Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Metabolsk støtte forbrukeravgift, levende hjernen vev under magnetisk resonans mikroskopi oppkjøpet

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56282
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 2,3,5, 1,2,6
1Department of Neuroscience, University of Florida, 2McKnight Brain Institute, University of Florida, 3Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 4Center for Functionally Integrative Neuroscience, Aarhus University, 5Department of Radiology, University of Florida, 6National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University

Summary

Gjeldende protokollen beskriver en metode som brukere kan opprettholde levedyktigheten til akutt hippocampus og kortikale skive forberedelser under innsamling av magnetisk resonans mikroskopi data.

Abstract

Denne protokollen beskriver fremgangsmåtene må støtte normal metabolske funksjoner akutt hjernen stykke forberedelser i samlingen av magnetisk resonans (MR) mikroskopi data. Mens det er mulig å utføre MR samlinger på levende, forbrukeravgift pattedyr vev, slike eksperimenter har tradisjonelt vært begrenset av oppløsningen grensene og er dermed i stand til å visualisere vev mikrostruktur. Omvendt, MR protokoller som oppnå mikroskopiske bildeoppløsning krevde bruk av fast prøver å imøtekomme behovet for statisk, uforanderlig forhold over lengre skanning. Gjeldende protokollen beskriver den første tilgjengelige MR teknikken som gjør bildebehandling av levende, pattedyr mikroskopiske oppløsning. Slike data er av stor betydning for forståelsen av hvordan patologi-baserte kontrast på mikroskopisk nivå påvirkning innholdet i makroskopisk MR skanner som brukes i klinikken. Når slik forståelse er realisert, diagnostiske metoder med større følsomhet og nøyaktighet kan bli utviklet, som direkte til tidligere behandling, mer nøyaktig terapi overvåking og bedre pasientens utfall.

Mens beskrevet metodikken fokuserer på hjernen stykke forberedelser, er protokollen tilpasningsdyktig til alle forbrukeravgift vev slice gitt at endringer i gass- og perfusate forberedelsene til vevets metabolske behov. Vellykket gjennomføring av protokollen skal resultere i levende, akutt skive preparater som viser MR diffusjon signal stabilitet i perioder opptil 15.5 h. Den primære fordeler av dagens system over andre MR kompatibel perfusjon apparatene er kompatibilitet med MR mikroskopi maskinvare kreves for å oppnå høyere oppløsning og evne til å gi konstant, uavbrutt flyt med nøye regulert perfusate forhold. Redusert utvalg ytelse er en vurdering med dette motivet som eneste vev slice kan avbildes samtidig.

Introduction

Som magnetisk resonans imaging (MRI) systemer har stadig kommet til stadig høyere feltstyrken, har mer informasjon om sammensetningen og status av levende vev blitt synlig. Til tross for slike maskinvare fremskritt er MR imaging oppløsning tilstrekkelig til å visualisere cellular strukturer av vev fortsatt ikke tilgjengelig i klinikken. Resultatet må mobilnettet nivå kjennetegner vev utledes når innholdet i klinisk skanninger. Slike slutning krever kunnskap om tilsvarende prosesser sanket fra data i modellsystemer som kan observeres direkte. Tradisjonelt har inkludert disse modellene celler fra vannlevende organismer som Xenopus laevis oocyte og Aplysia californica L7 neuron1,2. Disse var blant de første dyreceller tilgjengelig for observasjon MR metoder på grunn av unormalt store størrelse: ca 1000 μm og 300 μm diameter, henholdsvis. Nylig fremskritt i maskinvaredesign har tillatt for en av de største eksemplene på pattedyrceller-α-motoriske nervecellen, til å bli avbildet med MR mikroskopi teknikker på fast vev3,4. Mens disse studiene viste direkte visualisering av pattedyr mobilnettet materiale ved hjelp av MR, fast prøvene ansatt varierer betydelig i MR egenskapene fra levende vev og dermed tjene ikke som en tilsvarende representant modell5, 6. Enda viktigere, krever observere MR kontrast endringene som skjer i konsert med komplekse biologiske prosesser levende eksempler som kan være opprørt og målt i løpet av tenkelig eksperimentet.

For å lette MR mikroskopi studier på levende vev, presenteres en protokoll som inkluderer kommersielle microimaging maskinvare7 tilkobles en spesialbygd, MR kompatibel, i-fødte oxygenator og perfusjon enheten beskrevet tidligere8 . Unike fordeler av denne design inkluderer funksjoner mobilnettet nivå problemløsning i pattedyr vev og nøyaktig kontroll over oppløst gass innhold og pH på stedet av vevsperfusjon. Også i motsetning til fleste explant MR studier som forstyrre perfusjon under bildeopptak å unngå flyt gjenstander, støtter dette design bruk av kontinuerlig perfusjon under datainnsamlingen som har vist seg å forbedre fysiologisk tilstand isolerte vev9,10. Endelig sin lukket opptak kammer og skive-oppbevaring maskinvare bistand i å redusere sannsynligheten for bevegelse gjenstander som ellers kan oppstå under langvarig bildesamlingen.

Mens gjeldende protokollen beskriver fremgangsmåter hensiktsmessig for bruk med akutt hippocampus og kortikale skiver, gjør nøyaktig kontroll over perfusate metabolitter dette systemet til et bredt utvalg av ulike vev og eksperimentelle forhold. Begrensninger av denne utformingen omfatter en reduksjon i utvalg ytelse sammenlignet med et multi del perfusjon kammer11; men kan denne begrensningen bli overvunnet i fremtiden bruke flere coil matriser.

Også mens beskrevet systemet kan brukes i både vannrette eller loddrette konfigurasjoner, har gjeldende protokollen sin bruk i en loddrett orientert, 600 MHz spectrometer. Ethvert system som kan MR microimaging studier-vanligvis smal-bar (≤6 cm), høy-feltet (≥500 MHz) spektrometre, passer til oxygenator og perfusjon utstyret beskrevet. Imidlertid kan endringer tenkelig spolen, gradering, sonde systemet eller annen viktig tenkelig maskinvare ansatt nødvendiggjøre endringer perfusjon utstyret og MR skanneparametere.

Protocol

alle dyreforsøk beskrevet følger retningslinjene i National Academies for ' Guide og bruk av forsøksdyr og blir gjennomgått og godkjent av University of Florida ' s Institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC). Følg alle gjeldende regler og forskrifter ved dyr emne forskning.

1. forberedelse av Perfusate for vedlikehold av sentralnervesystemet vev

  1. gjør frisk kunstig cerebrospinalvæske (aCSF).
    1. å generere 2 L av bikarbonat-bufret aCSF perfusate, måle ut 1 500 mL vann renset ved destillasjon eller omvendt osmose dobbelt i en 4 L kolbe. Plasser en magnetic røre bar i flasken og rist væsken ved hjelp av en røre plate.
    2. i renset vannet, løses følgende antall salter: 14.03 g (120 mM) natriumklorid, 4,37 g (26 mM) natriumbikarbonat, 0.41 g (1,5 mM) monobasic kalium fosfat, 0,69 g (1,4 mM) magnesium sulfat heptahydrate, kalsium 0.59 g (2 mM) klorid dihydrate 0,45 g (3 mM) kalium klorid og 3,6 g (10 mM) glukose.
      Merk: Kjemiske innholdet i perfusate vil variere avhengig av bestemte metabolsk krav fra vevet og ønsket forhold av eksperimentet.
    3. Bland denne løsningen godt til alle salter har oppløst. Justere volumet til 2 L bruker renset vann.
    4. Test osmolality av aCSF med en frysepunktet depresjon osmometer. Justere til 300 mOsm/kg med sorbitol. Tillegg av 324 mg sorbitol til 2 L 299 mOsm/kg aCSF perfusate vil øke osmolality til 300 mOsm/kg (ca 1 mOsm per 324mg).
      Merk: ACSF kan lagres på 4 ° C i en lufttett, forseglet flaske for en periode ikke å overskride 24 h.

2. Sette opp the perfusjon System

  1. forberede aCSF-perfusate.
    1. Likevekt aCSF til romtemperatur (~ 23 ° C) mens gassing med 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2, 1/16 L/min) via direkte bobler for ikke mindre enn 1 h.
      Merk: Ulike vev typer eller ønsket eksperimentelle forhold krever justering av perfusate temperatur eller gass innholdet. Ønsket forhold for oppløst gass innhold i perfusate kan kontrolleres nøyaktig ved å variere prosent konsentrasjonen av enkeltkomponenter levere gass ( figur 1).
    2. Når aCSF når ønsket temperatur og carbogen metning, bekrefte at pH er i området fysiologiske (7.3-7.4). Fortsette å boble gass direkte i perfusate reservoaret (1/16 L/min) i løpet av eksperimentet for å opprettholde riktig oppløst oksygen innhold og pH forhold til sunt vev metabolisme.
  2. Prime perfusjon linjene.
    1. Submerge røret innløpet koblet til peristaltiske mikro-pumpen i forberedt aCSF (300 mOsm, pH 7.3-7.4, kontinuerlig gasset).
    2. Pass på oxygenator enhet ( figur 2) og perfusjon linjer gjennom både magneten bar og gradient coil stable (topp til bunn) og spoler til side til sonde montering. Henge oxygenator over et beger å fange noen aCSF avløpsvann.
      Merk: Avhengig av systemutformingen MRI perfusjon linjer må sendes gjennom magnet bar og gradient spoler eller sonde kroppen base før grunning systemet med aCSF. Bekrefte perfusjon linje plasseringen ikke vil forstyrre montering av sonden kroppen eller innsetting av sonden bar før du starter prosedyren grunning.
    3. Bekrefter tiltenkte flow rate (2 mL/min) er valgt og begynne å fylle perfusjon linjene ved å slå på pumpen.
    4. Inverter tom, innebygd boble fellen slik at aCSF vil fortrenge luften inneholdt.
    5. Koble til oxygenator ' s gass port til en annen kilde til carbogen (en manifold eller en sekundær carbogen sylinder) og angi en strømningshastighet på 1 / 16L/min.
    6. Bekrefter at carbogen er flyter over oxygenator ' s gassutveksling membran av dipping eksos porten på oxygenator inn vann.
    7. Når aCSF er oppdaget drypper fra perfusjon kammeret, tømme alle synlige gassboblene fra tilsig linjene av manuell agitasjon.
    8. Bekrefter at oxygenator fungerer riktig ved submerging oksygen elektroden i aCSF strømmer fra perfusjon kammeret.
      Merk: Lesing på oksygen meter bør omtrentlig prosentandelen av oksygen i medfølgende gassen.

3. Vev forberedelse

  1. Euthanasia
    1. sted en rotten (125-150 g) i induksjon kammeret av anestesi maskin og utsett til 4% isoflurane i en oksygen operatør gass med en hastighet på 1 L/min for 4 min.
    2. Fjerne bevisstløs rotta fra anestesi kammeret.
    3. Utfører en rettende refleks test ved å plassere rotta i supine posisjon. Sjekk for eventuelle bevegelser — hodet snu, Ben løfting, ryggraden bøye, etc. — indikativ som dyret dreier på sin mage.
    4. Utfører en øye-blink refleksiv test ved å berøre det åpne øyet av dyret med en bomullspinne. Se etter svar — lokk nedleggelse, muskelrykninger, etc. — til denne sanseinntrykk.
    5. Endelig, utføre en lem-trekke refleks test ved pinching huden imellom toes av rotte ' s utstrakt tilbake bein pinsetter eller hemostats. Når på refleksjoner av leg.
      Merk: Hvis et positivt refleksiv testresultat, ikke Fortsett med euthanasia.
    6. Som noen av de tre refleks testene utløser en reaksjon, returnere rotta umiddelbart til anestesi kammeret og gi rom for en ekstra 2 min eksponering for 4% isoflurane.
    7. Utføre alle tre refleksiv tester over i sin helhet. Gjenta 2 min anestesi eksponering som nødvendig og bare fortsette når en fullstendig mangel på respons på alle tre refleksiv tester har blitt observert.
    8. Euthanize rotta via giljotinen halshogging.
  2. Hjernen resection
    1. fjerne rotte hjernen av brutto disseksjon. Start med hodet i liggende stilling. Bruke saks, rostrally skjære gjennom huden fra baksiden av halsen til nesen og utsette skallen.
    2. Fjerne myke vev fra overflaten av skallen med en stump sonde.
    3. Arbeider fra caudal slutten, fjerne tilpassing, parietal og frontale Ben av kraniet bruker rongeurs.
    4. Trekke dura ved å klippe langs langsgående rennen med mikro saks og peeling tilbake laget fra begge halvkuler.
    5. Fjerne hjernen fra skallen ved å snu hodet til supine posisjon og kuttet Hjernenerve på ventral side.
  3. Stykke isolasjon
    1. tilbake hjernen til liggende stilling og isolere den sentrale delen som inneholder hippocampus ved å fjerne alle vev caudal å tverrgående rennen og rostral til fimbria. Gjøre to kutt langs tverrgående flyet (i.e. koronale skiver) med en rettkantede barberhøvel.
    2. Påføre hjernen ' s caudal mest flyet til midten av vibratome kutte badekar med cyanoacrylate lim.
    3. Legge til iskalde, carbogen boblet aCSF å vibratome kutte badekaret og plassere nylon oppbevaring maskinvaren inni.
    4. Kutte 300 μm tykke skiver å få 3 til 4 brukbare skive forberedelser per halvkule (6 til 8 totalt).
    5. Isolere en hippocampus eller kortikale delen fra en halvkule og trim sektoren slik at den passer til microcoil ' s 5 mm diameter vev godt.

4. Positioning og perfusjon System montering

  1. Coil forberedelse
    1. Fyll microcoil ' s vev kammer med oksygenrikt aCSF fra vibratome ' s kutte bad med en overføring pipette.
    2. Ta trimmet hjernen prøven og posisjon i regionen rundt (f.eks. pyramideformet celle lag) over microcoil bruker en dissecting omfang.
    3. Sett vev oppbevaring enheten (nylon maske netto festet til nylon skive) beholde prøveposisjon gjennom tenkelig eksperimentet.
      Merk: Gå raskt gjennom prøven posisjonering fremgangsmåten for å redusere eksponering for intens lys. Gi mer oksygenrikt aCSF etter behov ved hjelp av en overføring pipette.
  2. Montering i-fødte oxygenator, microcoil og sonde
    1. sikre samlingen modifisert microcoil ( Figur 3) i en tabell klemme og fester i-fødte oxygenator enheten ved å sette inn den acetal støtte pinne inn i hullet på spolen.
    2. Forsegle perfusjon systemet ved å plassere perfusjon kammeret over microcoil ' s vev godt og cinching de to sammen med en miniatyr kabelstrips.
    3. Trim overflødig lengden fra kabel-tie med wire cutters.
      Merk: Ved vellykket forseglet, perfusate bør overholdes spennende gjennom ut linjene og uten lekkasje bør være tydelig rundt silikon segl perfusjon kammeret. Unnlatelse i å bekrefte disse forholdene før sonde montering kan resultere i alvorlige skader i imaging maskinvare.
    4. Når aCSF kan sees dryppende i avfall reservoaret, ta microcoil og oxygenator og knytte samlingen til toppen av tenkelig sonde kroppen.
    5. Gli gradient stabelen over samlingen og sete stigningsgrad på toppen av sonden. Fotografier detaljering relativ plassering og riktig tilkobling av coil, oxygenator og probe maskinvarekomponenter tilbys ( Figur 4).

5. Utføre MR bildesamlingen

  1. sette inn sammensatte sonde inn magneten bar
    1. sted sonde kroppen i nærheten av spectrometer bar åpningen nederst på magneten.
    2. Trekke overflødig lengden av perfusjon linjer gjennom bar åpning på toppen av magneten.
    3. Når alle tilgjengelig slakk er tatt fra perfusjon linjene, forhånd sonde kroppen i magnet bar i bunnen stund samtidig fjerner mer slakk fra perfusjon linjene fra toppen av bar.
    4. Tråd to festeskruene på undersiden av sonde inn i sine tilsvarende spor i mellomlaget stabelen.
    5. Før du fortsetter, kontroller at perfusjon linjer ikke klem eller knekt under sonde innsetting av bekrefter aCSF utløp i avfall reservoaret.
      Merk: Unnlatelse i å bekrefte perfusate utløp kan føre til permanent skade til perfusjon linjer og risiko katastrofal skade på MR imaging maskinvare.
    6. i tilfelle ingen perfusate er sett avslutter returledningen i avfall reservoaret Fjern sonde kroppen og bekrefte at perfusate flyt har gjenopptatt før gjeninnsette. Et skjematisk oppsett av sammensatte perfusjon systemet og bildebehandling spectrometer har vært beskrevet tidligere 8.
  2. Koble Probe kroppen
    1. feste tilsig og utløp vann linjene fra gradient chiller.
    2. Slå på pumpen for gradient chiller og Bekreft innstillingen for vann temperatur (19 ° C).
    3. Fest luftslangen fra luften chiller enheten til sonde kroppen med en slange klemme.
    4. Slå strømmen knotten på luften chiller enheten til " 1 " posisjon.
    5. Knytter thermocouple wire til selve sonde.
    6. Fest koaksialkabelen fra preamp til radiofrekvens (RF) inndata/utdata på sonde kroppen ' s proton (H) kanal.
    7. Fest strømkabelen fra gradient forsterkere til selve sonde.
    8. Inne det RF skap, slå på strømmen til B0 kompensasjon enhet, alle tre gradient forsterkere (x, y, z), og den overordnede enheten
  3. Forbereder Spectrometer
    1. sette den tiltenkte bar temperaturen bruke modulen variabel temperaturkontroll justering på konsollen.
    2. Matche (impedans) og tune (frekvens) RF krets ved å justere variabel kondensatorer i sonden. Dette oppnås ved å manipulere wands ved foten av selve sonde.
    3. Juster gjeldende innstillinger for spectrometer ' s shim spoler å maksimere magnetfelt homogenitet på prøven.
  4. Begynne bildesamlingen
    1. samle pilot bilder å finne romlige plasseringen av prøve innen magneten bar. Typisk parametere for en to dimensjonal gradient ekko er som følger (TR/TE = 100/4 ms, gjennomsnitt = 1, puls vinkel = 30 o, tid = 6 sek, matrise = 64 x 64, synsfelt = 0.3 x 0,3 cm, oppløsning = 47 x 47 μm).
    2. Samle diffusion-vektet piloter for å bekrefte riktig skanning geometri og vev posisjon hvis aktuelt. Typisk parametere for en to dimensjonal diffusion-vektet pilot skanning er som følger (TR/TE = 2000/11,6 ms, tid = 4,3 min, Δ = 6 ms, ses = 1 ms, gjennomsnitt = 1, b = 1200 (1860 effektivt) s/mm 2, matrise = 64 x 64, synsfelt = 0,2 x 0,2 cm oppløsning = 31 μm).
    3. Samle en diffusion-vektet tidsserier for å angi stabilitet kjennetegn ved akutt skive utarbeidelse. Typisk parametere for en to-dimensjonale diffusjon vektet bilde er som følger (TR/TE = 2000/11,6 ms, tid = 1,5 t, Δ = 6 ms, ses = 1 ms, gjennomsnitt = 42, b = 1200 s/mm 2, matrise = 64 x 64, synsfelt = 0,2 x 0,2 cm, oppløsning = 31 μm). Merk: Karakteriserer stabilitet i et system vil variere fra beskrevet protokollen avhengig av faktorer som MR kontrasten ansatt (f.eks T1, T2, diffusjon, mottakelighet), fysisk forstyrrelsene studerte, og MR signalet endres per enhetstid som følge av sa forstyrrelsene.

Representative Results

Perfusate forberedelse

Etter vellykket ansettelse av i-fødte oksygenering enheten, vil gasser i den medfølgende carbogen nå 100% metning betingelsene i aCSF perfusate. Dette kan påvises av varierende oksygen konsentrasjonen av medfølgende gassen og måler endringen i oppløst oksygen innholdet i aCSF perfusate innenfor perfusjon kammeret bruker oksygen meter (figur 1)8. Ifølge Henriks lov er mengden oppløst gass i likevekt med en flytende prøve direkte proporsjonal med delvis presset av at gass forutsatt at temperaturen forblir konstant12. Bruke denne kunnskapen og presisjon gass standarder, er det mulig å kvantifisere mengden oppløst oksygen finnes i en aCSF prøve som beskrevet. Dette oppnås ved kalibrering oksygen måleren benytter mettet løsninger (direkte boblet 1t eller mer) av aCSF blir utsatt for gasser kjente komposisjon: en gass med høy oksygen konsentrasjon som carbogen (95% O2) og en annen med oksygen konsentrasjon som nitrogen (0% O2). Etterpå kan målinger tas av submerging spissen av oksygen elektroden til en prøve. Bekreftelse på at i-fødte oxygenator fungerer kan oppnås ved å måle avløpsvann fra perfusjonen godt. Prosent oppløst oksygen målt ved oksygen måleren skal samsvare med prosent konsentrasjonen av oksygen i levere gass. Hvis måleverdiene er lavere enn i levere gass, foreslår dette maskinvarefeil som kan føre til metabolsk insuffisiens i vev slice.

Eksempel utseende og virkemåte

Akutt skive forberedelser mottar perfusjon tilstrekkelig nok til å forsyne nødvendig metabolitter og bære bort metabolske avfallsstoffer snart nå en tilstand av relativ stabilitet. Fra det punktet, akutt skiver kan utsettes for eksterne forstyrrelsene og deres svar til disse endringene kan måles for vitenskapelig studie. For MR eksperimenter er sporing relevante signaler over tid en vanlig praksis å demonstrere relativ stabilitet akutt skive forberedelser13. Diffusjon-vektet signalet er spesielt følsomme for endringer i en vev vann mobilitet, innhold og distribusjon, som kan nytes ved bruk av denne kontrast mekanisme for å oppdage infarkter i iskemiske hjerneslag14,15. Planlegger normalisert diffusjon signalet over tid i akutt kortikale skiver vedlikeholdes under en rekke perfusjon forhold demonstrerer relativt stabilitet (2 ± 3% over 15.5 h) etter vev isolering oppnås (figur 5). Diffusjon signal stabilitet ble opprettholdt uansett perfusjon forhold (intermitterende eller kontinuerlig) eller MRI skanning lengde (kort [4 min] eller langt [1.5 h])8. Hvis skiver ikke vise signal stabilitet over tid, for eksempel skarpe diffusjon signal økningen observert i levende cortex som ikke fikk perfusjon, er ladet av suboptimal eksperimentelle forhold. Forstyrrelsene eksperimenter bør ikke forsøkes før bekreftelse av stabilt signal skive forberedelser.

I tillegg til signalet stabilitet, må riktig utvalg posisjonering bekreftes ved bildesamlingen. Selv om prøveposisjon kontrolleres under vev plassering på dissecting mikroskopet, endringer i prøveposisjon oppstå ved montering av perfusjon apparater, eller på grunn av uforsiktig håndtering av coil eller sonde før innsetting magneten. Bekreftelse av riktig hippocampus plassering kan oppnås ved å samle kort (2 min), pilot skanner med diffusjon kontrast (figur 6). Pyramideformet celle laget er mer følsomme for diffusion vekting enn de tilstøtende hippocampus laminae, vises denne strukturen som et mørkere band i diffusion-vektet bilder. Oppsett som ikke viser karakteristiske inneholder midtstilt prøver og vil trolig må gjentas.

Figure 1
Figur 1: Oppløst oksygen innholdet i aCSF perfusate som en funksjon av prosent O2 innhold i medfølgende gass. Carbogen blandinger som inneholder variabel konsentrasjoner av oksygen (95%, 60% og 19%) er ansatt som en forsyning gass. Prosent oppløst oksygen målinger tatt fra perfusjonen Vel deretter og sammenlignet med to kjente kontroller: en perfusate reservoaret frikirkelige direkte carbogen (95% O2), og et perfusate reservat utsatt for atmosfæriske forhold (23% O2 ). I hvert tilfelle, den prosent oksygenmetning på stedet vev perfusjon tilnærminger 100% av O2 konsentrasjonen i carbogen blandingen brukes. Feilfelt er lik standardavviket for utvalgsgjennomsnittene. Figur gjengitt med tillatelse fra den opprinnelige artikkel8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk tegning av i-fødte oxygenator og perfusjon kammeret. Dette diagrammet viser detaljert utformingselementer ansvarlig for funksjonen til disse kritiske enheter. Fersk perfusate som har blitt pumpet gjennom en boble felle inn oxygenator gjennom toppen av en 10 mm NMR rør. Dermed overganger i en svært gass permeabel silikon rør (blå segment) som er kveilet rundt en åpent, 5 mm NMR rør nestet innenfor. Carbogen naturgass levert gjennom toppen av 5mm rør inn i kammer gjennom åpent bunnen og passerer over sammenrullede silikon slangen før du avslutter oxygenator gjennom en luftehullet i 10 mm rør cap. Under denne eksponering, blir perfusate strømmer gjennom silikon røret mettet med kjemiske komponenter i den medfølgende gassblanding. Når du avslutter programmet i oxygenator, går perfusate direkte inn i perfusjon kammeret før returledningen fører til en innsamling reservoaret. Andre komponenter som er avgjørende for utformingen omfatter acetal støtte pinnen som lar oxygenator å stå vertikalt på toppen av den endrede RF microcoil, en silikon SKIVE (rød ring) som danner væsken-tett mellom den oxygenator perfusjon kammer og den microcoil vev godt og kabel-tie hakk kapasitet til plasseringen av en kabelstrips brukes til å danne denne reversibel seal. Dette tallet har blitt endret og gjengitt med tillatelse fra den opprinnelige artikkel8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: endringer i samlingen microcoil som grensesnittet til i-fødte oxygenator. To riller 3.0 x 1,5 mm (svart piler) ble skåret inn i siden av samlingen som bredden på en kabelstrips brukes til å forsegle perfusjon kammeret. En kanal (15 mm x 3 x 4 mm) kobler eikelundene over tilbake ansiktet av spolen. To nylon mellomrom plassert i sidene av kanal (røde piler) handling som en for kabel slips hodet som letter tetting prosedyren. Et hull (2 x 14 mm) i toppen av spiral montering (gul arrow) støtte koblinger til acetal pinne for å sikre oxygenator. Dette tallet har blitt endret og gjengitt med tillatelse fra den opprinnelige artikkel8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Foto montage detaljering relativ plassering og riktig montering av microcoil, oxygenator og sonde komponenter. Disse bildene har viktige maskinvarekomponenter i bar oxygenator og microperfusion enheten og illustrere hvordan den separate deler grensesnitt med hverandre. (A) oppbygning bildet viser den relative plasseringen av alle komponenter før tetting av vev godt eller montering av sonden kroppen. Care er tatt for å vise den relative plasseringen av deler nøyaktig; men har en del av perfusjon linjene blitt doblet tilbake i denne serien slik at alle komponenter passer i bilderammen. (1 = sonde hodet, 2 = microcoil montering, 3 = nylon vev oppbevaring ring, 4 = perfusjon Vel, 5 = kabelstrips, 6 = i-fødte oxygenator, 7 = gradient spoler, 8 = boble trap). (B) komponenter etter coil og oxygenator. I dette bildet, er nylon oppbevaring ringen plassert i den microcoil vev godt å sikre en prøve. Acetal støtte pinnen på undersiden av oxygenator er sikret i tilsvarende hullet på microcoil. Silikon pakningen på den åpne enden av perfusjonen også har vært plassert over vev brønnen, og en kabelstrips har blitt strammet rundt disse komponentene til å forsegle perfusjon kammeret. Til slutt, bunnen av microcoil har vært koblet til toppen av sonden hodet. (C) komponenter etter sonde montering. I det siste panelet, har overflødig lengden fra kabel-tie blitt beskåret flush med microcoil. Gradient coil stakken er så gled på plass ved å nøye fremme sylinderen mot sonden mens passerer overflødig perfusjon linjene, oxygenator og microcoil hul sentrum. Når graderingene er koblet til sonde hodet, er de holdt på plass av skruen sikre kragen på sonden over gjengede bunnen av graderingene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Diffusion signal stabilitet i superfused akutt kortikale skiver. (A) Normalized diffusjon signalet verdier i fire akutt skiver utsatt for ulike superfusion paradigmer tegnes over tid for en periode på opp til 21,5 t etter euthanasia. Skiver forbli innenfor ± 5% av sine første diffusjon signal måling i en periode på 15.5 h etter euthanasia uavhengig av om superfusion er kontinuerlig eller intermitterende og uavhengig av MR skanning lengden (1,5 t eller 4 min). Signalet stemmeinnspillinger fra formaldehyd-fast cortex fungere som positive kontrollen (n = 1) for stabilitet på grunn av statisk, uforanderlige natur av fast. Omvendt, diffusjon signalet måles i en live skive fraværende superfusion støtte (n = 1) fungerer som en kontroll for metabolske mangel. Eksperimentet parametre av ulike superfusion er som følger: kontinuerlig (superfusion alltid på, tid per skanning = 1,5 t), intermitterende (superfusion på for 10 min intervall mellom skanninger, tid per skanning = 1,5 t), lang intervall, lenge avsøker (superfusion på under søk, men for 10 min mellom skanninger, tid per skanning = 1,5 t), lang intervall, kort skanning (superfusion på for 1,5 t intervall mellom skanninger, tid per skanning = 4 min). (B) Analyzed viser datagruppe betyr fire live-slice superfusion eksperimenter fra panelet (A). Spredningen signal profilen fra det grupperte, superfused kortikale skiver utstillinger liten variasjon over tid (2 ± 3% over 15.5 h) mens kontrollen ikke-perfused (n = 1) har dramatisk signal ustabilitet tidlig i eksperimentet (15% av 6,5 h). Dette tallet har blitt endret og gjengitt med tillatelse fra den opprinnelige artikkel8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: bekreftelse av hippocampus skive plassering under pilot bildebehandling. Før du kjører en utvidet MR mikroskopi økten, riktig plassering av prøven er avgjørende for å sikre ressurser som skanner tid og dyre perfusate tilsetningsstoffer er ikke bortkastet. Pyramideformet celle laget i regionen CA1 i hippocampus kan visualiseres i raskere (4.3 min), lavere oppløsning (31 μm x 31 μm i-fly) pilot skanner å sikre vevet rundt er korrekt plassert i forhold til mikro-spolen. Skanneparametere som er felles for både bilder er som følger: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, ses = 1 ms, gjennomsnitt = 1. (A) b = 0 (227 effektiv) s/mm2. I denne foreløpige skanningen er stratum pyramidale bare synlig som en grå, diagonal bandet sentrert i spolen eksitasjon profil. (B) b = 1200 (1,860 effektiv) s/mm2. Ved høyere diffusjon vektlegging, interlamellar kontrast øker som pyramideformet cellen blir mørkere enn vev i de tilstøtende laminae (ovenfor: stratum oriens; nedenfor: stratum radiatum). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Gjeldende protokollen beskriver fremgangsmåter nødvendig for standard metabolske vedlikehold av akutt hjernen stykke forberedelser gjennomgår magnetisk resonans mikroskopi. Denne fremgangsmåten er den eneste metoden tilgjengelig som lar visualisering av levende pattedyr vev MR oppløsning kan løse celler. Mens perfusate forholdene beskrevet er skreddersydd spesifikt for sentrale nervesystemet-vev, protokollen er mye tilpasses alle slags levende vev forberedelse gjennom justeringer av perfusate og gass bestanddeler samt perfusjon strømningshastighet og temperatur.

De vanligste problemene som kan oppstå under beskrevet prosedyrene omfatter de knyttet til feil i metabolitten forsyning. Utfelling av kalsium salter kan forekomme inne aCSF under gass mangel som følge av feil i bikarbonat bufring systemet. Slike precipitates kan tette perfusjon linjene og resultere i alvorlige maskinvare skade. Hvis salt precipitates er observert i perfusate etter sonde montering, opphøre perfusjon flyt umiddelbart ved å deaktivere peristaltiske pumpen. Bekrefte tilstedeværelse av tilstrekkelig natriumbikarbonat (4,37 g/2 L) i perfusate, CO2 -nivåer (5.0%) i levere gass og carbogen gasstrømmen (1/16 L/min) til både reservoaret og oxygenator. Til slutt, Bekreft pH-verdier er stabilisert i fysiologiske området (7.3-7.4). I tilfelle at oksygen gass og pH nivåer ikke er fortsatt regulert riktig, bør gassutveksling membranen erstattes.

Hvis skiver ikke vise signal stabilitet i tiltenkte eksperimentelle tid-løpet, bekrefter du at de riktige kjemiske bestanddelene finnes i aCSF blandingen og at den riktige osmolality (300 mOsm) og pH (7.3-7.4) er opprettholdt. Kontroller også carbogen gass angis til perfusate reservoaret og oxygenator på 1/16 L/min. Hvis denne fremgangsmåten ikke retter perfusate forhold, anbefales utskifting av gassutveksling membranen. Hvis vev stabilitet ikke er oppnådd etter feilsøking perfusate forholdene, vurdere raffinement av kirurgiske protokollen med fokus på minimere tidsintervallet mellom vev harvest og perfusjon program.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), og National Science Foundation (samarbeidsavtale nr. DMR-1157490) gjennom funksjonen Avansert nasjonale høy magnetfelt Laboratory (NHMFL)-MRI og spektroskopi (AMRIS) på UF og delstaten Florida.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusate Preparation
Osmette A Precision Systems Inc. 5002 freezing point depression osmometer
Stir Plate Type 1000 Barnstead/Thermodyne SPA1025B magnetic stir plate with heating element
Accumet Basic pH Meter Fisher Scientific AB15 pH Meter
pH Probe Fisher Scientific 13-620-AP61 probe for pH measurement
Oxygen Meter Microelectrodes Inc. OM-4 meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates
Oxygen Electrode Microelectrodes Inc. MI-730 microprobe for the oxygen meter
Scale Denver Instrument Co. A-160 microscale for weighing chemical components
Name Company Catalog Number Comments
Slice Preparation
Lancer Vibratome Ted Pella Inc. Series 1000 vibratory tissue slicer
Disecting Microscope Carl Zeiss Inc. OPMI 1-FC tabletop, binocular disecting microscope
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion System
Masterflex L/S Cole-Parmer 7523-50 peristaltic micro perfusion pump
Oxygen Regulators x 2 Victor Medical VMG-05LY device for regulating gas flow
e-sized carbogen cylinders x 2 Airgas gas tanks containing carbogen gas
in-bore oxygenator developed in house device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate
Name Company Catalog Number Comments
MR Imaging Hardware
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) Bruker Biospin B6371/0001 four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil
Micro 5 probe body Bruker Biospin Z3395 microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer
Micro 5 gradient coils Bruker Biospin M81111 gradient coil stack used with micro 5 probe body
600 MHz Spectrometer Oxford Instruments superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation
Imaging Console Bruker Biospin Avance III support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation
Air Blower Bruker Biospin BCU-II, -80/60 Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore
Gradient Chiller Thermo Scientific Neslab Merlin M33 Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
  2. Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
  3. Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
  4. Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
  5. Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
  6. Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
  7. Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
  8. Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
  9. Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
  10. Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
  11. Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
  12. Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
  13. Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
  14. Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
  15. Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).

Tags

Bioteknologi problemet 128 MRI MRM akutt Organotypic cellekultur skive mikroskopi mobil bildebehandling Superfusion Hippocampus Oxygenator
Metabolsk støtte forbrukeravgift, levende hjernen vev under magnetisk resonans mikroskopi oppkjøpet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., … More

Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. J. Vis. Exp. (128), e56282, doi:10.3791/56282 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter