Summary
Detta manuskript beskriver en murina calvarial osteolys modell av exponering för CoCrMo partiklar, som utgör en idealisk djurmodell för att bedöma samspelet mellan slitage partiklar och olika celler i aseptisk lossnande.
Abstract
Slitage partikel-inducerad osteolys är en viktig orsak till aseptisk lossnande artroplastik misslyckande, men den underliggande mekanismen oklar. På grund av långa uppföljningar krävs för identifiering och sporadisk förekomst, det svårt för att bedöma den patogenes ofparticle-inducerad osteolys i kliniska fall. Därför krävs optimal djurmodeller för fortsatta studier. Murina modellen av calvarial osteolys fastställts av exponering för CoCrMo partiklar är ett effektivt och giltigt verktyg för att bedöma samspelet mellan partiklar och olika celler i aseptisk lossnande. I denna modell, CoCrMo partiklar först erhålls genom hög-vakuum tre-elektrod likström och resuspended i fosfatbuffrad saltlösning vid en koncentration på 50 mg/mL. Sedan, 50 µL av den resulterande suspensionen tillämpades till mitten av de murina calvaria efter separation av kraniala periostet av vassa dissektion. Efter två veckor, mössen offrades och calvaria exemplar hade skördats, kvalitativa och kvantitativa utvärderingar utfördes av hematoxylin och eosin färgning och micro datortomografi. Styrkan i denna modell inkluderar förfarandet enkelhet, kvantitativa utvärderingen av benförlust, snabbhet av osteolys utveckling, potentiella användning transgena eller knockout modeller och en relativt låg kostnad. Denna modell kan emellertid inte för att användas för att bedöma mekanisk kraft och kroniska effekter av partiklar i aseptisk lossnande. Murina calvarial osteolys modell genereras av exponering för CoCrMo partiklar är ett idealiskt verktyg för att bedöma samspelet mellan slitage partiklar och olika celler, t.ex., makrofager, fibroblaster, osteoblaster och osteoklaster, aseptisk att lossa.
Introduction
Aseptiska lossnande är den vanligaste orsaken av total höftartroplastik (THA) och total knäledsplastik artroplastik (TKA) misslyckande, som kräver revision kirurgi1. Den underliggande mekanismen förblir dock oklart2. En lång uppföljning krävs för att upptäcka partikel-inducerad osteolys, vars förekomst är sällsynt; därför det svårt för att utforska dess patogenes i kliniska fall. Därför kräver ytterligare studier fokuserar på komplexa cellulära och vävnad mekanismer båda in-vivo -experiment i bär partikel-inducerad osteolys modeller och in vitro- analyser i celler relaterade till homeostas3. En giltig djurmodell är viktigt i avslöjar effekterna av slitage partiklar på benförlust, tillhandahålla bevis för ytterligare cellulära analyser.
Murina calvarial osteolys modell konstruerad av exponering för CoCrMo partiklar är en effektiv och giltig metod för att bedöma samspelet mellan partiklar och olika celler i aseptisk lossnande. I denna modell orsaka CoCrMo partiklar calvarial osteolys av inducerande inflammatoriska cytokiner i makrofager, aktiverar osteoklasterna, hämma osteoblast spridning och främja osteoblast apoptos.
Det tar bara två veckor att upprätta denna modell. Osteolys kan visualiseras och kvantifieras i hematoxylin och eosin (H & E) färgning och micro beräknade datortomografi (mikro-CT)2. Denna modell har dessutom en relativt låg kostnad, och transgena och knockout mus modeller kan användas att screena ett stort antal föreningar på olika doser3.
Förfarandet för att upprätta och utvärdera denna modell är enkel. Först var CoCrMo partiklar erhålls genom hög-vakuum tre-elektrod likström och resuspended i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid en koncentration på 50 mg/mL. Sedan, 50 µL av den resulterande suspensionen tillämpades till mitten av de murina calvaria efter separation av kraniala periostet av vassa dissektion. Mössen offrades efter två veckor, och calvaria prover hade skördats, kvalitativa och kvantitativa analyser utfördes av H & E färgning andmicro-CT.
Murina calvarial osteolys modell konstruerad av exponering för CoCrMo partiklar är ett idealiskt verktyg för att bedöma samspelet mellan olika celler, makrofager, fibroblaster, osteoblaster, och osteoklaster, aseptisk att lossa och CoCrMo partiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Nanjing universitet.
1. CoCrMo partikel förberedelse
- Skaffa CoCrMo partiklar med hjälp av en fabricerade hög-vakuum tre-elektrod likström4. Placera CoCrMo legering i instrumentet under 10-3 Pa vakuum, 0,04 MPa argon och väte 3:2 (v/v) och 650 A katoden nuvarande.
- Mät lesionernas diameter av CoCrMo partiklar.
- Tillsätt 1 mg av CoCrMo partiklar i 1,5 mL vattenfri etanol.
- Återsuspendera CoCrMo partiklar i vattenfri etanol genom ultraljud skakas vid 28 kHz och 600 W för 5 min.
- Applicera en droppe (ca 20 µL) av den resulterande suspensionen på objektiva bordet av ett transmissionselektronmikroskop (TEM). Fånga serie TEM bilder på 200 kV acceleration spänning och 0.24 nm upplösning.
- Använda den medföljande programvaran för att beräkna genomsnittlig diameter och partikel storlek distribution i TEM micrographs.
- Sanera endotoxiner
- Autoklav 50 g av partiklar under 15 minuter vid 121 ° C och 15 psi.
- Upptäcka endotoxiner av ett kvantitativt Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-test (< 0,25% EU/mL anses indikera endotoxin frånvaro)5.
- Återsuspendera partiklarna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid en koncentration på 50 mg/mL stamlösning6.
2. konstruktion av Calvarial osteolys modell
- Söva 6 veckor gamla C57BL/J6 möss (sex möss per grupp) withpentobarbital (50 mg/kg). Använda nypa testet för att bedöma nivån på anestesi. Förhindra uttorkning av ögon med fysiologisk koksaltlösning.
- Placera möss i liggande position. Ta bort pälsen på kraniet med en rakapparat och desinfektera huden med hjälp av medicinsk bomullstussar som innehåller 75% etanol.
- För punkt lokalisering, identifiera två punkter, inklusive mittpunkterna mellan två ögon och öron, respektive. Sedan bestämma gränsen mellan två ovanstående punkter och incisionsfilm huden längs raden ovan med sax (figur 1A).
- Ta bort kraniala periostet från calvaria med en skalpell (figur 1B)6.
- Suturera huden i båda ändar med enkel avbrutna sutur.
- Gör en sutur linje genom mitten av snittet utan knotting. Håll de båda ändarna av suturlinjen.
- Bädda in 50 µL av CoCrMo partikel fjädring (50 mg/mL i PBS) mitt i den calvarias (figur 1 c)2.
- Knut den sista stygnet inom enkla avbrutna suturen (figur 1 d).
- Upprätthålla möss i ytterligare 2 veckor.
3. utvärdering av Calvarial osteolys modell av mikro-datortomografi
- Offra möss med koldioxid. Halshugga möss i horisontalplanet. Ta bort hjärnvävnaden inuti, och hud och päls utanför. Skörda calvarias för ytterligare experiment.
- Försiktigt klara upp alla mjukdelar på calvaria med pincett. Fixa de rensade calvarias i 4% PARAFORMALDEHYD vid 4 ° C under 24 h. Sänk calvarias i PBS 24 h innan mikro-CT scanning.
- Analysera möss calvarias genom högupplösta mikro-CT på en isometrisk upplösning 18 µm och X-ray energi inställningar av 45 kV och 550 mA.
- Genomföra tredimensionella rekonstruktionen av mikro-CT data med programvaran.
- Kvalitativ och kvantitativ analys.
- Välj först fyrkantiga regionen runt mittlinjen suturen som område av intresse.
- För det andra, mäta bentäthet (BMD), ben volym/total volym (BV/TV), trabekulära nummer (Tb.N), trabekulära tjocklek (Tb.Th), trabekulära separation/avstånd (Tb.Sp) och andel av totala porositet med den medföljande programvaran för mikro-CT.
- För det tredje, jämföra de tre grupperna för olika mätningar av envägs ANOVA. För post hoc-analys av variancen, applicera den Bonferroni metod2.
4. utvärdering av Calvarial osteolys modell av H & E färgning
- Om avkalkning calvaria prover i 15% etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-PBS vid 4 ° C. Ändra den urkalkning lösningen varje dag i 3 veckor.
- Bädda in urkalkade proverna i paraffin för en 2 x 1 cm x 1 cm kub och skär dem i 2 µm sektioner i området av partikel nedfall.
- Fläcken avsnitten med hematoxylin och eosin som tidigare beskrivits7.
- Fånga micrographs av den totala pathomorphism av ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Egen producerade nanoskala CoCrMo partiklarna var runt 50 nm (standardfel 3.56) i diameter, som kvantifieras i TEM (figur 2). Efter exponering av musen calvarias att CoCrMo partiklar, djuren (n = 6 per grupp) bibehölls i ytterligare två veckor. Calvarial snittet var helt läkt inom två veckor, och suturen kan falla. Någon lokal infektion eller avsaknad av hopläkning kan påverka ben förlust bedömning. Efter musen offer skördades calvaria prover. Sedan alla mjukdelar försiktigt var uppklarat och mikro-CT har använts för att kvantifiera benförlust. Från både tredimensionell rekonstruktion bilder och representativa koronalt fotografier på tvärsnitt observerades betydande benförlust hos möss som behandlats med CoCrMo partiklar (figur 3). Bone mineral density (BMD), ben volym/total volym (BV/TV), trabekulära nummer (Tb.N) och trabekulära tjocklek (Tb.Th) betydligt, medan totala porositet och trabekulära separation/avstånd (Tb.Sp) ökades betydligt i CoCrMo gruppen jämfört med kontroll- och sham drift grupper (figur 4). Student t-test användes för att bedöma skillnader mellan grupper och p < 0.05 ansågs statistiskt signifikant. Övrigt bekräftat H & E färgning av calvaria sektioner benförlust hos möss som behandlats med CoCrMo partiklar (figur 5).
Figur 1 : Schematisk av partikel-inducerad osteolys (PIO) musmodell. Till vänster visar musen position i modellering. (A) punkt lokalisering. Fastställ mittpunkterna mellan två ögon och öron, respektive, och incisionsfilm huden längs linjen mellan dem. (B) exponera och ta bort kraniala periostet från calvaria. (C) bädda in CoCrMo partikel fjädring i mitten calvaria. (D) suturera huden i enkla avbrutna suturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Överföring elektronmikroskopi skanning av CoCrMo partiklar. (A) representativa överföring elektronmikroskopi bilder av CoCrMo partiklar. (B) partikelstorleksfördelning av CoCrMo partiklar kvantifierades med programvaran. Varje stapel representerar frekvens normaliserade till det totala antalet partiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Micro-CT analys med 3-dimensionell rekonstruktion av prover från kontroll möss och de behandlade med PBS (sham drift) och CoCrMo partiklar. Den vita vågräta linjen anger placeringen av tvärsnitt bilden. Den vita pilen anger benförlust i gruppen CoCrMo implantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kvantitativ analys av mikro-CT-bilder efter tredimensionell rekonstruktion. Kvantifiering av bone mineral density (BMD) (A), volym/total benvolym (BV/TV) (B), andel av totala porositet (C), trabekulära nummer (Tb.N) (D), trabekulära tjocklek (Tb.Th) (E), och trabekulärt separation/avstånd (Tb.Sp) (F), i mean±standard fel. Student t-test användes för att bedöma skillnader mellan grupperna, med p < 0,05 anses statistiskt signifikant. **, P < 0,01; , P < 0,001. n = 6 möss per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa bilder av H & E färgning av calvaria prover (10 ×) från kontroll möss och de behandlas med PBS (sham drift) och CoCrMo partikel. Röd pil anger osteolys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två huvudsakliga metoder för slitage partikel-inducerad osteolys i möss: den air-påse och calvarial osteolys modellen. I air-fodral modell upprättas en subkutant genererade luft-påse först, följt av slitage partikel introduktion och implantation i den ben vävnad8. Väggens påse härmar periostet aseptisk att lossa. Ben implantation är dock nonvascular med ingen biologisk aktivitet, vilket gör det svårt att bedöma direkta interaktioner mellan partiklarna och benvävnaden. Calvarial osteolys modellen har flera fördelar jämfört med luft-påse motstyckena. Först, slitage partiklar är direkt utsatta för de calvaria, gör det möjligt att bedöma samspelet mellan slitage partiklar och ben homeostas, inklusive benresorption och osteoblast, osteoclast och makrofag aktiviteter9,10 . Andra är kvantitativa mätningar av benförlust tillgängliga, så att bedömningen av olika potentiella genetiska tillvägagångssätt och biologiska agenser i ben förlust förebyggande11. För det tredje är det möjligt att bedöma förhållandet mellan slitage partiklar och benförlust i olika genetiska bakgrunder, inklusive transgena och gen knockout möss12,13. För det fjärde, den kan användas att screena ett stort antal föreningar med olika doser. Men framgången av traditionalcalvarial osteolys modellen är relativt låg och använda ben histomorphometry för att mäta osteolys gör resultaten mindre mål1.
För att förbättra andelen framgångsrika modellen och återge resultaten mer objektiva, har flera ändringar gjorts. Först användes nanoskala partiklar att förbättra samspelet mellan calvaria och bära partiklar. Faktiskt, samspelet mellan nanoskala partiklar och calvaria förstärks jämfört med kommersiellt legering partiklar, med en genomsnittlig diameter av 1,5 µm14,15. För det andra var ett 1,0 cm2 område på calvaria avgränsad för att uppnå adekvat exponering av calvaria. För det tredje, mikro-CT och tredimensionell rekonstruktion har använts för att kvantifiera benförlust.
I området i närheten finns det flera begränsningar i den nuvarande modellen. Första, mikro-CT utrustning för möss är inte allmänt tillgängliga för forskare och tekniker krävs för skanning och tredimensionell rekonstruktion. För det andra, de CoCrMo nanopartiklar används i den nuvarande modellen är inte kommersiellt tillgängliga, och sin produktion beroende av stöd från materialvetenskap tekniker. För det tredje, denna modell representerar inte kroniska effekter av partiklar på benmassa och saknar icke-biologiska faktorer relaterade till osteolys, såsom oscillerande vätsketrycket eller mekaniska krafter. Effekten av modellen skulle kunna öka betydligt med hjälp av nanoskala partiklar och tillräckligt exponering av calvaria. Benförlust kan kvantifieras, och mer objektiva data som erhållits med mikro-CT.
Murina calvarial osteolys modell fastställts av exponering för CoCrMo partiklar är ett idealiskt verktyg för att bedöma samspelet mellan CoCrMo partiklar och olika celler makrofager, fibroblaster, osteoblaster och osteoklaster aseptisk att lossa. Dessutom kan en rad mediciner testas av deras effekter på aseptisk lossa med hjälp av denna modell.
Det finns många kritiska steg i proceduren. Först är tillämpningen av CoCrMo nanopartiklar med en genomsnittlig diameter av 50 nm. För det andra, adekvat exponering av calvaria uppnåddes. En 1,0 cm2 -området på calvaria var nog i denna modell, och periostet på calvaria bör vara dissekeras noggrant och fullständigt. En tydlig dissekering av periostet intensifierar interaktioner mellan partiklar och calvaria. För det tredje, en kvantitativ mätning av benförlust av mikro-CT är möjligt. Kvantitativa mätningar av benförlust från tre dimensionell rekonstruktion, såsom BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp och andel av totala porositet, göra det lättare att skilja ben förlust skillnader i olika behandlingar och ge solida bevis för osteolys jämfört med den traditionella ben histomorphometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (81572111), klinisk vetenskap och teknik projekt Foundation i Jiangsu-provinsen (BL2012002), den vetenskapliga forskning projekt i Nanjing (201402007), den naturliga vetenskapen Foundation i Jiangsu-provinsen (BK20161385), och speciella Foundation av kinesiska läkare Association (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
