Deteção do potencial de membrana mitocôndria para estudar CLIC4 HN4 induzida em Knockdown celular apoptose em Vitro

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para a aplicação de rodamina 123 para identificar o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e estudar CLIC4 induzida por nocaute HN4 celular apoptose em vitro. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, registou-se a mudança em tempo real do MMP.

Resumo

Depleção do potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) é considerada o evento mais antigo em cascata apoptótica. Mesmo ocorre antes do nucleares apoptotic características, incluindo a condensação da cromatina e quebra de DNA. Uma vez que os colapsos MMP, apoptose celular iniciará irreversivelmente. Uma série de corantes catiônicos lipofílicos pode passar através da membrana celular e agregar dentro da matrix da mitocôndria e servir como marcador de fluorescência para avaliar mudança MMP. Como um dos seis membros da família canal intracelular (CLIC), o Cl^– CLIC4 participa no processo de apoptose celular, principalmente através da via mitocondrial. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir MMP através de monitoramento a flutuação de fluorescência de rodamina 123 (Rh123), através da qual estudamos a apoptose induzida por nocaute de CLIC4. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal varredura e microscópio de fluorescência normal em detalhe e também compará-lo com outros métodos.

Introdução

Rh123 é um corante catiônico de fluorescência, que serve como um indicador para o potencial transmembrana. Rh123 é capaz de penetrar a membrana celular e inserindo a matriz mitocondrial, dependendo da diferença de potencial dentro e fora da membrana¹. Apoptose leva a danos da integridade da membrana mitocondrial. O poro de transição de permeabilidade de mitocôndria (MPTP) abrirá e ao colapso do MMP, que por sua vez, resulta na liberação de Rh123 para fora das mitocôndrias. Finalmente, sinal mais forte fluorescência verde será detectado sob microscópio de fluorescência. Está bem documentado que a depleção do MMP e permeabilidade da membrana elev....

Protocolo

1. cultura e transfecção de células

1. Cultura celular
   Nota: O HN4, uma linha de celular HNSCC, derivou-se de pacientes com HNSCC¹⁴.
   1. Células de cultura HN4 em de Dulbecco modificado Eagle suplementado (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL). Incube as células a 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Transfecção celular
   1. Um dia antes de transfeccao, placa 5 x 10⁵ células em 2 mL/bem do meio de cultura sem antibióticos em placas 6-boas.
   2. Dilua 100 pmol CLIC4 siRNA ....

Resultados

No presente estudo, aplicou-se Rh123 para detectar o MMP. Inicialmente, HN4 as células foram cultivadas por fluorescência seguinte experiências de coloração. Pinça foram usada para colocar lamelas circulares no fundo do poço-6 placas (Figura 1A). As lamelas foram revestidas com polylysine por 5 min... e então o polylysine removido através da pipeta (Figura 1B). Então as células HN4 foram trypsini.......

Discussão

Está bem documentado que o Cl⁻ canais são essenciais na manutenção da hemostasia do ambiente interno e desempenham um papel importante na proliferação celular e apoptose^15,16. Portanto, compreender a relação entre a intervenção orientada para o canal de íon e apoptose é de grande necessidade e importância de encontrar uma melhor abordagem terapêutica para vários cânceres¹⁷. As mitocôndrias mantenham estado biológico normal de um.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células HNSCC	ATCC	CRL-3241
Polilisina	Thermo Fisher Scientific	P4981
SiRNA específico para CLIC4	Biomics	NM_013943	(números de acesso, NM_013943; correspondendo à sequência de cDNA 5-GCTGAAGGAGGAGGAAAGA-3) e siRNA embaralhado (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) foram projetados e obtidos da Biomics Company
Reagente de Transfecção Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I Medium de Soro Reduzido, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Rodamina 123, FluoroPure grede	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco' meio Eagle modificado (DMEM, 4,5 g / L de glicose)	Gibco	11965-084
Soro Bovino Fetal, Qualificado, Origem da Austrália	Gibco	10099141
Solução de Tripsina-EDTA	Beyotime	C0201
Antibiótico-Antimicótico, 100X	Gibco	15240062
Microscopia Confocal de Varredura a Laser	Leica Microsystems GmbH	LEICA. SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Microscópio invertido	Nikon	N/A
Metaflour, V7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	N/A
Leica application suite, v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	N/A
Microsoft Office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat Software	N/A
	Thermo Fisher Scientific	A7816

humano Câmara de Células Attofluor