Summary
Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.
Abstract
Het therapeutisch doel voor perifere arteriële ziekte en ischemische hartziekten is te verhogen van de bloedtoevoer naar ischemische gebieden veroorzaakt door hemodynamische stenose. Vasculaire chirurgie is een haalbare optie in bepaalde gevallen, maar voor patiënten zonder indicaties voor chirurgie zoals progressie te rusten pijn, kritische ledemaat ischemie of belangrijke verstoringen te leven of te werken, zijn er weinig mogelijkheden voor het beperken van hun ziekte. Celtherapie via monocyt-verbeterd door het stimuleren van de vorming van de collaterale perfusie behoort tot een paar niet-invasieve opties.
Onze fractie onderzoekt arteriogenesis na monocyt transplantatie in muizen met behulp van het stuk ischemie model. Eerder, hebben we verbetering in stuk perfusie met behulp van tetanus-gestimuleerd syngeneic monocyt transplantatie aangetoond. Naast de effecten op de bijkomende vorming, kan tumorgroei worden beïnvloed door deze therapie ook. Om te onderzoeken van deze effecten, gebruiken we een muismodel kelder membraan-achtige matrix door het injecteren van de extracellulaire matrix van de Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoom in de flank van de muis, na occlusie van de femorale slagader.
Na de studie van kunstmatige tumor, gebruiken we intravital microscopie in vivo tumor-angiogenese en monocyt homing binnen collateral slagaders te studeren. Eerdere studies hebben het histopathologisch onderzoek van diermodellen, hetgeen inhoudt latere analyse post mortem artefacten dat beschreven. Onze aanpak visualiseert monocyt homing naar gebieden van zekerheidsstelling in real-time sequenties, is gemakkelijk uit te voeren, en onderzoekt het proces van arteriogenesis en tumor angiogenese in vivo.
Introduction
Cardiovasculaire ziekten, zoals hart-en vaatziekten of perifere arteriële ziekte, zijn de meest voorkomende doodsoorzaken wereldwijd1. Celtherapie is een veelbelovende aanpak voor de behandeling van hart-en vaatziekten, met name voor mensen die niet kunnen ondergaan chirurgische ingrepen. Er zijn verschillende benaderingen cellen of hun secreted stoffen wilt gebruiken als een therapeutisch instrument2,3, met het einddoel voor verbetering van de perfusie en onderhouden van de functie van ischemische en underperfused weefsel. Een poging om dit doel te bereiken is het verbeteren van de arteriogenesis, die de ontwikkeling van collateral slagaders verbetert. Monocyten zijn een belangrijke celtype zekerheidsstelling is gekoppeld. Onze fractie heeft zich gericht op het onderzoeken van de effecten van monocyten in gebieden van ontsteking4,5, met name met behulp van het stuk ischemie model voor het opwekken van ischemie en latere ontsteking6. Monocyten thuis naar gebieden van ontsteking en complexe systemische reacties, die tot de ontwikkeling van zekerheidsstelling7 leidenveroorzaken.
Met het gebruik van intravital microscopie, kunnen we bestuderen het gedrag van deze cellen in vivo en observeren de homing van ingespoten monocyten naar gebieden van ontsteking. Meeste voormalige studies beschrijven alleen post-mortem analyse, die in het bezit van nadelen met inbegrip van een inleiding histologische artefacten en grote aantallen dieren vereist voor preparaten. Met onze aanpak, we kunnen onderzoeken immunologische processen en bijkomende vorming via live beeldvorming op meerdere tijdstippen.
Naast de ontwikkeling van collateral slagaders in ischemische gebieden invloed monocyten ook op tumorgroei. Om te onderzoeken van deze processen, we een matrix van de kelder membraan-achtige gewonnen uit de Engelbreth-Holm-Swarm muis Sarcoom, een tumor die rijk is aan de extracellulaire matrix eiwitten8, injecteren en analyseren met intravital microscopie. Deze matrix wordt gebruikt voor screentest moleculen voor endothelial celvorming netwerk of anti-kanker therapieën door inhibitie van de angiogenic; in dit geval zullen wij beoordelen de tumor angiogenic potentieel van monocyten voor cel therapie9,10,11.
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een gemakkelijke en efficiënte manier om immunologische processen veroorzaakt door ischemie in een in vivo -model te bestuderen. We kunnen genereren een meer realistische testomgeving t.o.v. histologische workup van post-mortem spierweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
onze studie werd uitgevoerd met toestemming van de deelstaat Saksen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, overeenkomstig punt 8 van de Duitse wet voor de bescherming van dieren. (§ 8, lid 1 van de Duitse wet voor de bescherming van de dieren van 18.05.2016 - BGBI. Ik S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV van 13.08.2013).
Opmerking: voor de experimenten hier, 8 tot 12 week oud mannelijke BALB/c muizen werden gebruikt, en menselijke monocyten van bloeddonoren werden gebruikt voor de visualisatie van monocyten via intravital microscopie.
1. voorbereiding van de cel
Opmerking: voor de isolatie van monocyten, zie onze eerdere gepubliceerde video op JoVE voor instructies: " isolatie en intraveneuze injectie van lymfkliertest beenmerg afgeleid Monocyten " door Wagner et al. 4
Opmerking: wanneer werken met de cellen van alle stappen moet steriel om verontreiniging te voorkomen.
- Cel kleuring met 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat
- resuspendeer de cellen in serum gratis kweekmedium met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen/mL.
Opmerking: Alleen serum gratis medium maakt een efficiënte kleuring, aangezien de lipofiele kleurstof zou anders reeds worden vastgelegd door lipofiele componenten van het serum. - Toevoegen 5 µL van 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat in dimethylformamide tot 1 mL van de celsuspensie en resuspendeer zorgvuldig.
- Incubate de cell oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten
- Centrifugeer de cellen bij 37 ° C en 5 min. 500 x g
- Het verjagen van het supernatant en resuspendeer de cellen met 37 ° C warme foetale kalf serum aangevuld medium.
- Twee keer herhaalt u de stappen 1.1.4 en 1.1.5.
- Rekenen de cellen met de formule:
- resuspendeer de cellen met 150 µL steriele 0.9% NaCl-oplossing.
- Injecteren van de cellen in de staart ader.
- resuspendeer de cellen in serum gratis kweekmedium met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen/mL.
2. Verdoving
- Inademing verdoving
- verdampen Isofluraan met behulp van een vaporizer met behulp van een concentratie van 5% in een gesloten bak onder de motorkap van een chemisch veiligheidsrapport.
- De muis voorzichtig en zet het in de opslaglocatie.
- Het dier te behandelen door de huid van het achterste nek nadat het is gestopt met het verplaatsen.
- Intraperitoneaal verdoving
Opmerking: gebruik Isofluraan anesthesie, beschreven onder stap 2.1, uit te voeren een intraperitoneale injectie. Met de snelle herstel en korte-acteren verdovend effect van de narcose Isofluraan is het makkelijker te hanteren van de muis en injecteren intraperitoneaal anesthesie.- Gebruik van een oplossing van 2,4 mL Ketamine (10%), 0,8 mL Xylazine (2%) en 6.8 mL NaCl (0,9%) voor de intraperitoneale injectie.
- Wegen het dier alvorens verdoving.
Opmerking: De formule voor de verdoving is:
- gebruiken een insuline spuit van 1 mL met een 30 G naald te injecteren de oplossing in de linker onderbuik.
- Plaats van de muis in de kooi en verdovend effect wacht.
Opmerking: Het verdovend effect wordt doorgaans binnen 5 min als de injectie succesvol was. De juiste diepte van de narcose kan worden bepaald door het ontbreken van de deksel reflex of reactie op Teen snuifje, evenals een regelmatige, gecontroleerde snelheid van de ademhaling.
3. Implantatie van kelder membraan-achtige Matrix
Opmerking: deze methode wordt gebruikt door onze fractie om te studeren tumor angiogenese na monocyt injectie. Afhankelijk van de experimenten, kunnen factoren die de groei worden toegevoegd aan de matrix kelder membraan-achtige. Wij uitgevoerd de femorale slagader afbinding vóór het injecteren van de tumor in de flank van de muis. De matrix moet een temperatuur van 4 ° C voor de injectie. De matrix is bij deze temperatuur, vocht; de gel verhardt tot een solide op lichaamstemperatuur (37 ° C). Voor betere zichtbaarheid van de subcutane matrix plug, scheren van de huid van de muis op de injectieplaats.
Opmerking: optioneel: Voeg 100 ng fundamentele fibroblast groeifactor, 300 ng vasculaire endotheliale groeifactor en 26 I.E. heparine onder steriele omstandigheden naar de kelder membraan-achtige matrix.
- 1 mL van matrix in een 30 G insuline spuit en winkel op ijs laden tot gebruik.
- Leg het dier op de tafel en houd de huid van de muis naast de injectieplaats op de flank.
- 500 µL van de kelder membraan-achtige matrix subcutaan injecteren.
Opmerking: Om praktische redenen is het nodig te injecteren de kelder membraan-achtige matrix compact op één locatie op de verspreiding van het subcutane voorkomen. Het zal gemakkelijker worden om de kunstmatige tumor van het weefsel na het offeren van de muis aan het einde van het experiment verjagen.
4. Staart veneuze injectie
Opmerking: de praktijk van de staart veneuze injectie met NaCl oplossing op proefdieren voor experimenten. Als de monocyten kunnen niet voldoende worden geïnjecteerd in de ader van de staart, zal er geen systemische effect op de zekerheidsstelling. In dit protocol geïnjecteerd wij 2,5 miljoen monocyten. Probeer te injecteren van niet meer dan 5 µL/g lichaamsgewicht.
- Gebruiken de monocyt oplossing bereid onder stap met 2,5 miljoen monocyten 1.1.8.
- Gebruiken een 30 G naald en een spuit van 1 mL insuline voor de injectie.
- Zorgvuldig omgaan met de muis, het beperken van het dier in de afdekking en zorg ervoor dat de muis niet wordt aangetast en heeft voldoende ruimte om te ademen.
- De afdekking zetten met de verwarming pad, zodat de staart kunt contact opnemen met de plaat.
- Identificeren de aderen van de staart, die zich aan de laterale kant van de staart bevinden.
- Zet de staart 90 °, zodat de staart ader wordt weergegeven aan de bovenkant van de staart.
- De kant van de injectie te desinfecteren vóór het injecteren van de monocyten.
- Proberen te injecteren de monocyt-oplossing in een platte hoek met de schuine kant van de naald geconfronteerd met omhoog
Opmerking: Stop de injectie als een blaar wordt weergegeven, zoals dit een teken van een mislukte injectie is. De procedure opnieuw proberen meer proximally. - Stoppen met bloeden op de injectieplaats door zachte druk uit te oefenen op de staart voor ongeveer 60s.
- Observeren het dier gedurende 30 minuten om te controleren voor systemische bijwerkingen en plaats van de muis in de kooi, nadat het dier is volledig hersteld.
5. Microscopie van intravital
- voorbereiding
- plaats van de narcose muis op de verwarming pad (37 ° C) te houden een constante temperatuur en het vaststellen van de poten in plaats met plakband.
- Desinfecteren van de huid op de site van het been of de flank die wordt gebruikt voor microscopie.
- De regio van belang voor betere behandeling en om te voorkomen dat interferentie met haar scheren.
- Accijnzen de huid met een steriel scalpel en fijne pincet in een vierkante ruimte van 0,5 x 0,5 cm.
Opmerking: Het is belangrijk de regio van belang om vochtig te houden; anders, zal de kwaliteit van beelden en weefsel worden aangetast. NaCl oplossing kan worden gebruikt om het gebied bevochtigen. - Plaats van de etappe tussen twee verstelbare stempels en de positie van een glas cover op de top van de stempels.
- Zorgen voor het weefsel NAT en in aanraking komt met het glas.
- Inject 50 µL rhodamine dextran retrobulbaire in het veneuze systeem voor betere zichtbaarheid van de vaartuigen.
- Start microscopie en pas de positie van het been desgewenst.
- Intravital microscopie instellingen
- inschakelen de Microscoop, computer, elektronische interfaces en lasers.
- Zet de verwarming eenheid van incubatie kamer en/of verwarming etappe (plaat/muismat), en de temperatuur ingesteld op 37 ° C.
- Start de acquisitie software. Als de Microscoop is uitgerust met een resonante scanner, selecteert u deze snel scanmodus.
- Wacht totdat de temperatuur een constant niveau (35-37 ° C bereikt)
Opmerking: Een stabiele temperatuur is belangrijk voor: (a) de muis, die onder verdoving kan geen controle over haar lichaamstemperatuur, en (b) te voorkomen of op zijn minst minimaliseren focal drift. Dit kan duren 1 uur tot enkele uren, afhankelijk van de omringende omstandigheden (bijvoorbeeld airconditioningsysteem en het aantal warmtebronnen in de kamer, met inbegrip van mensen). Als immersie doelstellingen worden gebruikt, is de contact zone tussen de lens en dekking glas (of weefsel) een typische bron van instabiliteit. Verwarming van de lens met een objectieve kachel kan helpen; u kunt ook een microscoop met een autofocussysteem is een aanrader. - Selecteer een vergroting lens met een hoog cijfer diafragma dat voldoet aan de eisen van de resolutie van het experiment (zie opmerking aan het einde van dit gedeelte).
- Optimaliseer de instellingen van de microscoop met betrekking tot winst, montages van het kanaal, snelheid van de scan, pixelresolutie, diepte volume, stap-grootte en gemiddeld alvorens de proefdieren in het werkgebied.
- Scan bidirectionally om Acquisitietijd.
- Plaats van de narcose muis op de voorverwarmde Microscoop fase nadat de Microscoop heeft bereikt stabiele omstandigheden en de instellingen zijn getest met behulp van een dummy.
- Brengen de regio van belang binnen de kelder membraan-achtige matrix in beeld met behulp van fel licht verlichting en besteden de inspectie kort de haarvaten ultraviolet licht met voldoende filterinstellingen voor de toegepaste fluorophores.
- Overschakelen naar de scanmodus; start het scannen op lage resolutie 256 x 256 modus en verbeteren winst en laser van kracht totdat een signaal is waargenomen op de monitor.
- Focus op de structuur van belang. Zoom in totdat alle gegevens zichtbaar zijn.
- Definiëren " start " en " einde " posities in de axiale richting.
- Scannen stopzetten.
- Definiëren stap grootte (b.v., 0,5 µm) en aantal focal vliegtuigen (b.v. 10-20).
- Schakelaar naar de laatste pixelresolutie (512 x 512 of 1024 x 1024) afhankelijk van de snelheid van de bewegende subcellular structuren of cellen en selecteer de scan snelheid (scan/bClk frequentie) dat het beste aan de bewegingen past. Bidirectionele scannen wordt aanbevolen de verwerving van stapels vastmaken.
Opmerking: Selecteer de hoogste scansnelheid van het scannen die voldoende beeldkwaliteit geeft. Typische punt-scanners beschikken over snelheden tussen 400 Hz en 1.4 kHz. Resonant-scanners beschikken over een extra 8 of 12 kHz. Door het verminderen van het aantal lijnen in de y-richting, de scanfrequentie kan verder worden verhoogd (typische waarden zijn 512 x 512, 512 x 256 of 512 x 200 pixel voornemen). Afhankelijk van de signaal-ruisverhouding, kan men proberen de beeldkwaliteit verbeteren door toevoeging van regel gemiddeld tussen 2 en 4. Typisch, een instelling van 512 x 200 met geen gemiddeld resulteert in een overname/tijdsbestek van 18 ms in de bidirectionele modus met een resonante scanner van 8 KHz; met 512 x 200 en 4 x gemiddeld, het vertraagt tot 56 ms per frame.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital microscopie voor de behandeling van tumor en collateral vaartuig groei veroorzaakt door monocyten kan helpen onthullen nieuwe aspecten in de moleculaire mechanismen van tumor angiogenese en arteriogenesis. De cellen moeten worden voorbereid en geïnjecteerd zorgvuldig met behulp van de stappen van het protocol. Verschillen kunnen leiden tot variaties tussen één experimenten. De monocyten moeten worden geïnjecteerd in het veneuze systeem (Figuur 1) te handhaven van systemische effecten en emboli, die optreden kunnen indien de injectie wordt uitgevoerd in de arteriële systeem voorkomen.
Als kelder membraan-achtige matrix wordt gebruikt, injecteren langzaam om te voorkomen dat verstrooiing zal helpen met plug explantatie voor verdere histopathologisch onderzoek (Figuur 2, Figuur 3). Na het offeren van de muis, zal de stekker van de kelder membraan-achtige matrix worden explanted vanaf de flank van de muis. We kunnen binnen de kelder membraan-achtige matrix stekker, vascularisatie meten door het tellen van de haarvaten binnen verschillende experimentele instellingen (Figuur 4, Figuur 5).
Een andere voorwaarde voor succesvolle experimenten is de instelling van de Microscoop, die afhangt van de software, hardware, en dierlijke voorbereiding (Figuur 6). Als subcellular structuren (< 2 µm) moeten worden geïdentificeerd, een rechtop Microscoop met 2-foton-excitatie en water onderdompeling doelstellingen (20 X of 25 X, cijfer diafragma 1.0) met lange afstand (> 2 mm) zijn aan te raden. Aangezien water onderdompeling doelstellingen met hoge cijfer diafragma uiterst gevoelig voor brekingsindex-variaties zijn, moeten het optimale beeldresolutie en de helderheid worden aangepast door het bewegen van de kraag van een correctie op het doel. Helaas, aanpassing met de hand is vrij moeilijk te wijten aan de beperkte ruimte. Daarom zijn dure doelstellingen met een gemotoriseerde kraag correctie aangeboden door Microscoop fabrikanten.
Als cellulaire resolutie (5-10 µm) is voldoende, een 10 x droge lens met een cijfer diafragma 0.4 of hoger en een lange afstand (> 2 mm) wordt aanbevolen. In dit geval kan een rechte of een omgekeerde Microscoop standaard worden geselecteerd. Cel beeldbewerking met een 10 X droge lens (cijfer diafragma 0.4) Live bij hogere zoom factoren (> 3) is veel eenvoudiger en goedkoper omdat klassieke confocale laser scanning microscopie (d.w.z., 1 foton excitatie) kan worden gebruikt voor het verkrijgen van afbeeldingsstapels met voldoende resolutie. Als veel tijd nodig voor de verwerving van de beelden is, vermindert de hoeveelheid rhodamine dextran binnen het schip. Voor een betere zichtbaarheid van de schepen, de injectie van de fluorophore moet worden herhaald (Figuur 7).
Het is het meest effectief om te proeven van verschillende aanpassingen en beslist de best mogelijke beeldkwaliteit. Het gebruik van positieve sondes voor cellen of kelder membraan-achtige matrix (zonder transplantatie) kan helpen met het verkrijgen van optimale instellingen. We kunnen detecteren gelabelde monocyten via intravital microcopy binnen de bloed stroom en spier weefsel (Figuur 8, Figuur 9). Histopathologisch onderzoek van weefselsecties controleert onze bevindingen (Figuur 10).
Figuur 1 : Injectie van 2,5 miljoen monocyten in de staart ader. Aderen bevinden zich aan de laterale kant van de staart, met slagaders aan de dorsale en ventrale zijde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Injectie van kelder membraan-achtige matrix. Behandelen van de huid van de muis en de kelder membraan-achtige matrix in de flank te injecteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Transplanteren matrix stekker uit de flank van de muis (zie punt 3.5). Opgenomen vaartuigen vijf dagen na de monocyt transplantatie via de ader van de staart. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Vergelijking van vascularisatie binnen de kelder membraan-achtige matrix ( 
+ SD, n = 3 in elke groep). Schepen in de kelder membraan-achtige matrix stekker, met geen groeifactor toegevoegd (rode balk), in vergelijking met vaartuigen van kelder membraan-achtige matrix plug met groeifactor toegevoegd. De suppletie van kelder membraan-achtige matrix met groeifactor leidt tot verhoogde vaartuig groei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Schepen binnen de stekker van de kelder membraan-achtige matrix. Visualisatie van bloed stromen binnen schepen (pijlen) en monocyt homing (groen) binnen de kelder membraan-achtige matrix stekker (rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Muis voorbereid Beeldacquisitie. De poten vast met plakband en een glas cover is geplaatst op de top van twee verstelbare stempels. De regio van belang was weggesneden met een scalpel. NaCl wordt gebruikt voor het bevochtigen van het gebied, zodat de kwaliteit van beelden en weefsel zal niet worden aangetast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Zichtbaarheid van vaartuigen daalde. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat gekleurd monocyten (pijlen) binnen kelder membraan-achtige matrix naast een vaartuig (Langsdoorsnede, *). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Monocyt gespoeld in schip. In vivo visualisatie van 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat gekleurd en getransplanteerde monocyt (groen, pijl) binnen de collaterale slagader (*). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Intravital microscopie. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat gekleurd monocyten (pijlen) binnen collateral vaartuigen met typische kurkentrekker vorming (*) gekleurd met rhodamine dextran. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10 : Immunohistological-verkleuring van de dij spieren. Schepen (rood: Alfa glad spierweefsel actine, *), macrofagen (groene: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat, pijlen), celkern (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode werpt licht op de ontwikkeling van collateral slagaders, het gedrag van monocyten in deze vaartuigen, en het proces van arteriogenesis. De stappen voor de toepassing van dit protocol zijn gemakkelijk te leren en kan worden gebruikt op andere terreinen van de wetenschap. Ondanks deze voordelen zijn er sommige nadelen. Bijvoorbeeld, is microscopische apparatuur vereist voor het uitvoeren van de beschreven technieken. Verkrijgen van apparatuur voor een experiment is onhoudbaar, dus is het belangrijk om samen te werken met andere instellingen voor het delen van de apparaten.
Er zijn andere problemen in verband met dit protocol dat kan worden vermeden met praktijk. In het begin, kunnen er problemen met de positionering van de muis onder de Microscoop en beeldkwaliteit kan lijden onder deze omstandigheden. Een ander belangrijk punt is de staart veneuze injectie. Monocyten kunnen alleen worden gezien in de aderen als goed geïnjecteerd. Daarom is het raadzaam om de praktijk van de injectie voor de positionering van de muis.
Monocyt isolatie is ook cruciaal. Monocyten kunnen worden geïsoleerd uit verschillende soorten met behulp van verschillende protocollen, die vaak tot verschillende resultaten en cel opbrengsten12,13,14 leiden. Het is nodig om te werken onder steriele omstandigheden om verontreiniging te voorkomen. Celschade moet worden voorkomen door zorgvuldig pipetteren en onderhouden van constante temperaturen.
Ondanks deze nadelen is deze methode praktisch en gemakkelijk uit te voeren, toelatend gebruikers om te werpen licht op tumor angiogenese en de fundamentele mechanismen achter perifere arteriële ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de ELSE-Kröner-Stiftung en de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Duits Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, samenwerkend onderzoekscentrum). Speciale dank aan Hans-Holger Gärtner Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke Universiteit Magdeburg, Magdeburg, Duitsland, voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
