम, Ictalurus punctatus, पर भविष्यवाणी की प्रोटीन लंबाई (अमीनो एसिड) और अनुक्रम की तुलना में जंगली प्रकार अनुक्रम (WT).

उत्परिवर्तन लन हटाने शुद्ध परिवर्तन (Δ) प्रोटीन की लंबाई (एमिनो एसिड) Frameshift बदली असमय रोक codon अनुमानित प्रोटीन अनुक्रम
wt 0 0 0 ३०८ नहीं नहीं MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: ahj 14694.1) ५३
1 0 5 -5 29 हाँ हाँ MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 ३०६ नहीं नहीं MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 ३०४ नहीं नहीं MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 हाँ हाँ MMLFLN
5 0 १८३ -१८३ 8 नहीं हाँ MMLFLKRI (संभालने ब्याह बदल नहीं है)
6 1 १८३ -१८२ 5 हाँ हाँ MMLFL (संभालने ब्याह बदल नहीं है)
7 1 0 1 31 हाँ हाँ MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 हाँ हाँ MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 हाँ हाँ MMLFLKASSHISSSASSP

तालिका 2: rhamnose बंधन लेक्टिन (RBL) में indel उत्परिवर्तनों के प्रभाव जीन चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, पर अनुमानित प्रोटीन की लंबाई (अमीनो एसिड) और अनुक्रम जंगली प्रकार अनुक्रम (WT) की तुलना में.

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Discussion

चैनल कैटफ़िश भ्रूण की microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल जीन नॉकआउट प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत किया गया था । CRISPR/Cas9 के इंजेक्शन की जर्दी में प्रोटीन बहुत आसान है, समय बचाता है, और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है जब microinjecting की तुलना में एक सेल भ्रूण है, जो सबसे जीन हस्तांतरण और मछली के साथ जीन संपादन के लिए आम तकनीक है के blastodisc 30 , ४२. वर्तमान प्रोटोकॉल चैनल कैटफ़िश TICAM 1 और RBL जीन में indels उत्प्रेरण में सफल साबित हुआ । इन विश्वसनीय और प्रभावी प्रक्रियाओं चैनल कैटफ़िश में भविष्य जीन नॉकआउट पैदा करने के लिए नींव रखना । प्रोटोकॉल CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग कर चैनल कैटफ़िश जीनोम में अंय जीनों को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, या ऐसे tol2 मध्यस्थता transgenesis के रूप में कैटफ़िश, के लिए अंय जीन प्रौद्योगिकियों के अनुकूल । यह भी अंय कैटफ़िश प्रजातियों में मूल्यांकन के लायक है जैसे ब्लू कैटफ़िश (furcatus), जो व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण है और उनके अंडे चैनल कैटफ़िश अंडे से निपटने के लिए और अधिक संवेदनशील होने लगते हैं । हालांकि, अगर अंय gRNAs या जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों जैसे डीएनए या mRNA के रूप में इंजेक्ट किया जा करने के लिए कर रहे हैं, प्रोटोकॉल के लिए सबसे अच्छा शर्तों का निर्धारण अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

मछली भ्रूण के microinjection के लिए प्रोटोकॉल में, microinjection प्रक्रियाओं दो मुख्य श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: भ्रूण कोशिकाओं और इंजेक्शन की जर्दी में इंजेक्शन । medaka में, morpholinos एक सेल भ्रूण के कोशिका में vivo४१में विभिंन विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इंजेक्शन थे । चैनल कैटफ़िश में, CRISPR/Cas9 GnRH जीन लक्ष्यीकरण mRNA एक सेल भ्रूण के microinjected में blastodisc थे30। थ्री-स्पिन्ड stickleback (Gasterosteus aculeatus) में blastomeres microinjected और जीन पीटकर४२उत्पन्न करने transgenics थे. दूसरी ओर, एक सेल zebrafish भ्रूण की जर्दी थे morpholinos के साथ इंजेक्शन के लिए ग्लास (एचईजी) के प्रोटीन दिल में हेरफेर है, जो४३प्रभावी साबित हुआ । दृष्टिकोण के इन 2 प्रकार के अपने फायदे और नुकसान है, लेकिन अगर दोनों को एक ही प्रजाति के लिए एक ही प्रभाव साबित होता है, एक सेल भ्रूण की जर्दी microinjection कई कारणों के लिए पसंद किया जाएगा ।

जर्दी microinjection भ्रूण के लिए कम इनवेसिव है, क्योंकि microinjection सुई भ्रूण कोशिकाओं पियर्स नहीं है । इसके अलावा, कई भ्रूण एक छोटी अवधि में इंजेक्शन किया जा सकता है, जबकि भ्रूण पहले सेल स्टेज पर अभी भी कर रहे हैं । एक निश्चित स्थिति में भ्रूण को संरेखित करने की जरूरत नहीं है । यह भी समय की बचत और भ्रूण के हैंडलिंग तनाव को कम करेगा । मौसम में मछली के अंडे में, वहां एक सीमित समय जिसमें सभी प्रक्रियाओं को सफल नॉकआउट प्राप्त करने की आवश्यकता है पैदा कर रहा है । चैनल कैटफ़िश में, के बारे में 2 महीने४४के लिए अंडे का मौसम रहता है । इसलिए, एक तेजी से और प्रभावी microinjection प्रोटोकॉल का विकास कई भ्रूण के microinjection इस छोटे समय अवधि में कई जीनों को लक्षित करने की अनुमति देगा । सौभाग्य से, चैनल कैटफ़िश कृत्रिम रूप से microinjection के लिए भ्रूण की एक महान पर्याप्त संख्या microinjection प्रक्रियाओं के कारण उच्च मृत्यु दर को दूर करने की आपूर्ति पैदा कर सकते हैं४५। इसके अलावा, निषेचन के समय भ्रूण को सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित किया जा सकता है एक सेल चरण में जब जरूरत है ।

zebrafish, अटलांटिक सामन (Salmo सालार L.), नील tilapia (Oreochromis niloticus), नाडी कैटफ़िश, अटलांटिक killifish (Fundulus heteroclitus) सहित विभिन्न मछली प्रजातियों में CRISPR/Cas9 प्रेरित indels का Microinjection ४६, और आम काप5,30,४६,४७,४८,४९,५०. इसके अलावा, CRISPR/Cas9 प्रणाली को मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से Labeo rohita कार्प में जीन को बाधित करने के लिए लक्षित जीन५१में विदेशी डीएनए की मध्यस्थता प्रविष्टि इस्तेमाल किया गया था । इस प्रोटोकॉल में, सफल indels की भविष्यवाणी की प्रोटीन अनुक्रम पर नाटकीय प्रभाव के साथ कोडिंग अनुक्रम में प्रेरित किया गया, frameshift उत्परिवर्तनों समयपूर्व बंद codon में जिसके परिणामस्वरूप सहित । इन उत्परिवर्तनों के phenotypic प्रभाव अभी भी जांच की जरूरत है । कटा हुआ mRNAs सबसे अधिक संभावना बकवास-मध्यस्थता mRNA क्षय (एनएमडी) मार्ग, कमी या अभिव्यक्ति की बाधा में जिसके परिणामस्वरूप के माध्यम से नीचा दिखा रहे हैं, और अगर व्यक्त, कटा हुआ प्रोटीन की संभावना गैर-कार्यात्मक हो जाएगा५२,५३ .

RBL जीन के साथ हमारे प्रयोग में, उत्परिवर्तनों के दो प्रकार (संख्या 5 और 6) १८३ बीपी को हटाने के परिणामस्वरूप पूरी तरह से एक्सॉन 1, intron 1, एक्सॉन 2, और 2 के भाग के आधे हटाने । सैद्धांतिक रूप से, उत्परिवर्तन के इस प्रकार के RBL पूर्व mRNA के ब्याह बदल सकते हैं । ब्याह साइटों पर उत्परिवर्तनों spliceosome की क्षमता को बाधित करने के लिए एक्सॉन५४पहचान ।

अंत में, चैनल कैटफ़िश में लक्षित जीन संपादन के लिए एक विश्वसनीय कुशल प्रोटोकॉल के विकास कार्यात्मक जीनोमिक्स का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जीनोमिक संसाधनों चैनल के हाल ही में अनुक्रमण के साथ समृद्ध किया गया है के बाद कैटफ़िश जीनोम. यहां वर्णित प्रक्रियाओं सरल, तेजी से लेकिन कुशल है और सफलतापूर्वक जीन नॉकआउट प्राप्त करने के लिए सिद्ध कर रहे हैं । दो जीन, TICAM 1 और RBL, CRISPR/Cas9 पीटकर microinjection का उपयोग करने की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए लक्षित किया गया । क्या इंजेक्शन किया जा रहा है के आधार पर, प्रोटोकॉल अन्य जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यह भी अंय कैटफ़िश प्रजातियों या अंय मछली प्रजातियों कि समान अंडा संरचना और संरचना है microinject के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल चैनल कैटफ़िश में जीन नॉकआउट के लिए नींव रखना ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

यह शोध USDA-निफा ने रोजर शंकु को 2015-67015-23488 पुरस्कार से वित्त पोषित किया गया । लेखक डॉ रोनाल्ड Phelps चिंता वीडियो में शेयर चयन मानदंड के विवरण के लिए धंयवाद । अहमद Elaswad और करीम खलील अपने पीएच. डी. अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए वाशिंगटन डीसी में मिस्र के सांस्कृतिक और शैक्षिक ब्यूरो का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

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आनुवंशिकी अंक १३१ CRISPR/Cas9 जीन संपादन जीन नॉकआउट microinjection चैनल कैटफ़िश भ्रूण उत्परिवर्तन कटा हुआ प्रोटीन indels
Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, <em>Ictalurus punctatus</em>, जीन संपादन के लिए भ्रूण
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Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

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